Pcr扩增基因核转悬浮动物细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及一种生物【技术领域】的PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法，包括如下步骤：以重组目的基因的表达质粒为模板，设计PCR引物；其中，正向PCR引物位于质粒启动子（目的基因对应启动子）上游，反向PCR引物位于质粒转录终止子（目的基因对应终止子）下游；以重组目的基因的表达质粒为PCR模板，通过所设计的PCR引物进行PCR扩增；回收PCR产物；选取PCR产物，按照Lonza公司核转试剂盒标准操作程序进行细胞转染。与核转质粒相比，核转PaGene能够显著降低悬浮动物细胞的死亡率；PaGene在保证核转悬浮动物细胞较低死亡率的情况下，转染效率亦没有显著降低或降低很少。
【专利说明】PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法。
【背景技术】
[0002]核酸转染细胞(非编码小RNA、信使RNA、或者质粒)被广泛应用于功能基因组学研究、疫苗研究、转录调控研究、干细胞研究、炎症性疾病治疗研究等方面；用于细胞系或者原代细胞转染的方法可以分为两类:一类是基于病毒的转染方法；另一类是不基于病毒的转染方法。对于不基于病毒的转染方法，电转(Electrophoration)是其中最重要的方法之一(特别是对于悬浮细胞)，电转的基本原理是通过电击造成细胞质膜短暂的通透，以便于核酸能够进入细胞。作为电转的升级版，核转(Nucleofection)综合了电击以及细胞特异的溶液，能够保证细胞较理想的转染效率以及细胞活力，特别是对于那些很难转染的细胞。
[0003]Kasum1-1细胞系是来自于一位患M2型急性髓系白血病(Acute myeloid leukemiaM2)的日本男孩的外周血，该细胞系在白血病发病机理的研究中被广泛使用。然而，研究人员在Kasum1-1细胞的常规核转实践中发现，用质粒核转总是会诱导更加严重的细胞死亡以及更低的转染效率，质粒核转所导致的高死亡率有可能影响所转染目的基因生物作用的客观准确解读，现有技术中亟需一种可靠的核转Kasum1-1细胞的方法，以便进行涉及Kasum1-1核转的相关功能实验。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法。本发明的方法保证了目的基因核转悬浮动物细胞后，能够较客观的观察感兴趣基因本身对悬浮动物细胞所造成的生物影响，排除了核转质粒后所造成的非特异细胞死亡对基因真实生物作用的掩盖。
[0005]本发明涉及一种PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法，包括如下步骤:
[0006]步骤一，以重组目的基因的表达质粒为模板，设计PCR引物；其中，正向PCR引物位于质粒启动子上游,反向PCR引物位于质粒转录终止子下游；
[0007]步骤二，以重组目的基因的表达质粒为PCR模板，通过所设计的PCR引物进行PCR扩增；PCR扩增所用的DNA聚合酶为具有校正功能的高保真DNA聚合酶；
[0008]步骤三，回收PCR产物，即PaGene，并定量及测定A260/A280、A260/A230比值；A260/A280和A260/A230比值需> 1.8，以保证PaGene具有较高的完整性和纯度；
[0009]步骤四，选取PaGene，按照Lonza公司核转试剂盒标准操作程序进行细胞转染，所用PaGene用与对应质粒相同摩尔数的剂量进行核转，进而完成PaGene核转悬浮动物细胞。
[0010]优选地，所 述目的基因可为任何编码蛋白的基因。
[0011]优选地，所述重组目的基因的表达质粒可为非诱导型表达蛋白的质粒。
[0012]优选地，所述方法包括如下步骤:[0013]悬浮动物细胞在含有适当比例胎牛血清的悬浮动物细胞培养基中培养，培养环境为37°C、5%C02 ;大肠杆菌(E.coli)工具菌株被用于质粒的保存和扩增；用相应试剂盒抽提质粒；所抽提质粒被用于目的蛋白编码基因的扩增；所扩增基因被命名为PaGene ；
[0014]所述基因用具有校正功能的DNA聚合酶和其对应PCR引物进行扩增；正向引物位于基因启动子上游，反向引物位于基因转录终止子下游；正反向引物的位置保证目的蛋白编码基因在细胞内能够成功转录和翻译；PaGene用相应试剂盒纯化,进而用于核转悬浮动物细胞；
[0015]DNA浓度以及A260/A280和A260/A230，比值皆≥1.8，用相应分光光度计测定，以反应对应核酸的完整性和纯度；PaGene亦通过琼脂糖凝胶电泳进行质控；
[0016]取悬浮动物细胞被用于核转；
[0017]核转所用溶液及程序采用Lonza公司就对应细胞系的说明书进行或者采用常规核转条件；核转后，细胞被转移至37°C预热的悬浮动物细胞完全培养基中继续培养；
[0018]进而完成PCR扩增基因核转悬浮动物细胞；与核转质粒相比，核转PaGene能够显著降低悬浮动物细胞的死亡率；PaGene在保证核转悬浮动物细胞较低死亡率的情况下，转染效率没有显著降低或降低很少。
[0019]优选地，所述悬浮动物细胞为Kasum1-1细胞、NB4细胞或THP-1细胞。
[0020]优选地，所述PCR扩增基因核转Kasum1-1细胞的方法包括如下步骤:
[0021]步骤一，以重组目的基因的表达质粒为模板，设计PCR引物；其中，正向PCR引物位于质粒启动 子上游,反向PCR引物位于质粒转录终止子下游；
[0022]步骤二，以重组目的基因的表达质粒为PCR模板，通过所设计的PCR引物进行PCR扩增；PCR扩增所用的DNA聚合酶为具有校正功能的高保真DNA聚合酶；
[0023]步骤三，回收PCR产物，即PaGene，并定量及测定A260/A280、A260/A230比值；A260/A280和A260/A230比值需> 1.8，以保证PaGene具有较高的完整性和纯度；
[0024]步骤四，选取PaGene，按照Lonza公司核转试剂盒标准操作程序进行细胞转染，核转程序为P-19,核转所用溶液为solution V,即kit V,所用PaGene用与对应质粒相同摩尔数的剂量进行核转，进而完成PaGene核转Kasum1-1细胞。
[0025]优选地，步骤一中，所述目的基因为EGFP基因或萤火虫荧光素酶基因。
[0026]优选地，步骤一中，所述重组目的基因的表达质粒为BD Biosciences的质粒pEGFP-N2 或 Promega 的质粒 pGL3_Control。
[0027]优选地,步骤二中，所述DNA聚合酶为Toyobo公司的KOD Plus ；
[0028]所述引物具体为=PaEGFP-正向的序列如SEQ ID N0.1所示，PaEGFP-反向的序列如SEQ ID N0.2所示；PaLuc-正向的序列如SEQ ID N0.3所示，PaLuc-反向的序列如SEQID N0.4 所示。
[0029]优选地，其特征在于，步骤四中，所用PaGene剂量以2 μ g对应质粒所对应等摩尔数的剂量进行核转。
[0030]优选地，所述方法包括如下步骤:
[0031]Kasum1-1细胞在含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，培养环境为37°C、5%C02 ;大肠杆菌(Ε.coli)菌株TOPlO被用于质粒的保存和扩增；用NucleoBond Xtra Midi试剂盒抽提质粒 pEGFP_N2 和 pGL3_Control ;用 AxyPrep? Plasmid Miniprep 试剂盒准备空E.coli TOPlO的洗脱液；所抽提质粒被用于EGFP和Iuciferase的扩增；所扩增基因分别被命名为PaEGFP和PaLuc ；
[0032]所述两个基因用具有校正功能的DNA聚合酶KOD Plus和其对应PCR引物进行扩增；正向引物位于基因启动子上游，EGFP在pEGFP-N2的启动子为Paw IE ；luciferase在pGL3-Control的启动子为SV40启动子；反向引物位于转录终止子下游，EGFP在pEGFP_N2的终止子为早期poly (A)信号；luciferase在pGL3_Control的终止子为SV40晚期poly (A)信号；正反向引物的位置保证PaEGFP和PaLuc能够在细胞内成功转录和翻译；所述引物具体为:PaEGFP-正向的序列如SEQ ID N0.1所示，PaEGFP-反向的序列如SEQ ID N0.2所示；PaLuc-正向的序列如SEQ ID N0.3所示，PaLuc-反向的序列如SEQ ID N0.4所示；
[0033]PaGene用AxyPrep? PCR Clean-up试剂盒纯化,进而用于核转Kasum1-Ι细胞；
[0034]DNA 浓度以及 A260/A280 和 A260/A230，比值皆≥ 1.8，用 Nano Drop NDlOOO 分光光度计测定，以反应对应核酸的完整性和纯度；质粒和PaGene亦通过琼脂糖凝胶电泳进行质控；
[0035]Kasum1-1细胞与10 μ M等体积的eFluor670混合，并在37°C避光孵育IOmin ;之后加入4-5倍体积预冷的RPMI1640完全培养基，所述RPMI1640完全培养基为RPMI1640+15%胎牛血清，并且冰浴5min以终止标记，之后用RPMI1640完全培养基洗涤3遍，所标记细胞被用于后续核转；
[0036]2X IO6Kasum1-1细胞被用于核转，所述细胞预先标记或没有标记细胞增殖染料eFluor670 ；
[0037]核转所用溶液为solution V，即kit V，程序为P-19 ;核转后，细胞被转移至37°C预热的RPMI1640完全培养基中继续培养；
[0038]对于PaEGFP和pEGFP_N2，每次核转的剂量分别为680ng PaEGFP和2000ngPEGFP-N2，具有相同摩尔数；SE.coli洗脱液亦被用于核转，以便检测样品中残留的内毒素是否对细胞有潜在的致死效果；对于PaLuc和pGL3-Control，核转剂量分别为830ngPaLuc和2000ng pGL3_Control,相同摩尔数；与PaGene相同质量的对应质粒亦被用于核转，具体为 PEGFP-N2 680ng, pGL3_Control830ng ；
[0039]进而完成PCR扩增基因核转Kasum1-1细胞；与核转质粒相比,核转PaGene能够显著降低Kasum1-1细胞的死亡率,核转PaGene的Kasum1-1细胞能够较好增殖,PaGene在保证核转Kasum1-1细胞较低死亡率的情况下，转染效率没有显著降低或降低很少。
[0040]本发明具有如下的有益效果:(I)与核转质粒相比，核转PaGene能够显著降低悬浮动物细胞的死亡率；(2) PaGene在保证核转悬浮动物细胞较低死亡率的情况下，转染效率亦没有显著降低或降低很少；本发明的方法保证了目的基因核转悬浮动物细胞后，能够较客观的观察感兴趣基因本身对悬浮动物细胞所造成的生物影响，排除了核转质粒后所造成的非特异细胞死亡对基因真实生物作用的掩盖。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0042]图1为以质粒为模板进行基因PCR扩增以及实验设计示意图；[0043]图2为PaGene及其对应表达质粒的琼脂糖凝胶电泳结果；
[0044]图3为核转Kasum1-1细胞的细胞活力和GFP+比例结果；
[0045]图4为核转Kasum1-1细胞的显微镜观察结果；
[0046]图5为通过其它方法对核转Kasum1-1细胞增殖能力的检测结果；
[0047]图6为核转后Kasum1-1细胞表达外源蛋白的定量结果；
[0048]图7为核转后NB4和THP-1细胞的细胞活力和GFP+比例结果。
【具体实施方式】
[0049]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如萨姆布鲁克等分子克隆:实验手册第三版(科学出版社，2002)中所述的条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0050]实施例1、PCR扩增基因(PaGene)核转Kasum1-1细胞
[0051] 申请人:发现表达质粒核转Kasum1-1细胞后，导致Kasum1-1细胞大量死亡； 申请人:经过大量的实验，意外地发现，采用如下方法处理后能够显著减少核转Kasum1-1细胞的死亡率、以及保持较理 想的细胞转染效率和较高的细胞增殖，以便为后续涉及Kasum1-1细胞核转的相关功能实验提供可行的核转方法；所述方法以表达质粒为模板，通过PCR扩增目的基因(PaGene);所扩增PaGene包含基因启动子、蛋白编码区、以及转录终止子；保证PaGene能够在细胞内成功的转录和翻译,之后用PaGene核转Kasum1-1细胞。
[0052]本实施例涉及一种PaGene核转Kasum1-1细胞的方法,主要以增强型绿色突光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)为工具报告基因，在 Kasum1-1 细胞中进行的核转实验，具体内容如下，以下实施例中涉及到的相关试剂及材料均可以通过公开的市售渠道获得。
[0053]细胞系和大肠杆菌菌株
[0054]Kasum1-1细胞(能够通过市售的公开渠道获得)在含有15%胎牛血清(Gibco)的RPMI1640培养基中培养(Gibco)，培养环境为37°C、5%C02。大肠杆菌(Escherochia coli,
E.coli)菌株 T0P10 (Invitrogen-Life Technologies)被用于质粒的保存和扩增。
[0055]质粒和PCR 扩增基因(PCR amplified gene, PaGene)的准备
[0056]用NucleoBond Xtra Midi 试剂盒(Macherey-Nagel)抽提质粒 pEGFP_N2 (BDBiosciences)和 pGL3_Control (Promega)0
[0057]用AxyPrep? Plasmid Miniprep 试剂盒(Axygen)准备空 Ε.coli T0P10 的洗脱液(按照标准质粒抽提步骤。该空E.coli洗脱液中可能含有内毒素，用以鉴定残存的内毒素是否在Kasum1-1细胞核转过程中对细胞有致死作用)。所抽提质粒被用于EGFP和萤火虫荧光素酶基因(Firefly luciferase)的扩增。所扩增基因分别被命名为PaEGFP (PCR ampIiedEGFP)和 PaLuc (PCR amplified luciferase)。
[0058]具体来讲，这两个基因用具有校正功能的DNA聚合酶KOD Plus(Toyobo)和其对应PCR引物(表1，引物合成于英潍捷基(上海)贸易有限公司)进行扩增。正向引物位于基因启动子上游(EGFP在pEGFP-N2的启动子为Pcmv ie ;luciferase在pGL3_Control的启动子为SV40启动子)；反向引物位于转录终止子下游(EGFP在pEGFP-N2的终止子为早期poly (A)信号；luciferase在pGL3_Control的终止子为SV40晚期poly (A)信号)(图1)。
[0059]图1，以质粒为模板进行基因PCR扩增以及实验设计示意图。IH向引物位于基因启动子上游；反向引物位于基因终止子下游。用具有校IH功能的DNA聚合酶扩增目的基因。PaGene进一步被纯化，并被用于Kasum1-1细胞核转(同时亦包括其对应表达质粒的核转比较)。表达质粒的核转剂暈为两个:一个剂暈与PaGene等质暈；另一个剂暈与PaGene等摩尔数。
[0060]正反向引物的位置保证PaEGFP和PaLuc能够在细胞内成功转录和翻译。PaGene用AxyPrep? PCR Clean-up试剂盒(Axygen)纯化,进而用于核转Kasum1-Ι细胞。
[0061]DNA 浓度以及 A260/A280 和 A260/A230 (比值皆大于 1.8)用 Nano Drop NDlOOO 分光光度计(Thermo Scientific)测定，以反应对应核酸的完整性和纯度。
[0062]质粒和PaGene亦通过琼脂糖凝胶电泳进行质控(图2)。图2, PaGenes及其对应表汰质粒的掠脂糖凝胶电泳。(A),dEGFP-N2和PaEGFP的凝胶电泳。(B),DGL3_Control和PaLuc的凝胶电泳。DNA分子量参照DL2000和DL15, 000购自于Takara,对应备带分子量大小(碱基对，basepair,简称bp)标记于电$永图左侦!I。
[0063]表1 PaEGFP和PaLuc PCR扩增所用的引物序列
[0064]
【权利要求】
1.一种PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一，以重组目的基因的表达质粒为模板，设计PCR引物；其中，正向PCR引物位于质粒启动子上游，反向PCR引物位于质粒转录终止子下游； 步骤二，以重组目的基因的表达质粒为PCR模板，通过所设计的PCR引物进行PCR扩增；PCR扩增所用的DNA聚合酶为具有校正功能的高保真DNA聚合酶； 步骤三，回收PCR产物，即PaGene，并定量及测定A260/A280、A260/A230比值；A260/A280和A260/A230比值需> 1.8，以保证PaGene具有较高的完整性和纯度； 步骤四，选取PaGene，按照Lonza公司核转试剂盒标准操作程序进行悬浮动物细胞转染，所用PaGene用与对应质粒相同摩尔数的剂量进行核转，进而完成PaGene核转悬浮动物细胞。
2.如权利要求1所述的PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法，其特征在于，所述目的基因可为任何编码蛋白的基因。
3.如权利要求1所述的PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法，其特征在于，所述重组目的基因的表达质粒可为非诱导型表达蛋白的质粒。
4.如权利要求1所述的PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: 悬浮动物细胞在含有适当比例胎牛血清的悬浮动物细胞培养基中培养，培养环境为37°C、5%C02 ;大肠杆菌(E.coli)工具菌株被用于质粒的保存和扩增；用相应试剂盒抽提质粒；所抽提质粒被用于目的 蛋白编码基因的扩增；所扩增基因被命名为PaGene ； 所述基因用具有校正功能的DNA聚合酶和其对应PCR引物进行扩增；正向引物位于基因启动子上游，反向引物位于基因转录终止子下游；正反向引物的位置保证目的蛋白编码基因在细胞内能够成功转录和翻译；PaGene用相应试剂盒纯化,进而用于核转悬浮动物细胞； DNA浓度以及A260/A280和A260/A230，比值皆≥1.8，用相应分光光度计测定，以反应对应核酸的完整性和纯度；PaGene亦通过琼脂糖凝胶电泳进行质控； 取悬浮动物细胞被用于核转； 核转所用溶液及程序采用Lonza公司就对应细胞系的说明书进行或者采用常规核转条件；核转后，细胞被转移至37°C预热的悬浮动物细胞完全培养基中继续培养； 进而完成PCR扩增基因核转悬浮动物细胞；与核转质粒相比，核转PaGene能够显著降低悬浮动物细胞的死亡率；PaGene在保证核转悬浮动物细胞较低死亡率的情况下，转染效率没有显著降低或降低很少。
5.如权利要求1所述的PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法，其特征在于，所述悬浮动物细胞为Kasum1-1细胞、NB4细胞或THP-1细胞。
6.如权利要求5所述的PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法，其特征在于，所述PCR扩增基因核转Kasum1-1细胞的方法包括如下步骤: 步骤一，以重组目的基因的表达质粒为模板，设计PCR引物；其中，正向PCR引物位于质粒启动子上游，反向PCR引物位于质粒转录终止子下游； 步骤二，以重组目的基因的表达质粒为PCR模板，通过所设计的PCR引物进行PCR扩增；PCR扩增所用的DNA聚合酶为具有校正功能的高保真DNA聚合酶；步骤三，回收PCR产物，即PaGene，并定量及测定A260/A280、A260/A230比值；A260/A280和A260/A230比值需> 1.8，以保证PaGene具有较高的完整性和纯度； 步骤四，选取PaGene，按照Lonza公司核转试剂盒标准操作程序进行细胞转染，核转程序为P-19，核转所用溶液为solution V，即kit V，所用PaGene用与对应质粒相同摩尔数的剂量进行核转，进而完成PaGene核转Kasum1-1细胞。
7.如权利要求6所述的PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法，其特征在于，步骤一中，所述目的基因为EGFP基因或萤火虫荧光素酶基因。
8.如权利要求6所述的PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法，其特征在于，步骤一中，所述重组目的基因的表达质粒为BD Biosciences的质粒pEGFP_N2或Promega的质粒pGL3-Control。
9.如权利要求6所述的PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法，其特征在于，步骤二中，所述DNA聚合酶为Toyobo公司的KOD Plus ； 所述引物具体为=PaEGFP-正向的序列如SEQ ID N0.1所示，PaEGFP-反向的序列如SEQID N0.2所示;PaLuc-正向的序列如SEQ ID N0.3所示，PaLuc-反向的序列如SEQ ID N0.4所示。
10.如权利要求6所述的PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法，其特征在于，步骤四中，所用PaGene剂量以2 μ g对应质粒所对应等摩尔数的剂量进行核转。
11.如权利要求6所述的PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: Kasum1-1细胞在含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，培养环境为37°C、5%C02 ;大肠杆菌(Ε.coli)菌株TOPlO被用于质粒的保存和扩增；用NucleoBond Xtra Midi试剂盒抽提质粒 pEGFP_N2 和 pGL3_Control ;用 AxyPrep? Plasmid Miniprep 试剂盒准备空E.coli TOPlO的洗脱液；所抽提质粒被用于EGFP和Iuciferase的扩增；所扩增基因分别被命名为PaEGFP和PaLuc ； 所述两个基因用具有校正功能的DNA聚合酶KOD Plus和其对应PCR引物进行扩增；正向引物位于基因启动子上游，EGFP在pEGFP-N2的启动子为Paw IE ;Iuciferase在pGL3-Control的启动子为SV40启动子；反向引物位于转录终止子下游，EGFP在pEGFP_N2的终止子为早期poly (A)信号；luciferase在pGL3_Control的终止子为SV40晚期poly (A)信号；正反向引物的位置保证PaEGFP和PaLuc能够在细胞内成功转录和翻译；所述引物具体为:PaEGFP-正向的序列如SEQ ID N0.1所示，PaEGFP-反向的序列如SEQ ID N0.2所示；PaLuc-正向的序列如SEQ ID N0.3所示，PaLuc-反向的序列如SEQ ID N0.4所示； PaGene用AxyPrep? PCR Clean-up试剂盒纯化,进而用于核转Kasum1-Ι细胞； DNA浓度以及A260/A280和A260/A230，比值皆≥1.8，用Nano Drop NDlOOO分光光度计测定，以反应对应核酸的完整性和纯度；质粒和PaGene亦通过琼脂糖凝胶电泳进行质控； Kasum1-1细胞与10 μ M等体积的eFluor670混合，并在37°C避光孵育IOmin ;之后加入4-5倍体积预冷的RPMI1640完全培养基，所述RPMI1640完全培养基为RPMI1640+15%胎牛血清，并且冰浴5min以终止标记，之后用RPMI1640完全培养基洗涤3遍，所标记细胞被用于后续核转； 2X 1O 6Ka sum 1-1细胞被用于核转，所述细胞预先标记或没有标记细胞增殖染料eFluor670 ； 核转所用溶液为solution V，即kit V，程序为P-19 ;核转后，细胞被转移至37°C预热的RPMI1640完全培养基中继续培养；
对于PaEGFP和pEGFP-N2，每次核转的剂量分别为680ng PaEGFP和2000ng pEGFP_N2，具有相同摩尔数；空E.coli洗脱液亦被用于核转，以便检测样品中残留的内毒素是否对细胞有潜在的致死效果；对于PaLuc和pGL3-Control，核转剂量分别为830ng PaLuc和2000ng pGL3-Control,相同摩尔数；与PaGene相同质量的对应质粒亦被用于核转,具体为pEGFP_N2 680ng, pGL3-Control830ng ； 进而完成PCR扩增基因核转Kasum1-1细胞；与核转质粒相比,核转PaGene能够显著降低Kasum1-1细胞的死亡率,核转PaGene的Kasum1-1细胞能够较好增殖,PaGene在保证核转Kasum1-1细胞较低死亡率的情况下，转染效率没有显著降低或降低很少。
【文档编号】C12N15/87GK103740760SQ201410010269
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月7日
【发明者】吴康, 范小勇, 黄家颖, 赵旭杰 申请人:上海市公共卫生临床中心