合成5’utr、表达载体以及增强转基因表达的方法

专利名称：合成5’utr、表达载体以及增强转基因表达的方法
合成5’ UTR、表达载体以及增强转基因表达的方法发明背景 发明领域本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及对真核细胞中基因表达转录后 控制的改进。
背景技术：
真核细胞基因表达在DNA转录为初级mRNA后要经过若干控制点。初级mRNA转录 本包含编码部分(外显子)和非编码部分(内含子)。在mRNA的剪接过程中，内含子被剪 切掉并从转录本中去除，外显子则被拼接起来产生成熟的信使RNA (mRNA)。剪接作用作为一 个控制点，通过在多种组合中增加和去除外显子而从单个基因产生多个蛋白质同种型。该 过程被称为选择性剪接，发生在称为剪接体的严密调控多组件结构中，受胞内和胞外信号 转导通路的控制。蛋白质编码区内的选择性剪接作用可以导致产生具有不同功能的多个同种型。 此外，剪接作用已表明可以显著增强哺乳动物细胞的蛋白质合成(Huang和Gorman，1990 Nucleic Acids Research 18(4) :937_947)。其机制仍然未知。选择性剪接也会发生在转 录本的非翻译区，可以为最终转录本提供增强子和稳定区域，从而增强蛋白质翻译。在合成基因构建体的5’端调节区增加剪接元件已表明可以增强基因表达，理 论上是由细胞核到胞质的mRNA转运增强造成的(Huang和Gorman，supra ；Choi等，1991 Molecular and Cellular Biology 11(6) :3070_3074)。基于这项研究结果，市场上买到的 哺乳动物表达载体的启动子和多克隆位点之间常含有内含子。而内含子与其它调控区的组 合是否具有增强基因表达的作用则尚未得到评估。发明概述本发明提供了为增强宿主细胞中合成基因构建体转基因组件的表达而设计的合 成5’ UTR多核苷酸序列。不受理论的限制，所述合成5’ UTR设计成通过增强RNA的转运和 稳定性来增强转基因表达。所述合成5’ UTR序列包含含有第一真核基因的剪接位点的多核苷酸片段，该多核 苷酸片段融合于编码在RNA和蛋白质水平上都保持稳定的第二真核基因的5’UTR序列的多 核苷酸片段。在一个实施方式中，所述5’UTR序列是嵌合序列，包含含有一个肌质网/内质 网钙ATP酶基因的剪接位点的多核苷酸片段，以及含有酪蛋白基因5’ UTR的至少一部分的 多核苷酸片段。本发明的5’ UTR多核苷酸序列用于增强合成基因构建体中感兴趣序列或感兴趣 编码区的表达。可以利用重组DNA技术将合成5’UTR序列插入病毒或非病毒载体上启动子 和感兴趣核苷酸序列之间。合成5’UTR序列任选侧接包含限制性核酸内切酶位点和限制性 核酸内切酶活性所需的其它核苷酸的核苷酸序列。侧翼序列任选提供载体内的克隆位点。本发明还提供了包含合成5’ UTR的载体。在本发明的实施方式中，所述载体是真 核表达载体。
本发明还提供了增强真核细胞中转基因表达的方法。方法包括以下步骤，将含有 剪接位点的第一真核基因的多核苷酸片段与含有至少一部分5’ UTR的第二真核基因的多 核苷酸片段融合在一起形成嵌合多核苷酸序列从而产生合成5’ UTR序列，然后将嵌合多核 苷酸序列插入表达载体中启动子和感兴趣序列之间。申请人:出乎意料地发现，将包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的内含子的多核苷 酸片段与包含酪蛋白基因的至少一部分的多核苷酸片段融合产生的合成5’ UTR序列，可以 增强基因表达。如本文详述，与对照相比，合成5’UTR两个不同实施方式在分别被含有合成 5’ UTR的表达载体转染的两种不同类型的细胞中均增强了报告基因的表达。因此，本发明的一个目的就是为增强真核细胞中转基因表达而提供一种合成 5’ UTR序列，其包含与含有至少一部分异源5’非翻译区的多核苷酸片段融合的含有剪接位 点的多核苷酸片段。本发明的另一目的是为增强真核细胞中转基因表达而提供一种合成5’ UTR序列， 其包含与含有至少一部分异源5’非翻译区的多核苷酸片段融合的含有内含子的多核苷酸 片段。本发明还有另一目的是为增强真核细胞中转基因表达而提供一种合成5’ UTR序 列，其包含与含有至少一部分异源5’非翻译区的多核苷酸片段融合的含有内含子的一个多 核苷酸片段，所述内含子包含相邻外显子的侧翼5’端和3’端部分。本发明还有另一目的是提供可以插入载体的合成5’ UTR序列。本发明还有另一目的是提供包含合成5’ UTR的载体。本发明还有另一个目的是提供包含合成5’ UTR的宿主细胞。序列说明SEQ ID N0:1表示合成5，UTR序列的一个实施方式，所述序列包含Mlu I限制性 位点，SEQ ID NO :2,Kpn I 限制性位点，SEQ ID NO :3,Mfe I 限制性位点。SEQ ID N0:1 在 本文也称作5U2。SEQ ID NO 2表示犬SERCA2内含子2序列的一个实施方式，所述序列具有一个突 变的推定共有polyA位点，外显子2的一部分侧接5’端和外显子3的一部分侧接3’端。 SEQ ID NO :2是家犬第26号染色体上一段突变的部分序列，鸟枪法全基因组序列(公开登 录号 NC_006608. 2)。SEQ ID N0:3表示牛酪蛋白5，UTR序列的一个实施方式。SEQ ID NO 3是全长牛 酪蛋白0 mRNA的部分序列(公开登录号NM_181008)。SEQ ID NO 4表示犬野生型SERCA2内含子2序列的一个实施方式，外显子2的一 部分侧接5’端和外显子3的一部分侧接3’端。SEQ ID NO :4是家犬第26号染色体的部 分序列，鸟枪法全基因组序列(公开登录号NC_006608. 2)。SEQ ID NO 5表示人野生型SERCA2内含子2序列的一个实施方式，第2个外显子 2侧接5’端和外显子3侧接3’端。SEQ ID NO 5是智人第12号染色体的部分序列，参比 装配体，完整序列(公开登录号NC_000012)。SEQ ID NO 6表示小鼠野生型SERCA2内含子2序列的一个实施方式，外显子2侧 接5’端和外显子3侧接3’端。SEQ ID NO :6是小鼠第5号染色体的部分序列，参比装配 体(公开登录号NC_000071)。
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SEQ ID NO 7表示合成5’ UTR序列的一个实施方式，所述序列包含Asc I限制性 位点，Mlu I限制性位点，SEQ ID NO :4，Kpn I限制性位点，SEQ IDN0 :3，Mfe I限制性位 点。SEQ ID NO :7在本文也称作INXN-1。SEQ ID NO :8表示小鼠酪蛋白5，UTR序列的一个实施方式。SEQ IDN0:8是小鼠 酪蛋白3，mRNA(cDNA克隆MGC 91065)的部分序列(公开登录号BC080709)。SEQ ID NO :9表示大鼠酪蛋白5，UTR序列的一个实施方式。SEQ IDN0:9是褐鼠 酪蛋白3 (Csn2)mRNA的部分序列(公开登录号NM_017120)。SEQ ID NO: 10表示绵羊酪蛋白5，UTR序列的一个实施方式。SEQ IDN0:10是绵 羊酪蛋白0 (CSN2)mRNA的部分序列(公开登录号NM_001009373)。SEQ ID N0:11表示犬SERCA2的外显子3。SEQ ID NO 11是家犬第26号染色体 的部分序列，鸟枪法全基因组序列(公开登录号NC_006608. 2)。SEQ ID NO :12表示包含合成5，UTR的载体序列的一个实施方式。SEQID N0 12 所示载体包含SEQ ID NO :1，如图10所示。SEQ ID NO :13表示包含合成5，UTR的载体序列的另一个实施方式。SEQ ID NO: 13所示载体包含SEQ ID NO :7，如图11所示。SEQ ID NO 14表示包含对照(polyG)合成5’ UTR的载体，如图9所示。在上述任一序列中，T(胸腺嘧啶)都可以被U(尿嘧啶)取代。


图1A是SEQ ID NO 4所示多核苷酸的示意图。图1B是SEQ ID NO 5所示多核苷酸和SEQ ID NO 6所示多核苷酸的示意图。图1C描述SEQ ID NO 2和SEQ ID NO :4_6所示多核苷酸。SERCA2的第2个内含 子用黑色突出显示。相邻外显子或其部分没有突出显示。图2A是SEQ ID NO 1所示多核苷酸的示意图。图2B是SEQ ID NO 7所示多核苷酸的示意图。图3A是插入表达载体中启动子和感兴趣序列之间的合成5’ UTR的示意图。图3B是插入表达载体中启动子和克隆位点之间的合成5’ UTR的示意图。图4描述了在HEK-293细胞中检测本发明合成5，UTR实施方式的结果。图5描述了在1080细胞中检测本发明合成5’ UTR实施方式的结果。图6描述了检测本发明合成5，UTR实施方式的结果，以相对于HEK-293细胞和 1080细胞中的对照的增长倍数表示，其中对照值标准化为1。图7描述了实施例1中使用的对照载体(VVN-2712)，其中0 -半乳糖苷酶(LacZ) 编码序列缺少5’ UTR并操作性连接于CMV启动子。图8描述了实施例1中使用的对照载体(VVN-2713)，其中所述载体缺少5’UTR和 LacZ o图9描述了实施例1中使用的载体(VVN-8318)，其中0 -半乳糖苷酶(LacZ)编码 序列操作性连接于polyG 5’ UTR和CMV启动子。图10描述了实施例1中使用的载体(VVN-8277)，其中0 -半乳糖苷酶(LacZ)编 码序列操作性连接于本发明的5’ UTR(5U2)和CMV启动子。
图11描述了实施例1中使用的载体(VVN-8276)，其中0 -半乳糖苷酶(LacZ)编 码序列操作性连接于本发明的5’ UTR(INXN-l)和CMV启动子。图12是含有图4-6所述实施例1数据的表格。图13描述了包含第二内含子和外显子2及外显子3的马SERCA2基因组序列和 mRNA序列的部分比对结果。第二内含子的5’端和3’端分别用箭头标出。图7-11使用下列缩写CMV pro =巨细胞病毒启动子，LacZ = LacZ编码序列， SV40pA = SV40 polyA，Amp =氨苄青霉素抗性基因，Neo =新霉素抗性基因，MCS =多克隆 位点，SPL-1 =外显子2SERCA2的一部分+内含子2SERCA2+外显子3 SERCA2的一部分， UTR-1 = 5，UTR酪蛋白的一部分。发明详述下列定义适用于整个说明书、附图和权利要求书。在说明书和权利要求书中使用 而没有在此作出定义的术语则具有本领域中通常的含义。本发明中使用的术语“一个”或“一”时，表示“至少一个”或“一个或多个”，另外
说明的除外。“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“寡核苷酸”、“寡核苷酸序列”、“核苷酸序列”、 “多核苷酸”以及“多核苷酸序列”可以互换使用，指以单链形式或双链螺旋的核糖核苷(腺 嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺 嘌呤核苷、脱氧鸟嘌呤核苷、脱氧胸腺嘧啶核苷火脱氧胞嘧啶核苷；“DNA分子”)的磷酸酯 多聚体形式，或它们的任何磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯和硫酯。双链DNA-DNA、DNA-RNA 和RNA-RNA螺旋是可能的。术语“核酸分子”，特别是DNA或RNA分子只是指该分子的一级 结构和二级结构，并不限于任何具体的三级形式。因此，此术语包括在线形或环状DNA分子 (例如，限制性片段)、质粒、超螺旋化DNA和染色体中发现的双链DNA，等等。讨论特定双 链DNA分子结构时，本文可根据沿DNA的非转录链(即，具有与mRNA的同源序列的链)仅 以5’到3’方向给出序列的正常惯例描述序列。“重组DNA分子”是经分子生物学方法操作 的DNA分子。DNA包括但并不限于cDNA、基因组DNA、质粒DNA、合成DNA以及半合成DNA。与多核苷酸序列一起使用的术语“片段”(例如“多核苷酸片段”)是指相对于参比 核酸长度降低并在共同部分包含与参比核酸相同的核苷酸序列的核苷酸序列。本发明的这 种核酸片段可以适当地包含在作为其成分的较大多核苷酸中。所述片段包含长度为至少6、 8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、 75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000 或 1500 个本发明核酸的 连续核苷酸或由它们构成。术语“嵌合”是指组成片段在天然状态上不连续。例如，嵌合多核苷酸是指包含天 然状态不连续片段的多核苷酸。与多核苷酸序列一起使用的术语“合成”是指与野生型多核苷酸序列不同的非天 然多核苷酸(或多核苷酸的一部分)。例如，一个合成基因(或基因的一部分)可以包含一 段或多段天然状态不连续的核酸序列(嵌合序列)，和/或可包含取代、插入、缺失及它们组
1=1 o“基因”是指包含编码功能分子(例如多肽或RNA)的核苷酸的多核苷酸，包括cDNA 核酸或基因组DNA核酸。通常认为，编码多肽或RNA的基因组DNA包括非编码区(即内含
8子)，非编码区从成熟mRNA上剪切下，从而不会在编码同样多核苷酸的cDNA或RNA中出现。 “基因”可以包含表达特定RNA、蛋白质或多肽的核酸片段。“基因”还可在编码序列上游(5’ 非编码序列)和下游(3’非编码序列)包含调控序列。“基因”还可包含三链形成寡核苷酸 (TF0)。“天然基因”是指在自然界发现的带有其自身调控序列的基因。“嵌合基因”或“重 组基因”是指不属于天然基因的任何基因，包含无法在自然界一起找到的调控和/或编码序 列。因此，嵌合基因可包含来源不同的调控序列和编码序列，或来源相同但是按照不同于自 然方式排列的调控序列和编码序列。嵌合基因可包含来源不同的编码序列和/或来源不同 的调控序列。“内源基因”是指位于生物体基因组内其天然位置的天然基因。“外来”或“外源”基因、“异源”基因或“转基因”是指通常无法在宿主细胞或生物 体中找到的，而是通过基因转移引入宿主细胞和生物体的基因。转基因可包含插入非天然 生物体的天然基因、嵌合基因或合成基因。转基因也可以是内源基因的cDNA形式。转基因 还可以是内源突变基因的非突变形式，或内源非突变基因的突变形式。转基因还可以是治 疗基因或实验基因，例如报告基因。转基因可以直接引入宿主生物体的靶细胞，或通过转移 转化细胞，例如自体细胞而间接引入宿主生物体。基因的“5’非翻译区”或“5’ UTR”应理解为转录成初级RNA转录本(前体mRNA) 并位于编码序列上游的一部分基因。初级转录本是初始RNA产物，包含内含子和外显子，由 DNA转录产生。许多初级转录本必须经过RNA加工以形成具有生理活性的RNA。形成成熟 mRNA的加工过程包括修饰末端、切除内含子、加帽和/或从前体RNA上剪切出各rRNA分子。 因此，mRNA的5’UTR是不会被翻译成蛋白质并位于编码序列上游的一部分mRNA。在基因组 序列中，5’UTR通常被定义为位于转录起始点和起始密码子之间的区域。脊椎动物mRNA的 5’非翻译区(5’UTR)长度可以是几十个碱基到几百个碱基(Crowe等，2006 BMC Genomics 7 :16)。“合成5’ UTR”是一种不同于野生型5’ UTR多核苷酸序列的非天然5’ UTR。合成 5’UTR可以包含一段或多段在天然状态上不连续的核酸序列(嵌合序列)，和/或可包含取 代、插入、缺失及它们的组合。“剪接点”、“内含子_外显子剪接点”或“剪接位点”是能被细胞的剪接装置识别的 真核前体mRNA内含子边界处的区域，在此处，相邻的两个外显子被拼接，内含子被切除。剪 接位点由5’和3’内含子/外显子交界处的保守序列所示。对于绝大多数内含子，最保守的 序列侧接内含子5’端的GU序列和侧接3’端的AG。然而上述共有序列也有已知的例外情 况，例如具有AU-AC剪接位点的内含子。内含子/外显子交界处的5’剪接位点被称为“剪 接供体”位点。内含子/外显子交界处的3’剪接位点被称为“剪接受体”位点。“剪接体”是用作细胞剪接装置的大的核糖核蛋白复合物。剪接体包含在前体 mRNA底物上进行装配的核内小分子核糖核蛋白(snRNP)亚基。snRNP本身又包含核内小 RNA(snRNA)和若干蛋白质亚基。在剪接反应过程中，通过与snRNA的碱基配对识别前体 mRNA内的剪接位点。“异源” DNA是指天然状态下在细胞或细胞染色体部位中不存在的DNA。因此异源 DNA含有细胞以外来源的基因。“异源"DNA还可含有天然状态下在细胞中存在、但是位于非 天然位置的基因。此外，“异源”DNA分子可以是包含与宿主DNA片段，例如转录启动子操作 性连接的非宿主DNA片段的DNA分子。相反地，异源DNA分子可包含与外源启动子操作性连接的内源基因。此外，“异源”可以是指来自与参比DNA分子或片段的不同进化起源的基 因的DNA分子或片段。术语“基因组”包括染色体以及线粒体、叶绿体、病毒DNA或RNA。术语“探针”是指可以与互补的单链靶核酸进行碱基配对形成双链分子的单链核 酸分子。DNA “编码序列”指编码多肽的双链DNA序列，当置于合适调控序列的控制下，其可 以在体外、体内的细胞内或在细胞外，例如试管内转录和翻译成多肽。“合适的调控序列”是 指位于编码序列上游(5’非编码序列)、当中或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，对转 录、RNA的加工或稳定性、或相关编码序列的翻译产生影响。调控序列可以包括启动子、翻 译前导序列、内含子、多聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。 编码序列的边界由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的终止密码子决定。编码 序列包括但并不限于原核、真核或嵌合序列、来自mRNA的cDNA、基因组DNA序列以及甚至合 成DNA序列。“开放读框”缩写作0RF，指一段核酸序列(DNA、cDNA或RNA)，包含翻译起始信号或 起始密码子，例如ATG或AUG，以及终止密码子，所述片段具有翻译成多肽序列的潜能。术语“下游”是指位于参比核苷酸序列3’端的核苷酸序列。具体地说，下游核苷 酸序列通常涉及位于转录起始点之后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始 点的下游。术语“上游”是指位于参比核苷酸序列5’端的核苷酸序列。具体地说，上游核苷 酸序列通常涉及位于编码序列或转录起始点5’侧的序列。例如，大多数启动子位于转录起 始点的上游。与DNA序列相关的“化学合成”指组分核苷酸在体外装配。人工化学合成DNA可 以采用熟知的方法进行，或者可利用可商品化购得的机器进行自动化化学合成。因此，为达 到最佳的基因表达效果，可以基于核苷酸序列的优化对基因进行修饰加工，以反映出宿主 细胞的密码子偏好。本领域普通技术人员能够理解，如果使用的密码子与宿主偏好的密码 子相符，基因表达的成功率会增大。可以依据检测源于有序列信息可用的宿主的基因来确 定偏好密码子。术语“限制性内切酶”和“限制酶”可以互换使用，指在双链DNA中与特定核苷酸 序列结合并在其中进行切割的酶。“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用，指包含共价结合的氨基酸残基的多聚体 化合物。氨基酸具有以下的通用结构“多聚酶链式反应”缩写作PCR，指一种体外酶促扩增特定核酸序列的方法。PCR涉 及一系列重复的温度循环反应，每个循环包括三个阶段模板核酸变性，分离出靶分子链； 单链PCR寡核苷酸引物与模板核酸退火，；利用DNA多聚酶对退火引物进行延伸反应。术语“同源性”指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的相同性百分比。可通过本 领域已知的技术测定一个部分的序列与另一部分的序列之间的对应性。例如，可通过比对 序列信息并利用不难获得的计算机程序来直接比较两个多肽分子之间的序列信息从而测 定同源性。或者，可通过同源性区域之间能形成稳定双链体的条件下使得多核苷酸杂交，然 后用单链同源性核酸酶消化并测定消化片段的大小来测定同源性。
在本发明中使用的所有语法形式和拼写变化的术语“同源的”，是指具有“共同进 化起源”的蛋白质之间的关系，包括来自超家族的蛋白质(例如免疫球蛋白超家族)和来 自不同物种的同源蛋白质(例如肌球蛋白轻链等)(Reeck等，Cell 50:667(1987))。如高 度的序列相似性所反映，所述蛋白(及其编码基因)具有序列同源性。然而，在通常的使用 和本申请中，术语“同源的”在被副词“高度”修饰时，可指序列相似性而不是共同的进化起 源。因此，所有语法形式和拼写变化的术语“序列相似性”指可能具有或不具有共同进 化起源的核酸或蛋白质的氨基酸序列之间的相同性或对应性程度(见Reeck等，Cell 50 667(1987))。在一个实施方式中，当两段DNA序列在规定长度上有至少约21% (优选地至 少约50%，更加优选地至少约75 %、90%、95%、96%、97%、98%或99% )的核苷酸相匹配 时，称“基本上同源的”或“基本上相似的”。可利用序列数据库中可得的标准软件，或在，例 如特定体系所规定的严谨性条件下采用Southern杂交实验来比较序列，从而鉴定基本上 同源的序列。设定合适的杂交条件为本领域已知技术(见，例如Sambrook等，1989，下文)。本文所用的“基本上相似”指这样一种核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基中的 改变导致一个或多个氨基酸取代，但是并不影响DNA序列编码的蛋白质的功能性质。“基本 上相似”还指这样一种核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基中的改变不影响该核酸片段 通过反义或共_阻遏技术介导基因表达改变的能力。“基本上相似”还指本发明核酸片段的 修饰物，例如缺失或插入不实质性影响所得转录物功能特性的一个或多个核苷酸碱基。因 此，应该知道本发明包括多个具体的示范性序列。与测定编码产物的生物学活性的保留程 度一样，所提出的各种修饰是本领域的常规技术。此外，本领域技术人员知道，还可以通过在严谨条件下的杂交能力来确定本发明 所包括的基本上相似的序列。当单链形式的核酸分子可在合适的温度和溶液离子强度的 条件下与另一核酸分子退火时，称该核酸分子可与另一核酸分子，例如cDNA、基因组DNA或 RNA“杂交”(见Sambrook等，1989，infra)。杂交和洗涤条件为已知技术，例子见Sambrook， J. , Fritsch, E. F.禾口 Maniatis, T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (分子克隆 实验室手册)，第二版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷 泉港(1989)，尤其是其中的第11章和表11. 1。温度和溶液离子强度条件决定杂交的“严谨 性”。可以调整严谨条件来以筛选适度相似的片段，例如远相关生物体的同源性序列， 到高度相似片段，例如复制极其相关生物体的功能酶的基因。对于同源核酸的初级筛选来 说，可以采用对应Tm为55°C的低严谨性杂交条件，例如，5XSSC，0. 1 % SDS，0. 25%牛奶，无 甲酰胺；或30%甲酰胺，5XSSC，0. 5% SDS。中等严谨性杂交条件的对应Tm稍高，例如，40% 甲酰胺，5X或6XSSC。高严谨性杂交条件的对应Tm最高，例如，50%甲酰胺，5X或6XSSC。杂交要求两个核酸必须含有互补序列，虽然依赖于杂交严谨性，但是仍然可能发 生碱基之间的错配。术语“互补”用来描述能够相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如， 对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明也包括与本文公开或 使用的完整序列以及基本上相似的核酸序列互补的分离核酸片段。在一个实施方式中，多核苷酸检测采用的杂交条件包括在55°C的Tm下进行杂交 步骤，以及前述其它条件。在另一个实施方式中，Tm为60°C ；在某些实施方式中，Tm为63°C
11或 65°C。杂交后洗涤也决定严谨性条件。一套优选条件采用一系列洗涤，开始用6XSSC、 0.5% SDS，在室温下洗涤15分钟(min)，接着用2XSSC、0. 5% SDS，在45°C下重复洗涤30 分钟，再用0. 2XSSC、0. 5% SDS，在50°C下重复洗涤两次，每次30分钟。另一个严谨条件的 实施例采用较高的温度，除最后用0. 2XSSC、0. 5% SDS的两次30分钟洗涤的温度升高到 60°C外，其它洗涤条件与前述相同。还有一个高度严谨条件的实施例在最后两次漂洗中采 用0. 1XSSC，0. 1% SDS，65°C。杂交要求两个核酸必须含有互补序列，虽然依赖于杂交严谨 性，但是仍然可能发生碱基之间的错配。核酸杂交合适的严谨性依赖于本领域熟知的核酸长度和互补程度。两段核苷酸序 列之间的相似性和同源性越高，具有此两段序列的核酸杂交体的Tm值就越高。核酸杂交的 相对稳定性(对应于更高的Tm)按以下顺序递减RNA:RNA，DNA:RNA, DNA:DNA。对于长度 大于100个核苷酸的杂交体，已推导出计算Tm的公式(见Sambrook等，同上，9. 50-0. 51)。 对于较短的核酸，即寡核苷酸的杂交，错配发生的位置更为重要，寡核苷酸的长度决定其特 异性(见 Sambrook 等，同上，11. 7-11. 8)。在一个实施方式中，多核苷酸检测采用的杂交条件包括在浓度小于500mM的盐溶 液中、至少37°C下进行杂交步骤，以及用2XSSPE在至少63°C下进行洗涤步骤。在另一个实 施方式中，杂交条件包括在浓度小于200mM的盐溶液中、至少37°C下进行杂交步骤。在某些 实施方式中，杂交条件包括杂交和洗涤步骤均采用2XSSPE和63°C。可杂交核酸的长度，例如，是至少约10个核苷酸。可杂交核酸的最小长度可能是 至少约15个核苷酸；至少约20个核苷酸；或至少约30个核苷酸。此外，本领域技术人员能 够理解，如果需要可以根据例如探针长度等因素调整温度和洗涤溶液离子浓度。本发明的基本上相似的核酸片段是其DNA序列与本文报道的核酸片段的DNA序列 具有至少70%相同的核酸片段。本发明的核酸片段包括其DNA序列与本文报道的核酸片段 的DNA序列具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%和99%相同的核酸片段。术语“对应于”在本文用来指相似或同源的序列，无论精确位置与检测相似性和同 源性的参比分子是否相同。核酸或氨基酸序列的比对可包括空位。因此术语“对应于”指 序列相似性，而不是氨基酸残基或核苷酸碱基的编号。氨基酸或核苷酸序列的“实质性部分”包含足够的多肽氨基酸序列或基因核苷酸 序列，从而本领域技术人员通过人工序列评估或使用算法，例如BLAST (局部序列比对基本 检索工具；Altschul等，J.MoI.Biol. 215 =403410(1993))进行计算机自动序列比较识别和 鉴定来推定该多肽或基因；BLAST算法，是互联网上的公共可用资源。通常，10个或更多个 毗连的氨基酸或30个或更多个核苷酸的序列是推测性鉴定与已知蛋白质或基因同源的多 肽或核酸序列所需。此外，对于核苷酸序列，包含20个到30个连续核苷酸的基因特异性寡 核苷酸探针可用于基因鉴定(例如Southern杂交)和分离(例如细菌菌落或噬菌斑的原 位杂交)的序列依赖性方法。另外，12个到15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引 物，来获得包含此引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“实质性部分”包含足够的序 列以特异性鉴定和/或分离包含此序列的核酸片段。本领域已知的术语“相同性百分比”是通过比较序列测定的两条或更多条多肽序 列或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“相同性”还表示多肽或多核苷酸序列之间的序列关联性程度，例如通过这些序列诸链之间的匹配测定的。不难通过已 知的方法计算“相同性”和“相似性”，所述方法包括但不限于以下描述的Computational Molecular Biology (计算分子生物学)(Lesk，A.M.编)牛津大学出版社(Oxford University Press),纽约(1988) ；Biocomputing Informatics and Genome Projects (生 物计算信息和基因组项目)(Smith，D.W.编)学术出版社(Academic Press)，纽约 (1993) ；Computer Analysis of Sequence Data(序列数据的计算机分析)，第 I 部分 (Griffin, A.M.和 Griffin，H. G.编)休玛効卩出版社(HumanaPress)，新泽西州(1994)； Sequence Analysis in Molecular Biology(^^^^^W^^J^lif) (von Heinje,G. IS) 学术出版社(1987)；和 Sequence Analysis Primer(序列分析引物)(Gribskov，M.和 Devereux, J.编)斯托克顿出版社，纽约(1991)。测定相同性的方法设计成能给出所测试 序列之间的最佳匹配。测定相同性和相似性的方法编成公众可得的计算机程序。可利用威 斯康星州麦迪逊市DNA星公司的激光基因生物信息学计算套件的大型比对程序(Megalign program of the LASERGENE bioinformaticscomputing suite, DNASTAR Inc. , Madison, WI)进行序列比对和相同性百分比计算。可利用参数默认(GAP PENALTY = 10,GAP LENGTH PENALTY = 10)的群集比对方法(Clustal method of alignment) (Higgins 等，CABIOS. 5 151(1989))进行序列的多重比对。利用群集方法进行成对比对的默认参数可以选择为 KTUPLE 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5 和 DIAGONALSSAVED = 5。术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或 软件程序。“序列分析软件”可以商品化购得或独立开发的。典型的序列分析软件包括但 不限于GCG程序套件(威斯康星软件包(Wisconsinpackage)9.0版，遗传学计算机课题 组(GCG)，麦迪逊，威斯康星州)、BLASTP、BLASTN、BLASTX (Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 403(1990))和DNASTAR (DNA星公司，圣帕克街1228号(S.Park St.)，麦迪逊，威斯康星州， 53715美国)。在本申请的内容中，应该知道除非另有规定，利用序列分析软件进行分析时， 分析的结果将依据引用的程序的“默认值”。本文所用的“默认值”表示首次启动时，软件原 始加载的任何一组数值或参数。本发明中使用的术语“表达”或“基因表达”是指通过基因“转录”(即，通过RNA 聚合酶的酶促作用)将编码在基因中的遗传信息转化为RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA或 snRNA)，对于蛋白质编码基因，通过mRNA “翻译”成蛋白质的过程。基因表达在过程中的许 多阶段受到调控。“上调”或“激活”是指增加基因表达产物(即RNA或蛋白质)的调控，而 “下调”或“阻遏”是指减少产量的调控。参与上调或下调过程的因子(例如转录因子)常 分别称为“激活物”或“阻遏物”。出于本发明的目的，靶基因可通过与下调RNA分子的特异 性相互作用而“转录后”下调。术语“转录与翻译调控序列”是指在宿主细胞中表达编码序列的DNA调控序列，例 如启动子、增强子、终止子等。术语“操作性连接”指核酸序列与一个核酸片段的结合，因此一个的功能受另一个 的影响。例如，当启动子能影响编码序列的表达时(即此编码序列处于此启动子的转录调 控下)，称该启动子操作性连接于该编码序列。编码序列可以有义或反义方向操作性连接于 调控序列。“载体”指用于将核酸克隆和/或传递入宿主细胞的任何运载体。。载体可以是可与另一 DNA区段相连从而复制所连区段的复制子。“复制子”指用作DNA体内复制的自主单 元，即能在其本身控制下复制的任何遗传元件(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。 术语“载体”包括在体外、离体或体内将核酸引入宿主细胞的病毒和非病毒媒介。术语“载 体”也可包括小环DNA。例如，载体可以是没有细菌DNA序列的质粒。去除富含CpG区域 的细菌DNA序列已被证明可以减少转基因表达沉默，使来自质粒DNA载体的表达持续更久 (见例如 Ehrhardt，A.等(2003) Hum Gene Ther 10 215-25 ；Yet,N. S. (2002) Mo I Ther 5 731-38 ；Chen, Z. Y.等(2004)Gene Ther 11:856-64)。术语“载体”还可以包括转座子，例 如“睡美人”(Sle印ing Beauty) (Izsvak 等，J. Mol. Biol. 302 :93_102 (2000))，或人工染色 体。本领域有大量的已知载体可以用来进行核酸操作、将反应元件和启动子整合入基 因内等，或将核酸转移到宿主细胞内。可用的载体包括，例如质粒或修饰病毒，包括例如入 噬菌体衍生物等噬菌体，或PBR322或pUC质粒衍生物或Bluescript载体等质粒。更大的载 体，例如人工染色体(细菌(BAC)、酵母(YAC)或人(HAC)的人工染色体)，可以用来容纳更 大的插入片段。例如，可以通过把合适的DNA片段连接到所选的具有互补粘性末端的载体， 将对应于反应元件或启动子的DNA片段插入到合适的载体。或者，可以把核苷酸序列(接 头)连接到DNA末端，对DNA分子的两端进行酶促修饰或生成任何位点。此类载体经工程 改造可含有可选择的标记基因，以便筛选被载体转染或转化的细胞。本发明的包含多核苷 酸的重组载体可包含要在其中扩增或表达的细胞宿主的一个或多个复制起点、标记或可选 择的标记。术语“可选择标记”指鉴定因子，通常是能基于标记基因的作用而选择的抗生素或 化学耐受基因(即耐受抗生素、耐受除草剂)、比色标记、酶、荧光标记等，其中该作用用于 示踪感兴趣核酸的遗传性和/或鉴定或选择遗传了该感兴趣核酸的细胞或生物体。本领域 已知并使用的可选择标记的例子包括提供氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉 素、双丙氨酰膦除草剂、磺酰胺等耐受性的基因；和用作表型标记的基因，即，花青甙调节基 因、异戊烯转移酶基因(isopentanyl transferase gene)等术语“报道基因”指编码能依据报道基因的作用而得到鉴定的鉴定因子的核酸， 其中该作用用于示踪感兴趣核酸的遗传性，鉴定已遗传了感兴趣核酸的细胞或生物体，和/ 或检测基因表达诱导或转录。本领域已知并使用的报道基因的例子包括但不限于萤光素 酶(Luc)、荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、半乳糖苷酶 (LacZ)、葡糖醛酸糖苷酶(Gus)等。可选择标记基因也可视作报道基因。术语“质粒”指常携带基因的染色体外元件，其不是细胞中心代谢的一部分，通常 是环状双链DNA分子的形式。这种元件可以是衍生自任何来源的单链或双链DNA或RNA，线 形、环状或超螺旋的自发复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷 酸序列连接或重组入独特构建物中，该构建物能将所选基因产物的启动子片段和DNA序列 连同合适的3’非翻译序列引入细胞。“克隆载体”是指复制子，其是单元长度的核酸，例如DNA，其顺序复制并包含复制 起点，例如质粒、噬菌体或粘粒，另一个核酸片段可以连接到复制点从而复制所连接的片 段。克隆载体可以在一种类型的细胞中复制而在另一种类型的细胞中表达(“穿梭载体”)。术语“表达载体”指载体、质粒或运载体，其设计成能在转化入宿主细胞后表达所
14插入的核酸序列。克隆的基因，即，插入的核酸序列通常置于调控元件，例如启动子、最小启 动子、增强子等的控制下。可用于驱动核酸在所需宿主细胞中表达的启动调控区或启动子 多种多样，并为本领域技术人员所熟悉。可通过本领域已知的方法，例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡 聚糖、磷酸钙沉淀、脂质转染(溶酶体融合)、利用基因枪或DNA载体运输蛋白将载体引入所 需的宿主细胞(参见，例如 Wu 等，J.Biol. Chem. 267 =963(1992) ；Wu 等，J. Biol. Chem. 263 14621(1988)；和Hartmut等，1990年3月15日提交的加拿大专利申请号2，012，311)。真核载体的例子包括但并不限于斯特拉塔基因公司(Stratagene)购得的 pW-LNE0、pSV2CAT、p0G44、pXTl 和 pSG ；从 APB 公司(AmershamPharmacia Biotech)购得的 pSVK3、pBPV、pMSG 和 pSVL ；以及从克隆技术公司(Clontech)购得的 pCMVDsRed2_express、 pIRES2-DsRed2、pDsRed2_Mito、pCMV_EGFP。此外还有其它许多公知而可商品化购得的载 体。例如，美国专利申请号2004/0185556、美国专利申请号11/233，246以及国际专利 申请号W02005/040336和W02005/116231描述了包含分子插入支点以供快速插入和除去基 因程序元件的有用载体。“启动子”和“启动子序列”可互换使用，指可以控制编码序列或功能性RNA表达的 DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3’端。启动子可以完全衍生自天然基因，或由 衍生自天然发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA区段。本领域技 术人员能够理解，不同启动子可以在不同组织或不同类型的细胞中、或在发育的不同阶段、 或对不同环境或生理条件起反应而指导基因表达。促使基因在大多数类型的细胞中并在大多数时间内表达的启动子通常称为“组成 启动子”。促使基因在特定类型的细胞中表达的启动子通常称为“条件启动子”。条件启动 子的非限制性例子有“细胞特异性启动子”或“组织特异性启动子”。促使基因在发育或细 胞分化的特定阶段表达的启动子通常被称为“发育特异性启动子”或“细胞分化特异性启动 子”。在与诱导启动子的药剂、生物分子、化学品、配体、光等接触或用这些物质处理细胞后 得到诱导并导致基因表达的启动子通常称为“诱导型启动子”或“可调节启动子”。可诱导 启动子的一个非限制性例子是TetO可诱导启动子。还应知道，由于在大多数情况中，调控 序列的确切边界并未完全限定，不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。启动子序列通常在其3’端以转录起始点为界，向上游延伸(5’方向)以包含在可 检测背景水平启动转录所需的最少数量的碱基或元件。在启动子序列中可以发现转录起始 点(通过，例如核酸酶S1作图不难限定)，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合区域(共 有序列)。在RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA时，编码序列处于细胞中转录与翻译调控序 列的“控制之下”，接着经反式RNA剪接(如果编码序列包含内含子)和翻译成编码序列编 码的蛋白质。终止调控区，即终止子或多聚腺苷酸化序列还可衍生自对优选宿主而言各种天然 的基因。任选地，终止位点可不是必需的，但最好包含。在本发明的一个实施方式中，终止 调控区可以由以下组分构成或衍生自它们合成序列、合成多聚腺苷酸化信号、SV40晚期 多聚腺苷酸化信号、SV40多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号、病毒终止子序列等。术语“转染”指细胞摄取外源性或异源的RNA或DNA。当这种RNA或DNA被引入细 胞，称该细胞被外源性或异源的RNA或DNA “转染”。转染的RNA或DNA可以整合(共价相 连)入构成细胞基因组的染色体DNA。“转化”指将核酸片段传递入宿主生物体的基因组，从而导致遗传学稳定的遗传 性。术语“调节”是指诱导、降低或抑制核酸或基因表达，从而分别诱导、降低或抑制蛋 白质或多肽生成。“RNA转录本”是指RNA聚合酶催化的DNA序列转录的产物。当RNA转录本是DNA 序列的完美互补拷贝时，被称为初级转录本，或者它可以是衍生自初级转录本的转录后加 工的RNA序列，称为成熟mRNA。“信使RNA(mRNA)，，是指没有内含子并可以被细胞翻译成蛋 白质的RNA。“cDNA”是指与mRNA互补并来自mRNA的双链DNA。“有义”RNA是指包括mRNA 在内的RNA转录本，同样可以被细胞翻译成蛋白质。本发明的一个实施方式是包含第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段的合成 5’ UTR多核苷酸，其中a.第一多核苷酸片段包含第一真核基因的至少一个剪接位点；b.第二多核苷酸片段包含第二真核基因的至少一部分5’非翻译区；以及c.第一多核苷酸片段位于第二多核苷酸片段的5’端。在本发明的另一实施方式中，所述合成5’ UTR是包含第一多核苷酸片段和第二多 核苷酸片段的嵌合多核苷酸，其中a.第一多核苷酸片段包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2个内含子；b.第二多核苷酸片段包含酪蛋白基因的至少一部分5’非翻译区(5’ UTR)；以及c.第一多核苷酸片段位于第二多核苷酸片段的5’端。包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2个内含子的多核苷酸片段可以衍生自任 何真核肌质网/内质网钙ATP酶基因。在本发明的一个实施方式中，包含真核肌质网/内质 网钙ATP酶基因的第2个内含子的多核苷酸片段衍生自SERCA2基因。在其它实施方式中， 它衍生自SERCA1或SERCA3基因。作为包含所述第2个内含子的多核苷酸片段来源的肌质 网/内质网钙ATP酶基因可以来自任何其它真核物种。在一个实施方式中，肌质网/内质 网钙ATP酶基因来自哺乳动物。在另一个实施方式中，肌质网/内质网钙ATP酶基因来自 鸟类。在另一个实施方式中，肌质网/内质网钙ATP酶基因来自鱼类。在特定的实施方式 中，包含所述第2个内含子的多核苷酸片段来自人、狗、小鼠的肌质网/内质网钙ATP酶基 因。在其它特定的实施方式中，包含所述第2个内含子的多核苷酸片段来自大鼠、黑猩猩、 鸡、马、奶牛、麇鹿、猪、猫、猕猴或斑马鱼的肌质网/内质网钙ATP酶基因。在本发明的另一实施方式中，包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2个内含子 的多核苷酸片段包含侧接5’端的外显子2的一部分和侧接3’端的外显子3的一部分。在 另一实施方式中，包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2个内含子的多核苷酸片段包含 侧接5’端的整个外显子2和侧接3’端的整个外显子3。包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2个内含子的多核苷酸片段的长度可以为 至少约50个核苷酸。在其它实施方式中，包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2个内
16含子的多核苷酸片段的长度可以为至少约60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、 170、180、190、200、210、220、230、240 或 250 个核苷酸。在本发明的另一实施方式中，包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2个内含子 的多核苷酸片段在推定共有polyA位点具有突变。在另一实施方式中，包含肌质网/内质 网钙ATP酶基因的第2个内含子的多核苷酸片段包含外显子2的5’端侧翼部分和外显子 3的3’端侧翼部分，在推定共有polyA位点具有突变，衍生自犬SERCA2基因；在一个特定 的实施方式中由SEQ IDN0:2表示。在其它实施方式中，包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2个内含子的多核苷 酸片段是野生型或突变的部分SERCA2序列。所述多核苷酸片段可以衍生自任何物种的任 何全长SERCA2基因。例如，在一个实施方式中，包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2 个内含子的多核苷酸片段是野生型的部分犬SERCA2基因组序列，其包含侧接5’端的外显 子2的一部分和侧接3’端的外显子3的一部分；在一个特定的实施方式中，由SEQ ID NO 4表示。SEQ ID NO :4如图1A和图1C所示。在另一实施方式中，包含肌质网/内质网钙 ATP酶基因的第2个内含子的多核苷酸片段是野生型的部分人SERCA2基因组序列，其包含 侧接5’端的外显子2和侧接3’端的外显子3 ；在一个特定的实施方式中，由SEQ ID NO 5 表示。在另一实施方式中，包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2个内含子的多核苷酸 片段是野生型的部分小鼠SERCA2基因组序列，其包含侧接5’端的外显子2和侧接3’端的 外显子3 ；在一个特定的实施方式中，由SEQ ID NO 6表示。SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6 如图1B和图1C所示。在其它实施方式中，包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2个内 含子的多核苷酸片段是突变型或野生型的部分褐鼠SERCA2序列、马SERCA2序列、牛SERCA2 序列、黑猩猩SERCA2序列、猫SERCA2序列、兔SERCA2序列、野猪SERCA2序列、猕猴SERCA2 序列、鹿SERCA2序列、鸡SERCA2序列或斑马鱼SERCA2序列。包含酪蛋白基因5’非翻译区的至少一部分的多核苷酸片段可以来自任何哺乳动 物。在一个实施方式中，包含至少一部分5’非翻译区的多核苷酸片段来自牛酪蛋白基 因；在一个特定的实施方式中由SEQ ID N0:3表示。在另一个实施方式中，包含至少一部 分5’非翻译区的多核苷酸片段来自小鼠酪蛋白基因；在一个特定的实施方式中由SEQ ID N0:8表示。在另一个实施方式中，包含至少一部分5’非翻译区的多核苷酸片段来自大 鼠酪蛋白基因；在一个特定的实施方式中由SEQ ID NO :9表示。在另一个实施方式中， 包含至少一部分5’非翻译区的多核苷酸片段来自绵羊酪蛋白基因；在一个特定的实施 方式中由SEQ ID N0:10表示。在其它实施方式中，包含至少一部分5’非翻译区的多核苷 酸片段来自水牛酪蛋白基因、山羊酪蛋白基因、马酪蛋白基因、野猪酪蛋 白基因、骆驼酪蛋白基因、兔酪蛋白基因或犬酪蛋白基因。包含酪蛋白基因5’非翻译区的至少一部分的多核苷酸片段的长度可以为至少约 25个核苷酸。在其它实施方式中，包含至少一部分5’UTR的酪蛋白基因的多核苷酸片段的 长度可以为至少约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、85、90、100个或更多个核苷酸。在另 一实施方式中，包含酪蛋白基因5’UTR的至少一部分的多核苷酸片段可以代表至少约50% 的天然5’ UTR序列。在其它实施方式中，包含酪蛋白基因5’ UTR的至少一部分的多核苷 酸片段可以代表至少约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的天然 5’ UTR序列。在另一实施方式中，包含酪蛋白基因5’ UTR的至少一部分的多核苷酸片段可
17以代表整个天然5’ UTR序列。在其它实施方式中，各组件(包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2个内含子 的多核苷酸片段和包含一个酪蛋白基因5’UTR的至少一部分的多核苷酸片段)的功能变体 用来构建合成5’UTR。功能变体包括取代、插入和缺失变体及其组合。取代变体是指核苷 酸序列中至少一个碱基被去除并有一个不同碱基插入其位置的那些变体。核酸的插入变体 是指在序列的预定位置上引入一个或多个核苷酸的那些变体。核酸的缺失变体的特征在于 从核酸中去除一个或多个核苷酸。可以存在取代、缺失或插入的任何组合，只要组件的功能 维持大致相同，即当功能变体用于本发明合成5’ UTR时，可以使感兴趣的序列、合成基因或 转基因的表达增强。此外，可以用与本文公开的包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2个内含子的 多核苷酸片段的特定实施方式(SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4、SEQID NO :5和SEQ ID NO 6) 同源的序列，以及与包含酪蛋白基因5’ UTR的至少一部分的多核苷酸片段的特定实施方式 (SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :8、SEQID NO :9和SEQ ID NO 10)同源的序列来构建合成5，UTR。 如前所述，构建合成5’ UTR的片段的合适来源包括任何真核物种的肌质网/内质网钙ATP 酶基因和任何哺乳动物的酪蛋白基因。在一个实施方式中，包含肌质网/内质网钙ATP酶 基因的第2个内含子的多核苷酸片段衍生自犬SERCA2、小鼠SERCA2或人SERCA2的同源物。 在另一实施方式中，包含酪蛋白基因5’ UTR的至少一部分的多核苷酸片段来自牛酪蛋 白、小鼠酪蛋白、大鼠酪蛋白或绵羊酪蛋白的同源物。检索和鉴定肌质网/内质网钙ATP酶同源物或酪蛋白5’UTR同源物的方法为本领 域技术人员所知。此类方法包括将SEQ ID NO :2-6和8-10表示的序列以计算机可读形式 与公共数据库和互联网，例如MIPS、GenBank或EMBL核酸序列数据库中的序列进行比较，序 列的比对或比较采用本领域公知的算法，例如GAP(Needleman和Wunsch，J. MoL Biol. 48 ； 443453(1970))、BESTFIT(Miller, ff.，Myers, E. ff.禾口 Lipman, D. J.，J. MoL Biol. 215 403-410 (1990))、FASTA 和 TFASTA (ff. R. Pearson 和 D. J. Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 =2444-2448(1988)) 实施BLAST分析的软件是美国国家生物技术信息中心的公众可得 资源。合适的同源物可以通过使用BLAST默认参数(BL0SUM62矩阵，空位开放罚分11和空 位延伸罚分1)鉴定。此外，犬、人或小鼠SERCA2的同源物也可以通过在SERCA2基因的保守序列上进行 检索来鉴定。例如，犬SERCA2的外显子3的全序列，例如SEQID N0 11可以在BLAST检索 中用作查询序列。可以预见，与将包含内含子序列的序列用作查询序列相比，在BLAST检索 中将外显子序列作为查询序列会获得更多的SERCA2同源物。相似地，牛、小鼠、大鼠或绵羊
酪蛋白的同源物也可以通过将编码部分作为查询序列进行检索而鉴定。也可分析基因组序列以便鉴定肌质网/内质网钙ATP酶同源物或酪蛋白5’UTR同 源物。有若干算法和软件工具可用以鉴定原始DNA序列中的基因。此类工具通常将对DNA 序列统计参数的分析与基于同源性鉴定数据库中同源序列的方法结合在一起。虽然单用 这些方法对于良好预测无一是可靠的，但将多种程序结合通常可以获得良好结果。此类工 具在互联网上属于公共可用的资源，公知例子包括GeneMark(Borodovsky，M.和Mclninch J. GeneMark parallel Gene Recognition for both DNA Strands (DNA 链的平行基因识别).Computers&Chemistry，17，123-133 (1993))、基因定位器和内插马尔科夫模型(Gene Locator and Interpolated MarkovModeler) (GLIMMER) (A. L. Delcher 等，Improved microbial geneidentification with GLIMMER(利用 GLIMMER 改进微生 物基因鉴定).Nucleic Acids Research, 27,4636-4641. (1999))、基因识别和装配因特网 连接(Gene Recognition and Assembly Internet Link) (GRAIL)、基因扫描(GenScan) (Burge, C.禾口 Karlin, S.Prediction of complete gene structures inhuman genomic DNA(人基因组DNA中完整基因结构的预测).J.MoL Biol. 268，78-94 (1997))以及基因构 建(GeneBuilder)(Milanesi L.等，GeneBuilder :interactive in silico prediction of genes structure (基因构建基因结构的silico预测中的交互作用).Bioinformatics， 15(7) :612-621(1999))。组合分析可以由 TIGR 组合程序(J.E.Allen 等，Computational gene prediction using multiplesources of evidence (利用多证据来源的计算机基因 预测).Genome Research, 14(1)，142-148(2004))完成，它利用来自其它诠释软件，例如 GeneMark、GlimmerM、GRAIL、GenScan和Fgenes的输出结果对基因模型作出预测。它采用 统计算法来识别对应于基因模型的不同形式的证据。肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2个内含子可以通过常规方法鉴定，例如在成 对比对程序中将基因的基因组DNA序列与它的mRNA或cDNA序列进行比较。同源区域代表 外显子，而cDNA序列中缺乏但是基因组DNA中存在的间插序列则代表内含子。内含子序列 的开始和结束可以由其5’端侧翼的GT和3’端侧翼的AG确定。通过这种方法，由公开登 录号NM_001003214代表的犬SERCA2的mRNA序列可用于在犬SERCA2基因组序列中鉴定内 含子，而人和小鼠的SERCA2的mRNA序列(分别为NM_170665和NM_009722)则可以用来在 各自的基因组序列中鉴定内含子。肌质网/内质网钙ATP酶同源物或酪蛋白5’ UTR同源物也可以通过探测另一个 物种的基因组或cDNA片段文库而鉴定。例如，可以将感兴趣物种的基因组DNA切成大小合 适的片段以便插入所选载体，例如质粒或、载体。接着，用合适的限制酶对载体进行消化， 之后与基因组片段的完整混合物进行连接。用载体转化细菌细胞，再将其涂布在琼脂糖平 板上。然后将菌落或噬菌斑DNA转印到膜上。在一个实施方式中，将由SEQ ID N0:2-6和 8-10所示的片段或其一部分用作标记探针，与含有同源序列的文库的克隆DNA进行杂交。 相似的步骤可以用来筛选cDNA文库。此外，可以将由SEQID N0 :2_6和8_10所示的片段或 其一部分用作基因组或cDNA Southern杂交实验的标记探针来鉴定同源物。在其它实施方 式中，更为保守的序列用作Southern杂交实验的探针或筛选文库，例如包含肌质网/内质 网钙ATP酶基因(例如，SEQ ID N0:11)或酪蛋白基因的编码区或其一部分的序列。可以通过适当组合温度、盐浓度、甲酰胺百分比，降低杂交实验的严谨性来选择合 适的杂交条件以允许一个片段与来自另一个物种的探针进行杂交(部分错配的探针_靶序 列杂交体)。例如，可以通过降低温度或升高盐浓度来降低杂交实验的严谨性。确定合适杂 交条件的步骤是本领域的公知技术，在Sambrook (2001)Molecular Cloning :a laboratory manual (分子克隆实验室手册)，第3版，冷泉港实验室出版社，CSH，纽约中有描述。本发明的另一个实施方式是与SEQ ID N0:l_10之一所示多核苷酸具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的多核苷酸。本发明的另一实施方式是包含SEQ ID NO :2和4-6之一所示多核苷酸与SEQ ID NO 3和8-10之一所示多核苷酸的合成5，UTR。
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本发明的另一实施方式是包含与SEQ ID NO :2和4-6之一所示多核苷酸有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的多核苷酸，以及与 SEQ ID NO :3 和 8-10之一所示多核苷酸有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多核 苷酸的合成5，UTR。本发明的另一个实施方式是包含与SEQ ID NO :1所示多核苷酸具有至少80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸的合成基因构建体。本发明的另一个实施方式是包含与SEQ ID NO :7所示多核苷酸具有至少80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸的合成基因构建体。在另一个实施方式中，所述合成5’ UTR序列缺乏妨碍插入弗吉尼亚州布莱克斯堡 的英特列克星敦公司(Intrexon Corp.，Blacksburg，VA)的UltraVector产生系统的限制 性位点，如通过引用纳入本文的W02007/038276所述。在一个特定实施方式中，所述合成 5，UTR序列缺乏下列限制性内切酶的内部识别序列AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、 MIuI、SnaB I,Not I.Sal I、Swa I、Rsr II.Bsiff I、Mfe I、Nhe I、Nsi I、CIaI、Nde I、Nsi I、Kpn I、Nco I 和 Pst I。合成5’ UTR序列任选在5’端和3’端具有限制性位点，帮助序列克隆入载体。在 一个特定的实施方式中，所述合成5’ UTR序列在5’端含有Mlu I识别序列和在3’端含有 Mfe I识别序列。在一个特定的实施方式中，所述合成5，UTR由SEQ ID N0:1表示。SEQID N0:1包 含下列特征Mlu I限制性位点、SEQ ID N0:2、Kpn I限制性位点、SEQ ID N0:3、Mfe I限 制性位点。SEQ ID N0:1如图2A所示。在另一特定的实施方式中，所述合成5，UTR由SEQ ID N0:7表示。SEQID N0:7包 含下列特征Asc I限制性位点、Mlu I限制性位点、SEQ ID NO :4、Kpn I限制性位点、SEQ ID NO :3、Mfe I限制性位点。SEQ ID NO :7如图2B所示。在一个实施方式中，所述合成5’ UTR序列的长度少于约500个核苷酸。在另一个 实施方式中，所述合成5’ UTR序列的长度少于约400个核苷酸。在另一个实施方式中，所 述合成5’ UTR序列的长度少于约350个核苷酸。在另一个实施方式中，所述合成5’ UTR序 列的长度少于约300个核苷酸。在另一个实施方式中，所述合成5’ UTR序列的长度少于约 240个核苷酸。在另一个实施方式中，所述合成5’ UTR序列的长度少于约200个核苷酸。在本发明的另一个实施方式中，所述合成5’ UTR多核苷酸是真核表达载体的组 分，包含第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，其中a.第一多核苷酸片段包含第一真核基因的至少一个剪接位点；b.第二多核苷酸片段包含第二真核基因的5’非翻译区(5’ UTR)的至少一部分； 以及c.第一多核苷酸片段位于第二多核苷酸片段的5’端。在一个实施方式中，包含至少一个剪接位点的多核苷酸片段是本文所述的真核肌 质网/内质网钙ATP酶基因的片段。在另一个实施方式中，包含至少一部分5’非翻译区的 多核苷酸片段是本文所述的酪蛋白基因的片段。本发明还提供了包含本文所述合成5’UTR的载体。考虑的载体包括本文所述合成 5’ UTR多核苷酸序列的任一实施方式。例如，本发明的一个实施方式是包含合成5’ UTR多核苷酸序列的载体，所述合成5’ UTR多核苷酸序列包含含有真核肌质网/内质网钙ATP酶 基因的第2内含子的多核苷酸片段与含有酪蛋白基因5’ UTR的至少一部分的多核苷酸片 段。本发明的另一个实施方式是包含与SEQ ID NO: 1-10之一所示多核苷酸具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸的载体。在另一个实施方式中，所述载体是包含含有合成5’ UTR的合成基因构建体的表达 载体。合成基因构建体可以包含侧接合成5’ UTR—端的启动子和侧接合成5’ UTR另一端 的待表达感兴趣序列。合成基因构建体还可包含一个多聚腺苷酸化位点。例如，本发明的另一个实施方式是包含合成基因构建体的表达载体，所述合成基 因构建体沿5’端至3’端方向包含启动子、嵌合多核苷酸和待表达的感兴趣序列，其中a.嵌合多核苷酸包含含有至少一个剪接位点的第一真核基因的多核苷酸片段，与 含有至少一部分5’非翻译区的第二真核基因的多核苷酸片段；和b.嵌合多核苷酸位于启动子和感兴趣的待表达序列之间，其中第一真核基因的多 核苷酸片段朝启动子定位，第二真核基因的多核苷酸片段朝待表达的感兴趣序列定位。图3A显示插入载体骨架的本发明合成基因构建体的一个实施方式。在这个实施 方式中，图3A中的SPL指包含至少一个剪接位点的多核苷酸片段，UTR指包含至少一部分 5’非翻译区的多核苷酸片段。SPL和UTR—起构成合成5’UTR。合成基因构建体的启动子 定位成指导合成5’ UTR和感兴趣序列的RNA表达。此外，待表达的感兴趣序列包含翻译启 动的起始密码子。包含此载体结构的示范性表达载体由图10和图11显示。图10中载体的序列由 SEQ ID NO 12提供；图11中载体的序列由SEQ ID NO 13提供。在另一个实施方式中，所述载体是沿5’端至3’端方向包含启动子、嵌合多核苷酸 和克隆位点的表达载体，其中a.嵌合多核苷酸包含含有至少一个剪接位点的第一真核基因的多核苷酸片段，与 含有至少一部分5’非翻译区的第二真核基因的多核苷酸片段；以及b.嵌合多核苷酸位于启动子和克隆位点之间，其中第一真核基因的多核苷酸片段 朝启动子定位，第二真核基因的多核苷酸片段朝克隆位点定位。表达载体的克隆位点可以包含一个或多个独特的限制性位点，从而可插入感兴趣 序列。在另一实施方式中，克隆位点包含重组酶附着位点，从而感兴趣序列可通过位点特异 性重组方式插入。所述表达载体的一个实施方式如图3B所示。在图3B中，SPL是指包含剪接位点 的多核苷酸片段，UTR是指包含至少一部分5’非翻译区的多核苷酸片段。SPL和UTR—起 构成合成5，UTR。表达载体中包含剪接位点的多核苷酸片段可以是任何真核基因的片段。可用于表 达载体内的示范性多核苷酸片段包括含有本文所述真核肌质网/内质网钙ATP酶基因的剪 接位点的多核苷酸片段。此外，包含至少一部分5’非翻译区的多核苷酸片段可以是任何真 核基因的片段。可以用于表达载体内的示范性多核苷酸片段包括含有本文所述酪蛋白基因 的5’非翻译区的至少一部分的多核苷酸片段。本发明的表达载体还可包含一个或多个位于感兴趣序列或克隆位点下游的附加
21多核苷酸序列，以便与感兴趣序列所编码多肽产生框内融合。例如，感兴趣序列下游的附加 多核苷酸可以编码表位标签、报道分子或纯化标签。表位标签为本领域已知，包括myc、血 凝素(HA)和FLAG。报道分子的例子包括绿色荧光蛋白及其变体、半乳糖苷酶(LacZ)、 葡糖苷酸酶(Gus)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)和荧光素酶。纯化标签的例子包括His6 和GST。表达载体还可以包含位于感兴趣序列或克隆位点下游的polyA位点。根据所需结果，含有合成5’ UTR的表达载体的启动子部分可以是组成型启动子、 非组成型启动子、组织特异性启动子(组成型或非组成型)、致病或疾病相关启动子、发育 特异性启动子或选择性调控启动子，例如可诱导启动子。不同的选择性调控启动子受到不 同机制的调控。例如，当用四环素处理含有启动子和其它必需的细胞因子的细胞时，四环 素诱导启动子被激活而表达下游的编码序列。其它可诱导启动子被其它药物或因子激活。 RHE0SWITCH是一个可诱导启动子系统，可以从马萨诸塞州伊普斯维奇市新英格兰生物实验 室(New England Biolabs, Ipswich, MA)购得。温度敏感性启动子也可以用来增强或降低 基因表达。本发明的一个实施方式包括含有表达受可诱导启动子调控的合成5’UTR的基因 构建体。本发明包括的实施方式中，包含合成5’ UTR的载体骨架包含适用于在真核细胞中 表达感兴趣序列的序列。在一个实施方式中，包含合成5’ UTR的载体骨架包含适用于在哺 乳动物细胞中表达感兴趣序列的序列。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件，例如连接 于待表达的感兴趣序列的复制起点、合适的启动子和增强子，以及其它5’或3’侧翼非转录 序列和5’或3’非翻译序列，例如必需的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止序 列。哺乳动物表达载体的例子为本领域所公知，包括英杰公司(Invitrogen)的pcDNA3和 pRSVneo(ATTC)。例如，含有合成5’ UTR的表达载体的启动子部分可以是动物或哺乳动物启动 子。动物或哺乳动物启动子的例子包括SV40早期(SV40e)启动子区域，包含于劳氏肉 瘤病毒(RSV)的3’长末端重复序列(LTR)中的启动子，E1A启动子或腺病毒(Ad)主要 晚期启动子(MLP)基因，巨细胞病毒(CMV)早期启动子，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶 (TK)启动子，延伸因子la (EF1)启动子，磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，泛素(Ubc)启 动子，白蛋白启动子，小鼠金属硫蛋白-L启动子和转录调控区域的调控序列，遍在启动子 (ubiquitouspromoter) (HPRT、波形蛋白、0 -肌动蛋白、微管蛋白等)，中间丝的启动子(索 蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP等)，治疗基因的启动子(MDR相关、CFTR或因子VIII —类因子 等)，致病或疾病相关启动子，表现出组织特异性并已用于转基因动物的启动子，例如在胰 腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因调控区域；在胰腺0细胞中具有活性的胰岛 素基因调控区域，在淋巴细胞中具有活性的免疫球蛋白基因调控区域，在睾丸，乳腺，淋巴 和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺瘤病毒调控区域；白蛋白基因，在肝脏中具有活性的Apo AI和Apo All调控区域，在肝脏中具有活性的a-胎蛋白基因调控区域、在肝脏中具有活性 的a 1-抗胰蛋白酶基因调控区域，在骨髓细胞中具有活性的球蛋白基因调控区域，在 脑的少突胶质细胞中具有活性的髓磷脂碱蛋白基因调控区域，在骨骼肌中具有活性的肌球 蛋白轻链-2基因调控区域，在下丘脑中具有活性的促性腺激素释放激素基因调控区域，丙 酮酸激酶启动子，绒毛蛋白启动子，脂肪酸结合肠蛋白的启动子，平滑肌细胞肌动蛋白 启动子等。表达载体内的启动子可以通过添加增强子或调控序列等得到修饰。
含有合成5’ UTR的表达载体的感兴趣序列部分可以是来自任何真核基因或其部 分的序列、或天然或非天然的编码或非编码序列。可用于本发明的编码序列的非限制性例 子包括报道分子(例如荧光素酶、半乳糖苷酶、荧光蛋白)、表位、实验多肽或治疗多肽 的编码序列。感兴趣核酸序列的其它例子包括RNA分子，例如小RNA、微小RNA、核糖体RNA、 治疗RNA和核酶。在本发明的另一方面，多个非冗余的合成5’ UTR用于单个载体内的多基因构建体 中。在另一实施方式中，所述载体是一种包含含有合成5’ UTR的合成基因构建体的基 因治疗载体。基因治疗载体可以是任何本领域已知的基因治疗载体，包括非病毒载体或病 毒载体，例如腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体或逆转录病毒载体。如图3A所示，合成基 因构建体可以包含侧接合成5’ UTR的5’端的启动子和侧接合成5’ UTR的3’端的感兴趣 治疗基因。启动子可以是组成型启动子、组织特异性启动子和可诱导启动子，或本文所述的 其它启动子。可以包含入基因治疗载体的感兴趣治疗基因类别的例子包括但并不限于，细 胞因子、趋化因子、激素、抗体、工程改造的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、酶、免 疫协同刺激分子、免疫调节分子、靶蛋白反式显性负突变体、毒素、条件性毒素、化疗或放疗 增敏剂、抗原、肿瘤抑制蛋白、生长因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白或其变体 的编码基因。感兴趣治疗基因的具体例子数量众多，包括但并不限于促红细胞生成素、胰岛 素、VEGF、FGF、因子 VIII、因子 IX、内皮抑素、血管抑素、GDNF、BDNF、NGF、EGF、CFTR、PEGF、 IFN-a 、IFN-y、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL_21、GM-CSF、G-CSF、M_CSF、 TNF-a、TNF-0、TGF-a、TGF-0、CD40、水蛭素以及类似基因。本发明还提供了包含本发明多核苷酸序列的试剂盒。例如，在一个实施方式中，本 发明提供包含至少一段与SEQ ID NO :1-10之一所示多核苷酸具有至少80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸的试剂盒。试剂盒可以包含前述可以进行组 装的载体或组分。例如，试剂盒可包括可以在限制酶消化作用下线性化的载体，从而允许使 用者插入合成5’ UTR或合成5’ UTR的各组件。试剂盒可以进一步包含其它供载体组装的 组分，例如限制酶、连接酶、缓冲液以及类似组分。本发明还提供在宿主细胞中表达基因产物或感兴趣序列的方法。例如，本发明的另一实施方式是表达基因产物的方法，包括用包含本文所述合成 5’ UTR的合成基因构建体转染宿主细胞。本发明的另一实施方式是表达基因产物的方法，包括用包含与SEQ IDN0 :1或SEQ ID NO 7所示多核苷酸具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多 核苷酸的合成基因构建体转染宿主细胞。本发明的另一个实施方式是在宿主细胞中表达感兴趣序列的方法，包括下列步 骤a.用包含本文所述合成基因构建体的表达载体转染宿主细胞；以及b.在适合实现所述感兴趣序列表达的条件下培养所述宿主细胞。宿主细胞中表达感兴趣序列的另一方法中，感兴趣序列可以插入包含启动子、合 成5’ UTR和克隆位点的本文所述表达载体。例如，本发明的另一个实施方式是在宿主细胞中表达感兴趣序列的方法，包括下列步骤a.将待表达的感兴趣序列插入包含启动子、合成5’UTR和克隆位点的本文所述表 达载体的克隆位点，其中待表达的感兴趣序列包括RNA或多肽编码序列；b.用所述表达载体转染宿主细胞；以及c.在适合实现所述感兴趣序列表达的条件下培养所述宿主细胞。在宿主细胞中表达所感兴趣序列的另一方法中，合成5’ UTR可以插入表达载体的 启动子和感兴趣序列之间，使得合成5’ UTR中包含真核基因剪接元件的部分朝启动子定 位，包含另一真核基因的5’ UTR的至少一部分的部分朝感兴趣的序列定位。例如，本发明的另一实施方式是在宿主细胞中表达感兴趣序列的方法，包括下列 步骤a.将本文所述的合成5’ UTR插入到表达载体的启动子和待表达的感兴趣序列之 间，其中待表达的感兴趣序列包括RNA或多肽编码序列；b.用所述表达载体转染宿主细胞；以及c.在适合实现所述感兴趣序列表达的条件下培养所述宿主细胞。本发明的另一实施方式是在宿主细胞中表达感兴趣序列的方法，包括以下步骤a.将与SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :7所示多核苷酸具有至少80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸插入到表达载体的启动子和待表达的感兴趣 序列之间，其中待表达的感兴趣序列包括RNA或多肽编码序列；b.用所述表达载体转染宿主细胞；以及c.在适合实现所述感兴趣序列表达的条件下培养所述宿主细胞。本发明的方法可以通过常规技术实现。除另外阐述外，重组DNA技术的操作根 据(Sambrook,同上)或 Ausubel 等(1994), Current Protocols inMolecular Biology, Current Protocols (最新分子生物学方法)的卷1和2中描述的标准操作程序进行。本发明还提供了包含合成5’UTR的宿主细胞。考虑的宿主细胞包括本文描述的合 成5 ’ UTR多核苷酸序列的任一实施方式。例如，本发明的另一个实施方式是包含合成5，UTR 多核苷酸序列的宿主细胞，所述合成5’ UTR多核苷酸序列包含与含有酪蛋白基因5’ UTR区 的至少一部分的多核苷酸片段相融合的含有真核肌质网/内质网钙ATP酶基因第2内含子 的多核苷酸片段。在一个实施方式中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。在特定的实施方式中，宿主细 胞是仓鼠细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、兔细胞、猫细胞、狗细胞、牛细胞、山羊细胞、奶牛细胞、 猪细胞、马细胞、绵羊细胞、猿细胞、猴细胞、黑猩猩细胞或人细胞。包含合成5’ UTR的本发 明宿主细胞的特定例子包括但并不限于A549、ARPE-19、CH3/10T1/2、C2C12、aco2、C0S7、 FL-83B、HEK-293、HEPG2、HeLa、HT-1080、MDCK、P19、SH-SY5Y、Sol 8 和 U87。本发明的宿主细胞被包含合成5’UTR的多核苷酸转染。宿主细胞转染是本领域的 公知技术，可以通过多种方法来实现，包括但并不限于电穿孔、病毒感染、质粒/载体转染、 非病毒载体介导的转染、粒子轰击以及类似方法。所需基因产物的表达包括在合适的条件 下培养转染的宿主细胞以及测量转染基因的表达。培养条件和真核细胞中基因表达的操作 程序是在本领域的公知技术。本发明还提供了包含本文所述合成5’ UTR的宿主生物体。合成5’ UTR可以在体
24内直接插入宿主生物体的基因组中。例如，在一个实施方式中，通过将含有本发明的合成 5’ UTR的载体直接引入宿主生物体，从而合成5’ UTR引入宿主生物体以取代野生型5’ UTR， 合成5’ UTR的侧翼序列与被取代的野生型5’ UTR的侧翼序列同源。在另一实施方式中，通 过将包含基因构建体的整合载体引入宿主生物体，从而包含合成5’ UTR的合成基因构建体 插入宿主生物体的基因组内。可以控制插入的组织特异性，例如通过载体的给予途径。在另 一实施方式中，通过将包含基因构建体的非整合载体引入宿主生物体，从而包含合成5’UTR 的合成基因构建体引入宿主生物体。合成5’ UTR或包含合成5’ UTR的合成基因构建体也可以通过离体方法引入宿主 生物体。例如，可以用包含合成5’ UTR的载体转化自体或非自体细胞，然后引入宿主生物 体。在另一实施方式中，利用位点特异性重组酶系统，例如Cre/loxP系统将合成 5’ UTR引入宿主细胞基因组或生物体。在此实施方式中，可以通过将修饰的lox位点引入 基因组和阻止整合入的DNA被再次切除的供体载体而将DNA片段，例如将包含合成5’ UTR 的片段或含有合成5’UTR的合成基因构建体稳定整合到基因组(参见通过引用纳入本文的 见 Metzger 和 Feil，CurrentOpinion in Biotechnology，10 :470_476 (1999))。此外，异种 特异性loxP位点可以引入("floxed")基因组以侧接待取代的区域(Metzger和Feil，同 上)，例如供体质粒上的内源5’UTR和合成5’UTR。含引入基因组的loxP染色体位点的转 基因动物可以与在组织或细胞特异性启动子驱动下表达Cre重组酶的转基因小鼠进行杂 交，此技术为本领域已知技术。对此杂交后代给予包含合成5’ UTR的供体质粒可以在特定 组织或类型细胞中产生整合。在其它实施方式中，利用其它位点特异性重组酶系统将合成5’ UTR引入到宿主生 物体的基因组，例如通过引用纳入本文的美国专利申请公开号20060172377公开的系统。本发明的另一实施方式是包含与SEQ ID N0:l_10所示多核苷酸具有至少80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸的非人生物体。本发明的另一实施方式是包含含有与SEQ ID N0:l_10所示多核苷酸具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸的合成基因构建体的非人 类生物体。此外，可以构建包含合成5’ UTR或含有合成5’ UTR的基因构建体的转基因生物， 例如小鼠。例如，向受精的小鼠卵母细胞原核注射包含合成5’ UTR的合适载体，可以产生 转基因小鼠。或者，可以将载体引入到小鼠胚胎干细胞，然后再将胚胎干细胞注射到小鼠囊 胚。接着，转化的合子或囊胚移植到假孕雌鼠体内。采用PCR或Southern杂交在最后产生 的幼崽中筛选所述多核苷酸。之后，杂合的转基因动物可以相互杂交，产生纯合子。在一个 实施方式中，通过同源重组，合成5’ UTR取代了转基因动物中感兴趣基因的内源5’ UTR。因此，本发明的另一实施方式是包含合成5’ UTR多核苷酸序列的转基因动物，合 成5’ UTR多核苷酸序列包含与含有酪蛋白基因5’ UTR的至少一部分的片段相融合的含有 第2内含子的真核肌质网/内质网钙ATP酶基因的片段。本发明的另一个实施方式是包含与SEQ ID N0:l_10所示多核苷酸具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸的转基因生物体。本发明的另一个实施方式是包含含有与SEQ ID NO :1_10所示多核苷酸具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸的合成基因构建体的转基 因生物体。下列实施例是对本发明实施方式的说明，并不以任何实施方式限制本发明。对于 本领域普通技术人员显而易见的其它适当改进和改动属于本发明的构思和范围之内。实施例实施例1构建三种不同形式的合成5’UTR，插入载体中，其中人巨细胞病毒(CMV)启动子指 导半乳糖苷酶报道基因(LacZ编码序列)表达。在第一种形式中，polyG(12)作为合 成5’ UTR插入启动子和0 -半乳糖苷酶报道基因之间(图9)。在第二种形式中，称为5U2 的SEQ ID N0:1作为合成5，UTR插入启动子和0 -半乳糖苷酶报道基因之间(图10)。在 第三种形式中，称为INXN-1的SEQ ID NO 7作为合成5，UTR插入启动子和0 -半乳糖苷 酶报道基因之间(图11)。各转基因在3’端调控区域具有SV40多聚腺苷酸化序列。包含 5U2或INXN-1合成5，UTR的各载体的通用形式如图3A所示。用各载体瞬时转染HEK-293 细胞和1080细胞。根据以下方案，使用应用生物系统公司(Applied Biosystem)的Galacto-Star 系统(目录号 BM100S、BM300S、BM2500S、BY100S、BY300S、BY2500S)测量细胞的 3 -半 乳糖苷酶。室温下，将细胞在50 PL裂解液(Galacto-Star 系统)中裂解10分钟。将 100 uL Galacton-Star 底物等分置于白色不透明96孔微板的孔中。往100 y L的 Galacton-Star 底物中加入10 y L细胞裂解液，温育30分钟。用微板光度计检测光信号。HEK-293细胞的结果如图4所示。与含有polyG作为合成5，UTR的载体相比，0 -半 乳糖苷酶报道基因在用含有INXN-1或5U2合成5’ UTR的载体转染的HEK-293细胞中的表 达显著增强。图5显示，含有polyG作为5’ UTR的载体相比，报道基因在用含有INXN-1或 5U2的载体转染的1080细胞中表达增强。转基因在含有polyG 5’ UTR的载体中的表达水 平与其在不含5’ UTR的对照(VVN-2712，图7，数据见图12)中的表达水平相似。用于测量 实验背景的阴性对照是不含半乳糖苷酶的载体(VVN-2713，图8，数据见图12)。图6显 示，与含有polyG作为5’ UTR的合成报道基因相比，含有INXN-1合成5’ UTR的合成半 乳糖苷酶报道基因在HEK-293细胞和1080细胞中的表达高约7. 5倍和2. 5倍；而与含有 polyG作为5，UTR的合成报道基因相比，含有5U2合成5，UTR的合成报道基因在HEK-293 细胞和1080细胞中的表达分别高约8倍和约2. 5倍。实施例2采用blastn算法和默认参数，将SEQ ID NO 4作为查询序列在GenBank非冗余核 苷酸公共数据库中进行检索，得到表1列出的下列代表性SERCA2同源物。SEQ ID N0:4表 示SEQ ID NO 7所示合成5，UTR的组件。表1 利用公共可用程序DNA Strider 1. 4f 17 (见 Marck，C，Nucleic AcidsResearch 16(5) 1829-1837(1988)和 Douglas，S, Molecular Biotechnology3(1) :37_45(1995)对 DNA Strider的说明)的成对比对功能，将表1的BLAST检索结果中鉴定的马基因组的片 段(公开登录号AM137440)与马SERCA2的mRNA序列NM_001081765进行比较。序列比对 采用Blocks方法，对错配罚分和空位罚分采用默认参数。马基因组和mRNA序列的比对部 分如图13所示，箭头标出部分为马SERCA2基因的第2内含子的起点和终点。相对内含子 5’的同源区域表示外显子2，相对内含子3’的同源区域表示外显子3。然后合成代表包含第2个内含子的马SERCA2基因片段的寡核苷酸，并利用重组 DNA技术将其与SEQ ID NO 3融合，构建出合成5，UTR。之后将合成5，UTR插入到载体中 人巨细胞病毒启动子(CMV)和荧光素酶报道基因之间。接着，用此载体和带有polyG 5'UTR 的对照载体转染3T3细胞。用光度计检测荧光素酶活性，并在两套细胞之间进行相对光单 位的比较。与用含有polyG 5’ UTR的载体转染的细胞相比，报道基因在用含有合成5’ UTR 的载体转染的细胞中表达增强。实施例3采用blastn算法和默认参数，将SEQ ID NO 3作为查询序列在GenBank非冗余核 苷酸公共数据库中进行检索，得到在表2中列出的下列代表性同源物。SEQ ID N0:3表示 由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 7表示的合成5，UTR的牛酪蛋白5，UTR组件。表2 表1中列出的各代表性SERCA2基因的第2内含子是通过使用成对比对程序将基 因组序列与其各自的mRNA序列进行比较而鉴定的。合成的第一套寡核苷酸包含各SERCA2 同源物的SERCA2的第2内含子。然后合成的第二套寡核苷酸代表表2中鉴定的各0 -酪 蛋白同源物的5’ UTR的至少一部分。5’ UTR部分包含表2的BLAST结果中鉴定的查询覆 盖范围的部分。然后采用重组DNA技术，将包含SERCA2的第2内含子的第一套寡核苷酸中 的独特一员或SEQ ID NO 2和4-6所示寡核苷酸与包含5，UTR的至少一部分的第二套寡 核苷酸中的独特一员或SEQ ID N0:3和8-10所示寡核苷酸相融合，其中包含SERCA2的第 2内含子的寡核苷酸融合在包含部分5’ UTR的寡核苷酸的5’端，构建出一套合成5’ UTR。 之后通过PCR在合成5’ UTR的各末端添加限制性位点。再将各独特的合成5’ UTR插入载 体中人CMV启动子和lacZ启动子之间。接着用各载体以及含polyG 5’ UTR的对照载体转 染96孔板中的1080细胞。用实施例1中描述的试验检测半乳糖苷酶活性，再比较相 对于polyG 5’ UTR的表达水平。在完整描述了本发明之后，本领域普通技术人员应该理解，可以在广泛和等同的 条件和其它参数范围内实施本发明，而不影响本发明或其任何实施方式的范围。
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权利要求
一种嵌合多核苷酸，其包含第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，其中a.所述第一多核苷酸片段包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2内含子；b.所述第二多核苷酸片段包含酪蛋白基因的5’非翻译(5’UTR)区的至少一部分；和c.所述第一多核苷酸片段位于所述第二多核苷酸片段的5’端。
2.如权利要求1所述的嵌合多核苷酸，其特征在于，所述第一多核苷酸片段还包含肌 质网/内质网钙ATP酶基因的外显子2的至少一部分。
3.如权利要求1所述的嵌合多核苷酸，其特征在于，所述第一多核苷酸片段还包含肌 质网/内质网钙ATP酶基因的外显子3的至少一部分。
4.如权利要求1所述的嵌合多核苷酸，其特征在于，所述第一多核苷酸片段是犬 SERCA2基因、人SERCA2基因或小鼠SERCA2的片段，所述第二多核苷酸片段是牛β _酪蛋白 基因、小鼠酪蛋白基因、大鼠酪蛋白基因或绵羊酪蛋白基因的片段。
5.如权利要求1所述的嵌合多核苷酸，其特征在于，所述第一多核苷酸片段与SEQID NO 2和4-6之一具有至少80%相同，所述第二多核苷酸片段与SEQ ID NO 3和8_10之一 具有至少80%相同。
6.如权利要求1所述的嵌合多核苷酸，其特征在于，所述第一多核苷酸片段包含与含 有SEQ ID NO 4的至少60个连续核苷酸的多核苷酸具有至少80%相同的多核苷酸，所述 第二多核苷酸包含与含有SEQ ID NO 3的至少30个连续核苷酸的多核苷酸具有至少80% 相同的多核苷酸。
7.如权利要求1所述的嵌合多核苷酸，其特征在于，所述第一多核苷酸包含SEQID NO :2，所述第二多核苷酸包含SEQ ID NO :3。
8.如权利要求1所述的嵌合多核苷酸，其特征在于，所述第一多核苷酸包含SEQID NO :4，所述第二多核苷酸包含SEQ ID NO :3。
9.如权利要求1所述的嵌合多核苷酸，其特征在于，所述嵌合多核苷酸与SEQID NO 1具有至少80%相同。
10.如权利要求1所述的嵌合多核苷酸，其特征在于，所述嵌合多核苷酸与SEQID NO 7具有至少80%相同。
11.一种真核表达载体的合成5’ UTR多核苷酸组件，其包含第一多核苷酸片段和第二 多核苷酸片段，其中a.所述第一多核苷酸片段包含第一真核基因的至少一个剪接位点；b.所述第二多核苷酸片段包含第二真核基因的5’非翻译区(5’UTR)的至少一部分；禾口c.所述第一多核苷酸片段位于所述第二多核苷酸片段的5’端。
12.如权利要求11所述的合成5’UTR多核苷酸，其特征在于，所述第一多核苷酸片段 包含所述第一真核基因的内含子。
13.如权利要求12所述的合成5’UTR多核苷酸，其特征在于，所述第一多核苷酸片段 还包含所述第一真核基因5’侧接外显子的至少一部分。
14.如权利要求12所述的合成5’UTR多核苷酸，其特征在于，所述第一多核苷酸片段 还包含所述第一真核基因3’侧接外显子的至少一部分。
15.如权利要求11-14中任一项所述的合成5’UTR多核苷酸，其特征在于，所述第一真核基因是真核肌质网/内质网钙ATP酶基因，所述第二真核基因是酪蛋白基因。
16.如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸缺少下列 限制性内切酶的识别序列AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I,Asc I, MIu I, SnaB I, Not I.Sal I, Swa I, Rsr II, Bsiff I,Mfe I, Nhe I, Nsi I, Cla I, Nde I, Nsi I,Kpn I, Nco I 禾口 PstIo
17.如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸在5’端和 3’端包含限制性位点以帮助克隆入载体。
18.如权利要求16所述的多核苷酸，其特征在于，所述嵌合多核苷酸在5’端包含Mlu I的识别序列和在3’端包含Mfe I的识别序列。
19.包含如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸的载体。
20.包含如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸的合成基因构建体。
21.包含如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸的宿主细胞。
22.包含如权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸的非人类生物体。
23.包含如权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸的转基因生物体。
24.包含如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸的一种试剂盒。
25.一种包含合成基因构建体的表达载体，其中所述合成基因构建体沿5’端至3’端的 方向包含启动子、嵌合多核苷酸和感兴趣的表达序列，其中a.所述嵌合多核苷酸包含含有至少一个剪接位点的第一真核基因的多核苷酸片段，与 含有5’非翻译区的至少一部分的第二真核基因的多核苷酸片段；和b.所述嵌合多核苷酸位于所述启动子和待表达的感兴趣序列之间，其中所述第一真核 基因的多核苷酸片段朝所述启动子定位，所述第二真核基因的多核苷酸片段朝待表达的感 兴趣序列定位。
26.—种表达载体，其沿5’端至3’端的方向包含启动子、嵌合多核苷酸和克隆位点，其中a.所述嵌合多核苷酸包含含有至少一个剪接位点的第一真核基因的多核苷酸片段，与 含有5’非翻译区的至少一部分的第二真核基因的多核苷酸片段；和b.所述嵌合多核苷酸位于所述启动子和克隆位点之间，其中所述第一真核基因的多核 苷酸片段朝所述启动子定位，所述第二真核基因的多核苷酸片段朝所述克隆位点定位。
27.如权利要求25或26所述的表达载体，其特征在于，所述第一真核基因是肌质网/ 内质网钙ATP酶基因，所述第二真核基因是酪蛋白基因。
28.如权利要求25或26所述的表达载体，其特征在于，所述嵌合多核苷酸与SEQID NO :1或SEQ ID NO 7具有至少80%相同。
29.一种在宿主细胞中表达感兴趣序列的方法，包括下列步骤a.用如权利要求25所述的表达载体转染宿主细胞；和b.在适合实现所述感兴趣序列表达的条件下培养所述宿主细胞。
30.一种在宿主细胞中表达感兴趣序列的方法，包括下列步骤a.将待表达的感兴趣序列插入如权利要求26所述表达载体内的克隆位点；b.用所述表达载体转染宿主细胞；和c.在适合实现所述感兴趣序列表达的条件下培养所述宿主细胞。
31.如权利要求29或30所述的方法，其特征在于，所述第一真核基因是肌质网/内质 网钙ATP酶基因，所述第二真核基因是酪蛋白基因。
32.如权利要求29或30所述的方法，其特征在于，所述嵌合多核苷酸与SEQID NO=I 或SEQ ID NO :7具有至少80%相同。
全文摘要
本发明提供包含第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段的合成5’UTR，其中所述第一多核苷酸片段包含第一真核基因的至少一个剪接位点，所述第二多核苷酸片段包含第二真核基因的至少一部分5’非翻译区，所述第一多核苷酸片段位于所述第二多核苷酸片段的5’端。在一个实施方式中，所述第一多核苷酸片段包含肌质网/内质网钙ATP酶基因的第2内含子，所述第二多核苷酸片段包含真核酪蛋白基因的至少一部分5’非翻译区。当位于表达载体内的启动子和转基因之间时，所述合成5’UTR有利于增强转基因表达。本发明还提供包含合成5’UTR的载体和使用合成5’UTR增强转基因表达的方法。
文档编号C07H21/04GK101855233SQ200880116471
公开日2010年10月6日 申请日期2008年9月26日 优先权日2007年9月26日
发明者T·瑞德 申请人:英特瑞克斯顿股份有限公司