人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（ngal）的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种在毕赤酵母中制备人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的方法，包括如下步骤：提供编码NGAL的核苷酸序列；将所述NGAL的核苷酸序列克隆到不同的酵母表达载体中；将所述酵母表达载体转化至同一酵母宿主；诱导所述酵母宿主表达C端带有组氨酸标签的NGAL；纯化经步骤（4）处理后的NGAL。该方法表达量高，表达产物无需经过变性和复性，即可得到有活性的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL），并且后续的纯化步骤也简单方便。制备的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）可用于检测急性肾损伤的NGAL检测试剂盒。
【专利说明】人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基因重组人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的制备方法，具体地说，涉及一种在酵母中制备重组人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的方法。
【背景技术】
[0002]一、人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)[0003]人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin)为Iipocalin (载脂蛋白)家族的一个新成员，是Kjeldsen等人1993年在研究中性粒细胞明胶酶,基质金属蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9 ;即明胶酶B)时发现的。随后，NGAL cDNA及其全基因序列分别于1994和1997年被克隆鉴定。NGAL蛋白由一条多肽链构成，其分子量为25kD的糖蛋白，含有178个氨基酸残基。多肽链由N端的310-螺旋、C端的α螺旋和中间的八段反平行式β折叠构成了一个lipocalin家族特有的β折叠桶结构。NGAL既能够自身聚合形成46kD的同源二聚体，也能够与MMP-9聚合形成135kD的异源二聚体。在中性粒细胞中NGAL和MMP-9既有独立存在的方式，又有联合存在的方式。这提示NGAL和MMP-9既可以独立发挥作用，又可以相互结合在一起联合发挥功能。
[0004]NGAL参与多样的生化过程，涉及胚胎发育、细胞分化、炎症免疫应答、细胞凋亡、月旨质代谢、肿瘤的发生发展，特别是肿瘤的浸润转移等等。其主要功能为:1)参与炎症与天然免疫反应；2)保护调苄基质金属蛋白酶-9的活性；3)作为一种新型的铁离子转运载体，介导新的独特的跨膜转铁通路等等。此外，NGAL可能是人类的一种十分重要的癌蛋白，与食管癌等肿瘤密切相关。近年来，随着NGAL蛋白在人体组织细胞中广泛分布的认识，特别是在一些肿瘤组织细胞中该基因异常过度表达的发现，有关NGAL蛋白新功能的研究呈现出活跃发展趋势。
[0005]二、基因重组方法制备NGAL
[0006]传统方法从病人尿液中提取NGAL具有难以克服的缺点，例如:得率很低；批间差很大；存在生物安全隐患，难于工业化生产等。而基因工程方法来表达，生产重组蛋白质不会存在这些问题。最常用的基因工程蛋白表达系统包括大肠杆菌和酵母系统。
[0007]1、大肠杆菌表达系统
[0008]在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统。其主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过IPTG等诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。
[0009]对于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。
[0010]作为发展最早、目前应用最广泛的经典表达系统，大肠杆菌表达系统优点在于遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
[0011]大肠杆菌系统表达重组蛋白的操作步骤包括:
[0012]I)目的基因的取得:目的基因可以从适当的供体生物包括微生物、动物或植物中提取，也可以由化学合成法合成有特定功能的目的基因。
[0013]2)载体系统的选择:一个优良的载体必须具备几个条件:是一个具自我复制能力的复制子；能在受体细胞内大量增值；只有一个限制性内切核酸酶的切口 ；其上必须有一种选择性遗传标记。对于大肠杆菌表达系统来说，载体主要是一些松弛型细菌质粒。
[0014]3)目的基因与载体DNA的重组:采用限制性内切酶处理产生粘性末端，经过退火后在连接酶的作用下，目的基因就与载体DNA结合形成重组载体。
[0015]4)重组载体导入受体细胞:在大肠杆菌表达系统中通过转化法将质粒导入受体细胞，如CaCl2转化法，电穿击法、热击法等。
[0016]5)重组菌株的筛选鉴定:对表达的重组菌株进行抗生素筛选，电泳鉴定后才能大规模培养。
[0017]6)重组菌株的大规模培养:通过在摇瓶及发酵罐上采用单因子及正交试验进行条件的优化，在最佳培养条件下大规模发酵。
[0018]7)重组蛋白的分离纯化:常用的有离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、膜分离等方法，或将几种方法联合起来。
[0019]2、酵母表达系统
[0020]酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母。但与新型酵母体系相比，酿酒酵母表达系统存在不适合高密度培养、缺乏强有力的严格调控的启动子，而且分泌效率较低，尤其是许多分子量大于30kD的外源蛋白几乎不分泌等缺点，通常不被看作是重组蛋白的理想宿主。后来人们又相继开发了裂殖酵母、甲醇酵母
坐寸ο
[0021]甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有HPolymorpha, Candida Bodini,Pichia Pastris3 种，并以 Pichia Pastoris 应用最多。甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因(AOXl)，在该基因的启动子(PAOXl)作用下，外源基因得以表达。PAOXl是一个强启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中AOXl基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时PAOXl可被诱导激活，因而外源基因可在其控制下表达，将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。[0022]酵母系统表达重组蛋白的操作步骤包括:
[0023]I)目的基因的克隆:选用合适的限制性内切酶将外源基因克隆于表达载体的多克隆位点。如果选用的是分泌型表达载体，则外源基因的阅读框架和信号肽的阅读框架应该
保持一致。
[0024]2)重组载体线性化:重组载体只有被酶切线性化，整合效率才能大大提高，环状质粒整合效率是很低的。选用不同的内切酶线性化可得到不同的转化子。
[0025]3)酵母转化:电穿孔，原生质球，PEG，或醋酸锂，选用上述四种方法中的任何一种转化。一般选用原生质球或电穿孔，因为这两种方法转化效率较高。
[0026]4)筛选:转化子可先在不含组氨酸的培养基上初筛。复筛可用PCR进行。即提取转化子DNA，用外源基因两侧特异引物扩增筛选。然而，这只限于少量转化子。转化子太多，则工作量太大。对于大量转化子的筛选，可用原位点杂交进行。
[0027]5)鉴定表型:筛选出的转化子需鉴定表型，即确定是Mut,还是Muts。这两种不同表型在诱导表达的条件上有差异。可以把转化子同时点在MD和MM两种平板上。在MD和MM平板上生长差别不大的转化子为Mut+ ;相反，在MD上生长快，MM上生长很慢的转化子为Muts0
[0028]6)诱导表达:外源蛋白在甲醇酵母中的表达分两步，即菌体生长和蛋白诱导表达。先在以甘油为碳源的培养基上培养菌体，达到一定OD值后，离心弃上清，菌体悬浮于以甲醇为碳源的培养基中诱导表达。每隔一段时间加一次甲醇，以弥补甲醇的损失。表达的条件有待优化，如通气状况，PH值，培养基的组成等等。一旦最佳条件确定，则可以按比例放大，从摇瓶培养转至大规模发酵。
[0029]国内外已有运用大肠杆菌(原核系统)和酵母细胞来表达NGAL的文章和专利。王小中等人(NGAL原核表达及多克隆抗 体的制备，国际检验医学杂志，2011，32(16):1789-1791)把NGAL基因克隆到pet28a载体，在大肠杆菌中表达该蛋白。但实际上由于大肠杆菌系统缺乏翻译后的糖基化修饰，NGAL的表达产物为非糖基化蛋白。而NGAL本身为糖蛋白，糖基对蛋白有保护作用。汕头大学医学院李恩民等人(重组毕赤酵母及其表达NGAL蛋白的方法，专利申请号:200610123677.X)在毕氏酵母菌中表达了 NGAL，表达产物为糖蛋白，具有生物学活性。该专利利用酵母表达载体PPIC9，表达量大于100mg/L。但在菌落筛选时，只采用了菌落PCR方法，如果筛选表达量更高的重组菌株，需要从成百甚至上千个重组菌株才能筛选出来，此外，即使是用G418筛选，当菌落密度高时，会产生很多假阳性；而且，其在蛋白纯化时，纯化繁琐，需要经过硫酸铵沉淀，脱盐，阳离子交换等等。
【发明内容】
[0030]本发明的目的是提供一种生物活性高，表达量高，菌落筛选更为简单且杂蛋白少纯化更为简便的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的制备方法。
[0031]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0032]一种人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的制备方法，其包括如下步骤:
[0033](I)提供编码NGAL的核苷酸序列；
[0034](2)将所述NGAL的核苷酸序列克隆到不同的酵母表达载体中；
[0035](3)将所述酵母表达载体转化至同一酵母宿主；[0036](4)诱导所述酵母宿主表达C端带有组氨酸标签的NGAL ；
[0037](5)纯化步骤(4)处理后的NGAL。
[0038]所述人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所
/Jn ο
[0039]所述酵母表达载体为能够用以表达外源蛋白的穿梭载体。
[0040]优选的是，所述酵母表达载体为pPICZ α B。
[0041]所述酵母宿主为汉逊酵母、毕赤酵母、假丝酵母或光滑球拟酵母中的任意一种。
[0042]优选的是，所述酵母宿主为毕赤酵母。
[0043]优选的是，所述组氨酸标签是含有六个连续的组氨酸的氨基酸序列。
[0044]优选的是，所述步骤(4)中的诱导表达使用甲醇作为唯一碳源，并使甲醇的终浓度为发酵液体积的0.5%~3% (V/V)0
[0045]优选的是，所述步骤(5)中的纯化操作在Ni2+-NTA基质中进行，并采用咪唑溶液进行洗脱。
[0046]本发明的有益效果为:
[0047]1.在酵母真核表达系统中进行重组表达，表达产物NGAL无需变性和复性，诱导表达后收集培养基上清即可得到有活性的NGAL。
[0048]2.表达量很高，杂蛋白 很少。表达量可达至少150mg/L (摇瓶中)，即使不纯化，蛋白纯度可达80%以上。预计在发酵罐中，由于通气量，甘油，甲醇含量更容易得到控制，表达量可以至少比摇瓶中提高4倍以上。
[0049]3.表达生成C端带有组氨酸标签(His tag)的NGAL，使得在后续的亲和层析过程中，只需一步纯化步骤即可得到纯品。
[0050]4.如根据酵母偏好密码子提供编码的NGAL的核苷酸序列，还可以进一步提高表达量。
[0051]5.如在诱导表达过程中使甲醇的终浓度达到0.5%至3% (V/V)，能够更高效的表达 NGAL。
【专利附图】
【附图说明】
[0052]图1为NGAL在酵母中的诱导表达结果示意图，其中泳道M为蛋白质分子量标准，泳道1-5为不同重组转化子X-33/pPICZ a B-NGAL诱导表达3天的上清；
[0053]图2为重组NGAL的纯化结果示意图，其中泳道M为蛋白质分子量标准，泳道1、2为NGAL亲和层析产物；
[0054]图3为重组NGAL的免疫学活性测定结果示意图，其中泳道M为蛋白质分子量标准，泳道I为NGAL，泳道2为对照。
【具体实施方式】
[0055]材料:
[0056]菌株和质粒:克隆菌种Escherichia coli (DH5a)是基因工程常用工具菌种；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS_115、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)KM_71、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) KM-71H、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) X-33、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) SMD-1168、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) SMD-1 168-H ;质粒pPICZ a B购于invitrogen公司。
[0057]酶和试剂:
[0058]实施例中涉及分子生物学操作所用的酶均购于北京经科宏达公司。
[0059]PCR纯化试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒(全式金)、酵母DNA提取试剂盒均购于北京天根公司(TianGen)。
[0060]NGAL兔源多克隆抗体(H-130)购于santa公司，驴抗兔带HRP标记的二抗购于北京博奥森生物技术有限公司。
[0061]实施例中所涉及的编码NGAL的核苷酸序列的合成、引物的合成和DNA的测序工作由赛诺基因完成。
[0062]抗生素zeocin 购于 invitrogen 公司。
[0063]培养基如下:
[0064]LB培养基、Amp抗性LB培养基、YPD培养基、MD培养基、zeocin抗性YPD培养基以上培养基为液体培养基；
[0065]zeocin-YPD固体培养基、BMGY培养基、BMMY培养基；
[0066]以上培养基是基因工程领域常用培养基，各培养基的配方可参见分子克隆第三版下册附录2以及invitrogen公司的毕赤酵母操作手册(Mult1-Copy Pichia ExpressionKit)第 64 页-第 70 页；及 pPICZ α A, B, and C 第 17-第 18 页。
[0067]实施例1
[0068]本实施例人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的制备方法，其包括如下步骤:
[0069]UpPICZa B-NGAL表达载体的构建
[0070](1 )NGAL全基因合成:按照毕赤酵母密码子偏好性化学合成NGAL基因的核苷酸序列，最终基因为SEQ ID NO:1所示的碱基序列。
[0071](2)以上述合成的碱基序列作为模板，以设计的三条引物为上下游引物，进行巢式PCR扩增，其中首次PCR所需引物如下:
[0072]上游引物NGAL-Ul (下划线为5’ His):
[0073]GAAGCTCATCACCACCATCACCATCAAGACTCCACCTCTGACTT
[0074]下游引物NGAL-R (下划线为NotI位点):
[0075]TTCTTGCGGCCGCTTATCAACCGTCGATACATTGGTCGA
[0076]首次PCR反应体系为:
[0077]
【权利要求】
1.一种人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤: (1)提供编码NGAL的核苷酸序列； (2)将所述NGAL的核苷酸序列克隆到pPICZα B酵母表达载体中； (3)将所述酵母表达载体转化至同一酵母宿主； (4)诱导所述酵母宿主表达C端带有组氨酸标签的NGAL； (5)纯化经步骤(4)处理后的NGAL。
2.根据权利要求1所述的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的制备方法，其特征在于，所述人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根据权利要求1所述的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的制备方法，其特征在于，所述酵母宿主为汉逊酵母、毕赤酵母、假丝酵母或光滑球拟酵母中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的制备方法，其特征在于，所述酵母宿主为毕赤酵母。
5.根据权利要求4所述的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的制备方法，其特征在于，所述毕赤酵母为Χ-33或G-115。
6.根据权利要求1所述 的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的制备方法，其特征在于，所述组氨酸标签是含有六个连续的组氨酸的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的诱导表达使用甲醇作为唯一碳源，并使甲醇的终浓度为0.5%~3%(V/V)。
8.根据权利要求1所述的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的制备方法，其特征在于，所述步骤(5 )中的纯化操作在Ni2+-NTA基质中进行，并采用咪唑溶液进行洗脱。
【文档编号】C12N15/12GK103880948SQ201410040897
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2013年4月11日
【发明者】彭毅, 翟文, 庞朋沙 申请人:北京爱必信生物技术有限公司