冰鲜南极磷虾的蛋白水解产物的制备及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种由冰鲜南极磷虾制备蛋白水解产物的方法，包括：(1)将南极磷虾冰鲜原料与水以每公斤原料加1L-3L水的比例混合，粉碎匀浆后，加碱性蛋白酶在35-55℃酶解1-5h；(2)固液分离得清液，清液浓缩干燥，得到蛋白水解产物，其中含脂肪0%、肽类及氨基酸总计60%以上。南极磷虾蛋白水解产物组链霉菌发酵产生的总放线菌素产量与蛋白胨等现有商品化氮源组产量相当，且高效液相色谱-质谱分析结果表明南极磷虾蛋白水解产物组发酵产生放线菌素D的结构类似物多样性更好。
【专利说明】冰鲜南极磷虾的蛋白水解产物的制备及其用途
【技术领域】
[0001]本发明属南极磷虾蛋白的酶水解产物制备领域，特别是涉及一种冰鲜南极磷虾的蛋白水解产物的制备方法及其作为微生物发酵原料的用途。
【背景技术】
[0002]南极磷奸,也称南极大磷奸,拉丁名Euphausia superba Dana,甲壳类,是南极附近海域蕴藏量最大的海洋浮游生物，现有生物量高达6.5~10.0亿吨。南极磷虾中蛋白质、脂类等活性成分丰富，尤其是南极磷虾干燥肌肉中粗蛋白含量高达64%，且磷虾蛋白中18种氨基酸总量达57%，8种人体必需氨基酸含量高于25%，占氨基酸总量的43%以上。因此，从资源丰富的南极磷虾中制备磷虾蛋白或其水解产物，具有较为广阔的应用前景，已经在钓鱼饵料、养殖饲料等行业中得到了应用。
[0003]海洋动物蛋白成分的常规酶水解方法一般包括以下过程:新鲜或冻干个体切片粉碎，然后在水相介质中用酶(包括常用的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等)在适宜温度条件下水解一定时间，固液分离，水溶液干燥，得到蛋白水解产物。
[0004]针对南极磷虾蛋白利用碱性蛋白酶水解的方法目前尚无文献报道，南极磷虾蛋白及其水解产物作为微生物发酵原料的用途目前也尚无文献报道。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种冰鲜南极磷虾的蛋白水解方法，该制备工艺较为简单，可有效水解南极磷虾蛋白。所得蛋白水解产品中肽类或氨基酸总计60%以上；并能有效地代替现有蛋白胨等商品作为氮源，应用于微生物发酵的科研和生产过程中。
[0006]本发明的一种由冰鲜南极磷虾制备蛋白水解产物的方法，包括:(I)将冰鲜南极磷虾原料与水以每公斤原料加1L-3L水的比例混合，粉碎匀浆后，加碱性蛋白酶在35-55°C酶解l-5h ;(2)固液分离得清液，清液浓缩干燥，得到蛋白水解产物。
[0007]在本发明的优选方法中，所述步骤(1)中的碱性蛋白酶添加量5_20mL/kg原料；
[0008]在本发明的优选方法中，其中在步骤(1)中，冰鲜南极磷虾原料与水以每公斤原料加1.5-2.0L水的比例混合；碱性蛋白酶的添加量为10-15mL/kg原料或10000_30000U/kg原料，45-50°C下酶解l_3h ;以及/或者在步骤(2)中，所述固液分离方法包括:过滤，并将滤液再经离心得到所述清液，其中所述过滤为真空抽滤，所述离心的条件为10°C以下离心20-50min，转速 6000-12000 转 /min。
[0009]本发明还提供一种蛋白水解产物，其上述的本发明方法得到。 [0010]本发明还提供一种通过本发明方法得到的蛋白水解产物作为微生物发酵的氮源的用途。
[0011]本发明还提供一种链霉菌发酵生产放线菌素的方法，所述发酵所用R2A培养基中的蛋白胨组分被本发明的蛋白水解产物替代，或者所述发酵所用蛋白胨-葡萄糖培养基中的蛋白胨组分被本发明的蛋白水解产物替代。[0012]有益效果
[0013]本发明的突出特点是为南极磷虾蛋白提供了新的酶水解方法，其蛋白水解产物制备工艺简单，所得产品中肽类或氨基酸总计60%以上，并能有效地代替市场上现有的蛋白胨等商品，作为微生物发酵的氮源，应用于微生物发酵相关的科研和生产过程中。例如，南极磷虾蛋白水解产物组链霉菌发酵产生的总放线菌素产量与蛋白胨等现有商品化氮源组产量相当，且高效液相色谱-质谱分析结果表明南极磷虾蛋白水解产物组发酵产生放线菌素D的结构类似物多样性更好。南极磷虾的原料来源丰富，蛋白含量高，制备的蛋白水解产物可广泛用于微生物发酵产业，有很好的开发利前景。
【具体实施方式】
[0014]本发明的一种冰鲜南极磷虾的蛋白水解方法，包括:
[0015](I)将南极磷虾冰鲜原料与水混合，粉碎匀浆，加碱性蛋白酶酶解；
[0016](2)过滤、离心，取上清液浓缩干燥，得到蛋白水解产物。
[0017]所述步骤(1)中的每公斤南极磷虾冰鲜原料可加1L-3L水，优选2L ；
[0018]所述步骤(1)中的碱性蛋白酶添加量5-20mL/kg磷虫下,优选10mL/kg磷虫下；
[0019]所述步骤(1)中的水解温度35-55°C，优选50°C ；
[0020]所述步骤(1)中的水解时间为l_5h，优选3h。
[0021]所述步骤(2)中的离心的条件为4°C离心20-50min，转速6000-12000转/min，优选条件为离心30min,转速9 000转/min。
[0022]本发明中所述方法得到的南极磷虾蛋白水解产物中，含脂肪0%、肽类或氨基酸总计60%以上。
[0023]本发明的南极磷虾蛋白水解产物可作为微生物发酵的氮源，应用于微生物发酵的科研和生产过程中。举例如下(更详细情况参见下文使用例):
[0024]一株产生放线菌素D的海鞘共附生链霉菌Streptomyces globisporus FDZ35(专利保藏号为CCTCC M2013587), R2A培养基250mL摇瓶发酵，获得小量菌种；
[0025]选取R2A培养基和蛋白胨-葡萄糖培养基作为2个对照组，这两种培养基经证明能有效地用于链霉菌Streptomyces globisporus FDZ35发酵,并产生放线菌素D ;另用南极磷虾蛋白水解产物等量替代R2A培养基和蛋白胨-葡萄糖培养基中对应的蛋白胨，作为培养基中唯一有机氮源，得到2个南极磷虾蛋白水解产物组；每组配制1500mL培养基。以上4组培养基分别加入到每组3个2000mL摇瓶中，灭菌、接种、发酵7天，每组1500mL总发酵混合液体40°C真空浓缩干燥，分别得到4组发酵混合物，均为褐色粉末；
[0026]分别以甲醇(每次250mL，2次，超声20min)提取4组发酵混合物，最后分别定容，得到各自发酵提取物的500mL甲醇溶液，以放线菌素D为标准品，按照《中国药典》(2005年版)附录VA紫外-可见分光光度法，分别测定放线菌素D及其结构类似物含量。
[0027]所得4组发酵提取物中放线菌素D及其结构类似物产量均>35mg/L发酵混合液，南极磷虾蛋白水解产物组产量与蛋白胨等现有商品化氮源组产量相当，且高效液相色谱-飞行时间质谱(HPLC-Tof MS)分析结果表明南极磷虾蛋白水解产物组发酵产生放线菌素D的结构类似物多样性更好。(参见后述使用例)
[0028]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0029]蛋白水解产物制备例
[0030]实施例所用原料:南极磷虾冰鲜原料来自2012年12月至2013年3月的农业部南极磷虾探捕渔船；碱性蛋白酶来自诺维信中国生物技术有限公司。
[0031]实施例1
[0032]将南极磷虾冰鲜原料取1.0kg,按1.2倍质量体积比加入1.2L水中，转速250rpm/min粉碎匀浆5min，加碱性蛋白酶(酶活力1400U/mL) IOmL在40°C酶解2h ;用布氏漏斗中速定性滤纸减压过滤，取水溶液在4°C、9000转/min离心30min，上清液浓缩干燥，得到蛋白水解产物，产品12.6g，产率为1.26%。得到的南极磷虾蛋白水解产物中，含脂肪0%、肽类或氨基酸总计63%。
[0033]实施例2
[0034]将南极磷虾冰鲜原料取1.0kg,按1.5倍质量体积比加入1.5L水中，转速250rpm/min粉碎匀浆5min，加碱性蛋白酶(酶活力2000U/mL)7mL在45°C酶解2h ;用布氏漏斗中速定性滤纸减压过滤，取水溶液在4°C、9000转/min离心30min，上清液浓缩干燥，得到蛋白水解产物，产品13.7g，产率为1.37%。得到的南极磷虾蛋白水解产物中，含脂肪0%、肽类或氨基酸总计61%。
[0035]实施例3 [0036]将南极磷奸冰鲜原料取1.0kg,按3倍质量体积比加入3L水中，转速250rpm/min粉碎匀浆5min，加碱性蛋白酶(酶活力2000U/mL) 14mL在50°C酶解3h ;用布氏漏斗中速定性滤纸减压过滤，取水溶液在4°C、9000转/min离心30min，上清液浓缩干燥，得到蛋白水解产物，产品18.4g，产率为1.84%。得到的南极磷虾蛋白水解产物中，含脂肪0%、肽类或氨基酸总计71%。
[0037]实施例4
[0038]将南极磷奸冰鲜原料取1.0kg,按2倍质量体积比加入2L水中，转速250rpm/min粉碎匀浆5min，加碱性蛋白酶(酶活力1800U/mL) IOmL在50°C酶解3h ;用布氏漏斗中速定性滤纸减压过滤，取水溶液在4°C、9000转/min离心30min，上清液浓缩干燥，得到蛋白水解产物，产品15.3g，产率为1.53%。得到的南极磷虾蛋白水解产物中，含脂肪0%、肽类或氨基酸总计67%。
[0039]实施例5
[0040]将南极磷奸冰鲜原料取1.0kg,按2倍质量体积比加入2L水中，转速250rpm/min粉碎匀浆5min，加碱性蛋白酶(酶活力1500U/mL) 12mL在45°C酶解3h ;用布氏漏斗中速定性滤纸减压过滤，取水溶液在4°C、9000转/min离心30min，上清液浓缩干燥，得到蛋白水解产物，产品14.9g，产率为1.49%。得到的南极磷虾蛋白水解产物中，含脂肪0%、肽类或氨基酸总计65%。
[0041]蛋白水解产物的使用例
[0042]选取R2A培养基和蛋白胨-葡萄糖培养基作为2个对照组，已证明这两种培养基能有效地用于链霉菌Streptomyces globisporus FDZ35发酵,并产生放线菌素D。[0043]另用南极磷虾蛋白水解产物等量替代R2A培养基和蛋白胨-葡萄糖培养基中对应的蛋白胨，作为培养基中唯一有机氮源，得到2个南极磷虾蛋白水解产物组。
[0044]每组配制1500mL培养基。各组培养基具体组成如下:
[0045]对照组1(R2A培养基，单位g/L):酵母膏0.5g/L、胰蛋白胨0.25g/L、蛋白胨0.75g/L、葡萄糖 0.5g/L、淀粉 0.5g/L、K2HP040.3g/L、MgS040.024g/L、丙酮酸钠 0.3g/L、海水盐溶液 23.6g/L，ρΗ7.2±0.2 ;
[0046]磷虾蛋白水解产物组2(替代R2A培养基，单位g/L):酵母膏0.5g/L、磷虾蛋白水解产物 1.0g/L、葡萄糖 0.5g/L、淀粉 0.5g/L、K2HP040.3g/L、MgS040.024g/L、丙酮酸钠 0.3g/L、海水盐溶液 23.6g/L，ρΗ7.2±0.2 ；
[0047]对照组3(蛋白胨-葡萄糖培养基，单位g/L):蛋白胨2.0、葡萄糖2.0、硫酸铵1.0、碳酸钙0.5、氯化钠0.05、磷酸二氢钾0.05，pH7.8-8.0 ；
[0048]磷虾蛋白水解产物组4 (替代蛋白胨-葡萄糖培养基，单位g/L):磷虾蛋白水解产物2.0、葡萄糖2.0、硫酸铵1.0、碳酸钙0.5、氯化钠0.05、磷酸二氢钾0.05，pH7.8-8.0。
[0049]以上4组培养基分别加入到每组3个2000mL摇瓶中，灭菌、接种、28° C、转速180rpm/min摇床发酵7天，每组1500mL总发酵混合液体40°C真空浓缩干燥,分别得到4组发酵混合物，均为褐色粉末；
[0050]分别以甲醇(每次250mL，2次，超`声20min)提取实施例2中得到的4组发酵混合物，最后分别定容，得到各自发酵提取物的500mL甲醇溶液，以放线菌素D为标准品，按照《中国药典》(2005年版)附录VA紫外-可见分光光度法，分别测定放线菌素D及其结构类似物浓度，并分别计算单位体积的各组发酵混合液中总放线菌素含量，如下表:
[0051]表1发酵混合液中总放线菌素含量测定
[0052]
Hl发酵混合液中总放线菌素含量
(mg/L )
52^8
磷虾蛋白水解产物组236.23
对照组342.79
憐奸蛋白水解广物组443.94
[0053]分别取对照组3、磷虾蛋白水解产物组4的发酵提取物的甲醇溶液1.0mL，进行高效液相色谱-飞行时间质谱(HPLC-Tof MS)分析，提取原始质谱数据中1000以上的质谱峰，以及利用其峰面积归一化给出的相对含量，结果如下表:
[0054]表2发酵产生放线菌素D的结构类似物多样性分析
[0055]
【权利要求】
1.一种由冰鲜南极磷虾制备蛋白水解产物的方法，包括: (1)将冰鲜南极磷虾原料与水以每公斤原料加1L-3L水的比例混合，粉碎匀浆后，加碱性蛋白酶在35-55°C酶解l_5h ； (2)固液分离得清液，清液浓缩干燥，得到蛋白水解产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤⑴中的碱性蛋白酶添加量5-20mL/kg原料。
3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(1)中的碱性蛋白酶添加量为5000-40000U/kg原料。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述步骤(2)中固液分离方法包括:过滤，并将滤液再经离心得到所述清液。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)中，冰鲜南极磷虾原料与水以每公斤原料加1.5-2.0L水的比例混合；碱性蛋白酶的添加量为10-15mL/kg原料或10000-30000U/kg原料，45-50°C下酶解l_3h ;以及/或者在步骤(2)中，所述固液分离方法包括:过滤，并将滤液再经离心得到所述清液，其中所述过滤为真空抽滤，所述离心的条件为10°C以下离心 20-50min，转速 6000-12000 转 /min。
6.一种蛋白水 解产物，其根据权利要求1-5任一项所述方法得到。
7.如权利要求6所述的蛋白水解产物，其特征在于:其中含脂肪0%、肽类及氨基酸总计60%以上。
8.将权利要求6或7所述的蛋白水解产物作为微生物发酵的氮源的用途。
9.如权利要求8所说的用途，所述微生物发酵为链霉菌发酵生产放线菌素。
10.一种链霉菌发酵生产放线菌素的方法，其特征在于，所述发酵所用R2A培养基中的蛋白胨组分被权利要求6或7的蛋白水解产物替代，或者所述发酵所用蛋白胨-葡萄糖培养基中的蛋白胨组分被用权利要求6或7的蛋白水解产物替代。
【文档编号】C12P21/06GK103834711SQ201410075726
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月4日 优先权日:2014年3月4日
【发明者】樊成奇, 黄艳青, 杨桥, 田晓清, 王成, 陆亚男, 马丽艳, 黄洪亮 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所