一种同时检测rna病毒、dna病毒、支原体和衣原体的方法
【专利摘要】本发明属于生物技术应用领域，公开了一种在同一台实时荧光定量PCR仪上同时检测RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体的上机反应程序，通过与相应的RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体在不同的荧光定量PCR仪器上、以不同的反应程序进行检测相比较，具有较高的特异性、稳定性以及统一性。
【专利说明】【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及生物技术应用领域，尤其是用于常见的RNA病毒、DNA病毒、支原体和 衣原体的同时检测与鉴定。 -种同时检测RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体的方法 【背景技术】
[0002] 目前，国内外新兴的检测病原微生物的方法是实时荧光定量PCR技术（Real-time fluorescent quantitative PCR)，这是一种在PCR反应体系中加入突光基团，利用突光信 号积累实时监测整个PCR进程，该技术不仅实现了对模板的定性和定量，而且具有灵敏度 高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具有实时性和准确性 等特点。因而，在呼吸道病原体检测中具有巨大应用优势。
[0003] 但目前对于RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体的检测都是分别进行，由于基因 组的特性、长度以及复杂度不同，不易于同时在同一个PCR仪上同时检测，假阳性高，不稳 定，效率低。
[0004] 本专利成功建立的在同一台荧光定量PCR仪上、同时检测RNA病毒（以甲型H1N1 流感病毒为例、简写HI)、DNA病毒（以人腺病毒为例、简写ADV)、支原体（以人肺炎支原体 为例、简写MP)和衣原体（以人肺炎衣原体为例、简写CP)的方法，该方法具有特异性强、灵 敏度高、稳定性强的特点且操作简便快速，在急性呼吸道病毒的现场检测、卫生评价、临床 诊断等方面显示出良好的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明是由国家"十二五"科技重大专项2012ZX10004206-002支持的。在本发明 中，我们成功建立了在同一台荧光定量PCR仪上、应用同样的反应程序检测RNA病毒、DNA病 毒、支原体和衣原体的方法。通过与各自病原体在不同的PCR仪上、以不同的反应程序进行 检测的结果进行比较，说明该方法具有较高的特异性、灵敏度、高效性和稳定性。
[0006] 在本发明的第一方面，提供一种同时检测RNA病毒（以甲型H1N1流感病毒为例）、 DNA病毒（以人腺病毒为例）、支原体（以人肺炎支原体为例）和衣原体（以人肺炎衣原体 为例）的配制体系，该方法使用针对各自病原体设计及合成的引物和探针进行配制。
[0007] 在一个实施方案中，所述方法包括以下配制成份：
[0008] a)反应缓冲液；
[0009] b)反应酶；
[0010] c)针对各自病原体的上、下游引物；
[0011] d)针对各自病原体的探针；
[0012] e)无 RNA酶的水补足体系要求的体积。
[0013] 在一个具体实施方案中，所述方法为荧光定量PCR/RT-PCR配制体系。
[0014] 在本发明的第二方面，提供一种在同一台实时荧光定量PCR仪上、同时检测RNA病 毒、DNA病毒、支原体和衣原体（以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体和人肺炎 衣原体为例）的上机反应程序，该方法使用第一方面所述的配制体系。
[0015] 在一个实施方案中，所述方法包括以下程序：
[0016] a)荧光通道的设置；
[0017] b)反转录的温度与时间；
[0018] c)预热的温度与时间；
[0019] d)预循环（预热温度与时间、退火温度与时间、荧光收集温度、循环数）；
[0020] e)热循环（预热温度与时间、退火温度与时间、荧光收集温度、循环数）；
[0021] f)以界定的Ct值来判定检测结果。
[0022] 在一个具体实施方案中，所述方法为荧光定量PCR/RT PCR扩增程序，并使用所述 配制体系作为反应体系。
[0023] 在本发明的第三方面，提供第二方面所述的上机反应程序的诊断试剂中的应用。 【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为同时加入甲型H1N1型流感病毒（RNA病毒）、人腺病毒（DNA病毒）、人肺炎 支原体（支原体）、人肺炎衣原体（衣原体）阳性模板的荧光扩增图。 【具体实施方式】
[0025] 本发明的技术途径是首先利用已经设计并合成的RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣 原体（以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体以及人肺炎衣原体为例）相应基因 的保守区设计特异性引物和探针序列，确定了最佳配制体系及上机扩增程序，并且进行特 异性、灵敏度及稳定性的验证实验及临床样本的检测应用，成功建立了 RNA病毒、DNA病毒、 支原体和衣原体（以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体以及人肺炎衣原体为例） 一步法多重荧光RT-PCR同一台PCR仪的上机反应。
[0026] 同时，需要指出的是，本发明所述的检测方法和试剂盒不仅应用于对患者（人）的 样品进行检测，也包括对环境中的水样品、食物样品、空气样品、微生物样品、动物样品等多 种样品的非诊断目的的检测。其应用也都是本领域技术的常用技术手段，并不需要进行特 别的、富有创造性的改变。
[0027] 实施例1. RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体（以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、 人肺炎支原体以及人肺炎衣原体为例）各病原体特异性引物和探针一步法荧光定量PCR/ RT-PCR检测程序的建立
[0028] 1. 1按照英杰公司的核酸提取试剂盒（QIAamp? viral RNA Mini Kit)来提取样 本核酸。
[0029] 1. 2RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体（以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺 炎支原体以及人肺炎衣原体为例）一步法多重荧光RT-PCR检测体系的配制
[0030] 配制试剂采用 Ambion 公司的 AgPath-IDTM One-st印 RT-PCR Kit (P/N :4387424), 体系为25 μ 1 :
[0031] 2xRT-PCR buffer 12.5μΙ 25 XRT-PCR Enzyme 1 μ? Detection Enhancer ] ·5μ1 引物、探针 0.5μ1 (引物终浓度为400nM、探针终浓度为ΙΟΟηΜ) 模板 5μ1 无RNA酶的水 4.5μ1
[0032] 1. 3RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体（以甲型Η1Ν1流感病毒、人腺病毒、人肺 炎支原体以及人肺炎衣原体为例）一步法荧光定量PCR/RT-PCR检测方法的上机扩增程序
[0033] 采用罗氏公司的Roche480仪进行上机扩增，其程序如下：
[0034] 先设置FAM荧光采集通道；
[0035] 反转录温度与时间：48°C, 30 min; 预变性温度与时间：95°C，lOmin;
【权利要求】
1. 一种非诊断目的的同时检测RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体的方法： 配制PCR反应体系： a) 反应缓冲液； b) 反应酶； c) 针对各自病原体的上、下游引物； d) 针对各自病原体的探针； e) 无 RNA酶的水补足体系要求的体积。 设置上机反应程序， a) 荧光通道的设置； b) 反转录的温度与时间； c) 预热的温度与时间； d) 预循环（预热温度与时间、退火温度与时间、荧光收集温度、循环数）； e) 热循环（预热温度与时间、退火温度与时间、荧光收集温度、循环数）； f) 以界定的Ct值来判定检测结果。
2. 如权利要求1所述的方法，PCR反应体系中，采用Ambion公司的AgPath-IDTM One-st 印 RT-PCR Kit，P/N :4387424,体系为 25μ 1 : 2xRT-PCR buffer 12.5μ1 25 xRT-PCR Enzyme 1 μ? Detection Enhancer 1.5μ1 弓I物、探针 0.5μ1，引物终浓度为400nM、探针终浓度为ΙΟΟηΜ 模板 5μ1 无 RNA酶的水 4.5μ1。
3. 如权利要求1所述的方法，其中上机反应程序设置如下： 先设置FAM荧光采集通道； 反转录温度与时间：48°C，30min; 预变性温度与时间：95?，lOmin;
预热温度与时间·· 95°C，15 s; 荧光吸收温度为60?，共10 退火温度与时间： 60°C, 45s 预热温度与时间： 95°C，15 s; 荧光吸收温度为60X：,共35 退火温度与时间： 60°C, 45s 结果判定标准为：Ct值<34,判定为阳性；Ct值>36,判断为阴性；Ct值在34?36之 间为可疑。
4. 如权利要求1或2所述方法，其中所述引物序列为SEQ ID NO :1-12所示。
5. 如权利要求1所述方法在检测食品及原料、环境样本中病原微生物方面的用途。
6. 如权利要求1所述方法可以在基层或小型实验基地进行，同时也可应用于现场检 测、卫生评价等方面。
【文档编号】C12Q1/68GK104109721SQ201410083117
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】崔淑娟, 石伟先, 田丽丽, 张新, 于霞丽, 孙玉兰, 王海滨, 张玉松 申请人:崔淑娟