肿瘤特异性抗原人天冬氨酸β羟化酶（HAAH）羧基末端蛋白制备工艺及其在癌症诊断中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种人类肿瘤早期诊断方法。该方法是通过天冬氨酸β羟化酶（HAAH）抗体和人体细胞或体液中的天冬氨酸β羟化酶结合的抗原抗体反应来诊断早期癌症。本发明亦包括产生HAAH羧基末端重组蛋白和制备HAAH特异性单克隆抗体的方法。
【专利说明】肿瘤特异性抗原人天冬氨酸β羟化酶(HAAH)羧基末端蛋白制备工艺及其在癌症诊断中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体涉及人天冬氨酸β羟化酶(HAAH)羧基末端(562-758)蛋白和单克隆抗体的制备以及通过抗体结合哺乳动物组织或体液中HAAH蛋白来早期诊断癌症的方法。
【背景技术】
[0002]癌症在我国已经成为城市人口的第一大死因，农村人口的第二大死因。自上世纪70年代以来，我国癌症死亡率一直呈持续增长趋势，70年代、90年代和21世纪初每年死于癌症的人数分别为70万、117万和150万。目前，每四到五个死亡的中国人中就有一个人死于癌症。由此可见，中国瘤防治的任务是非常艰巨。
[0003]与之相对应的是我国的癌症患者的五年生存率仅为13%，造成如此之低的生存率，主要是由于过迟的诊断和发现。以通用电气公布的乳腺癌5年生存率为例，I期乳腺癌的5年生存率高达95%以上，而4期乳腺癌的5年生存率仅为16%。因此，癌症的早期诊断意义重大。
[0004]如今，一个明确的癌症诊断还是要依靠探查手术来完成，但是各种形式的癌症早期诊断方式已经被纳入应用，尤其是通过能够特异性识别并结合癌症细胞表面抗原的抗体来诊断和治疗恶性肿瘤的方法。例如某些黑色素瘤，生殖道恶性肿瘤等，均已发现了一些肿瘤特异性细胞表面抗原。而我们则希望能找到一个更加广泛的癌症早期诊断和治疗性靶蛋白。
[0005]人天冬氨酸β羟化酶(HAAH)是一种正常定位在内质网的蛋白，但当细胞发生癌变时，HAAH将会转移至细胞质膜表面，并出现在病人的血液中。现已发现多种癌症，如肺癌，肝癌，直肠癌，乳腺癌，胰腺癌，前列腺癌等癌症均发生了 HAAH蛋白的过量表达。鉴于HAAH蛋白在肿瘤细胞中的特异性高表达以及其表达定位的特异性改变，我们考虑将其作为癌症早期诊断试剂盒的检测目标。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种简单快捷的非手术癌症检测手段，使得高效、准确的癌症早期诊断成为可能，同时亦能够在组织层面上检测癌变情况。
[0007]本发明上述目的通过以下技术方案予以实现:
首先，用PCR将HAAH蛋白羧基末端的区域(562-758)(如SEQ ID N0.1所示)所对应的基因序列扩增，再通过基因工程的手段由大肠杆菌表达HAAH蛋白羧基末端的区域(562-758)(如SEQ ID N0.2所示)。用纯化到的重组HAAH蛋白片段(562-758)免疫BALB/c小鼠，产生抗体，并用杂交瘤技术制成单抗。通过ELISA抗原夹心法，使样品血清中的抗原，与我们的单抗形成抗体-抗原-抗体-酶的复合物，而后酶与底物反应显示后测出吸光度，由标准曲线计算出样本血清中的HAAH抗原浓度，由于癌症患者血清中HAAH蛋白量远高于正常人，故而可以判断其是否为癌症患者。亦可通过免疫组化，将所产抗体作为一抗，检测组织癌变情况。
[0008]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
本发明将癌症的检测大幅简化，仅仅通过血清即可检查癌症，大幅减轻了患者的检测痛苦，降低了癌症检测的成本，使癌症检测的日常化成为了可能。另外，此项发明的检测对象覆盖了大多数种类癌症，使之可能成为健康体检筛查的重要标志物。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为天冬氨酸β羟化酶(HAAH)羧基末端559-758蛋白表达纯化后再SDS-PAGE上考马斯亮蓝染色结果；
图2为使用天冬氨酸β羟化酶(HAAH)羧基末端559-758蛋白作为标准品做出的标准曲线，其中所获得的标准品和样品的发光值的平均值除以第一个标准(O标准)的发光值作为纵坐标，HAAH蛋白浓度作为横坐标作标准曲线；
图3为20例肺癌患者和20例正常人血清中天冬氨酸β羟化酶(HAAH)检测结果；
图4为20例肝癌患者和20例正常人血清中天冬氨酸β羟化酶(HAAH)检测结果；
图5为20例结肠癌患者和20例正常人血清中天冬氨酸β羟化酶(HAAH)检测结果； 图6为20例乳腺癌患者和20例正常人血清中天冬氨酸β羟化酶(HAAH)检测结果； 图7为使用本专利所产单克隆抗体作为一抗，进行免疫组化的实验结果； 图8为使用本专利所产单克隆抗体作为一抗，进行免疫印记的实验结果，其中从左往右分别为正常组织，乳腺癌组织，肺癌组织，结肠癌组织。
【具体实施方式】
[0010]以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
[0011](I) HAAH抗原的制备
通过PCR (Polymerase Chain Reaction)方法扩增得到人天冬氨酸β轻化酶(HAAH)羧基末端559-758的编码区DNA序列，将PCR产物纯化，并用DNA限制性内切酶BamHI和EcoRI消化，酶切产物经纯化，克隆到原核表达载体PETM3C (该载体改造自Novagen ρΕΤ系列质粒)当中。经PCR验证的阳性克隆送交测序，将测序正确的质粒经CaCl2法转化表达菌株大肠杆菌疋coli BL21 (DE3)。
[0012]从LB氨苄青霉素抗性平板上挑取单克隆菌落接种到IOmlLB培养基中，37° C过夜培养。将过夜培养菌液接种于IL培养基中37° C培养至0D_ 0.6-0.8，以浓度为0.2mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β -D-l-Thiogalactopyranoside, IPTG)低温诱导蛋白表达16到20小时。离心收获细菌，弃掉上清，菌体保存于-80° C待用。
[0013]将菌体悬浮于30ml QLB裂解液(50 mM磷酸钠，300 mM氯化钠，10 mM咪唑pH 8.0)，超声破碎细胞，18000转离心30分钟，取上清。将上清用0.2Mm滤膜过滤后与预先平衡的N1-NTA (Qiagen)树脂于冻室(4° C)内孵育I小时。将未能与树脂结合的部分放出，用QLB溶液洗一次，最后用QLB洗脱液(50 mM磷酸钠，300 mM氯化钠，250 mM咪唑PH 8.0)将重组蛋白从树脂上面洗脱下来。用Img凝血酶于4° C过夜消化洗脱得到的重组HAAH 559-758蛋白，以除去融合于羧基末端的6xHis标签。所得产物为N末端含有4个额外氨基酸(Gly-Pro-Gly-Ser)的重组HAAH 559-758蛋白粗产物。
[0014]将蛋白粗产物用离心浓缩管(Amicon Ultra, Millipore)将体积浓缩至5ml,用阳离子交换树脂预装柱MonoS HR5/5 column(GE healthcare),进一步纯化。MonoS柱由AKTAQ920 (GE healthcare)快速蛋白液相色谱系统驱动。将MonoS柱纯化出的产物经凝胶过滤层析柱Superdex75 10/300GL(GE healthcare)进一步纯化，即得到用于抗体制备以及作为检测自身抗体的捕获抗原与免疫检测试剂盒中的标准品的HAAH重组蛋白。重组蛋白的正确性经过质谱验证其正确性，蛋白保存所用缓冲液为50 mM磷酸钠，50 mM氯化钠，5%甘油，ImM EDTA pH 7.0 (如图1所示，从左到右分别为蛋白marker和纯化后的蛋白)。
[0015](2)单克隆抗体的制备
а.常规免疫
采用鼠龄在8-12周的BALB/c小鼠作为免疫动物，采用腹腔注射的方式进行免疫，免疫分为首次免疫和加强免疫，最终加强；
首次免疫:剂量:抗原IOOPg+弗氏完全佐剂(I: 1)0.5ml/鼠；
加强免疫:剂量:抗原5(^g+弗氏不完全佐剂(I: 1)0.5ml/鼠；
最终加强:剂量:抗原5(^g 0.5ml/鼠；
每次免疫之间间隔3周，总共免疫5次，每次免疫7天后采血，并进行ELISA血清效价检测，效价不足则继续加强，效价足够则进入最终免疫。最终加强4天后，处死动物取脾脏细胞。
[0016]b.ELISA测定抗血清效价(血清滴度)
1.包被:将抗原用碳酸盐缓冲液稀释至0.l-lOPg/mL，加入样品孔中，每孔10(^L，4°C过夜或37°C 2小时；
2.洗涤:倒去样品，用PBST冲洗样品孔3次，蒸馏水冲洗一次，拍干；
3.封闭:每孔加入BSA-PBS300μ?，室温封闭I小时；
4.一抗(抗血清)结合:各样品孔加入封闭液梯度稀释的抗血清ΙΟΟμ?，室温孵育I小
时；
5.洗涤:如步骤2;
б.二抗(酶标抗体)结合:每孔加入用封闭液稀释的抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗，每孔5(^L，37°C孵育I小时；
7.洗涤:如步骤2;
8.显色:每孔加入显色液75PL，37°C显色15分钟，终止反应，20min内测定OD值。
[0017](3)细胞融合
a.骨髓瘤细胞(SP2/0)准备
1.融合前2-3天,传代一次。融合前8小时换液一次；
2.骨髓瘤细胞(约250cm即3X 75cm VS I个小鼠脾脏)1500rqm 5分钟，去上清；
3.用无血清培养基重悬，1500rpm5min离心，去上清，如上洗骨髓瘤细胞共三次。定容IOml计数,并计算细胞活力，总数应> IxlO7,活力应> 95%。
[0018]b.小鼠脾细胞 准备
1.引颈处死小鼠，75%酒精浸泡10分钟，消毒体表以及皮毛；2.切开腹部皮肤，暴露腹腔；
3.剪开腹部腹膜,暴露内部组织,取出脾脏；
4.分离出脾细胞，把脾细胞移入离心管，室温静置5分钟；
5.以1500rpm转速，离心5分钟去上清液；
6.用无血清培养基(或D-Hank’s液)重悬洗3次；
7.计数，活力测定:总数应I~2X 108，活力应> 95%。
[0019]c.收集饲养细胞(可在融合前一天制备，或制备好置于CO2温箱2-4小时，常用小鼠腹腔细胞-巨噬细胞，胸腺细胞或细胞培养上清液)
1.引颈处死小鼠(不能损伤胸腹部血管)，75%酒精浸泡，消毒体表；
2.切开腹部皮肤，向两侧剥离，暴露腹腔；
3.在小鼠的腹膜上面剪一个小口，用一个弯嘴镊子夹起腹膜；
4.用无菌塑料吸管吸取2- 5ml的培养基，注射入小鼠腹腔；
5.按摩腹壁,反复抽吸,收集细胞(抽出液变为淡黄色)。重复3-5次；
6.按照细胞的浓度以及接种的培养板的数目，定容培养基；
7.50μ1/孔接种培养板，37°C培养箱培养培养一天左右，观察以备用。
[0020]d.细胞融合(所有试剂以及培养基置于37°C水浴):
1.SP2/0细胞与脾细胞1:5混合，以1500rpm转速离心10分钟，去上清液；
2.用无血清的培养基重悬、洗涤混合细胞2次；
3.尽量吸去上清，弹动离心管底部，使细胞成糊状；
4.取ImlPEG / DMSO融合剂一滴滴沿着管壁加入细胞团中，60秒内加完，同时不断轻轻转动离心管或用手指轻弹，静置90秒；
5.滴加无血清DMDM培养基2ml，终止PEG作用，3分钟内加完；
6.滴加7mlDMDM完全培养基，3分钟内加完；
7.轻轻吹打细胞，混匀，以1000rpm转速离心10分钟，去上清液。用HAT完全培养液重悬细胞，调整细胞浓度；
8.根据实验要求补加HAT培养基，然后ΙΟΟμΙ/孔加到细胞培养板中，一个脾脏铺10块板，置于5% CO2温箱内37°C培养；
9.第五天更换HAT培养基，同时每天观察克隆的生长情况，记录克隆的状态；
10.克隆长成后，据情况再做处理。
[0021]e.筛选阳性克隆
1.融合之后，待到细胞克隆长到一定的程度，在培养板上标记相应的克隆状态；
2.先在酶标板上包被0.1-1OPg左右的抗原，封闭；
3.从克隆孔中吸出50_100μ1细胞培养上清，直接加到酶标板中，和已经包被在酶标板上的抗原结合，以下步骤同ELISA ；
4.根据实验的结果，挑选OD值较高的克隆，转入24孔板；
5.用ELISA反复的检测克隆，直至稳定。
[0022](4) ELISA方法鉴定抗体
a.将特异性抗体包被固相载体。孵育一定时间，使形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体和杂质；b.加待检标本，孵育，使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质；
C.加酶标特异性抗体，孵育，使形成固相抗体待测抗原酶标抗体夹心复合物。洗涤除去未结合酶标抗体；
d.加底物显色。固相上的酶催化底物产生有色产物，通过比色测标本中抗原的量。
[0023](5) ELISA 结果判断
所获得的标准品和样品的发光值的平均值除以第一个标准(O标准)的发光值作为纵坐标，HAAH蛋白浓度作为横坐标作标准曲线，每个样品的浓度都可以从标准曲线上读出；
标准曲线如下，取浓度为 0.1, 0.2,0.4,0.8,1.6, 3.2,6.4,12.8, 25.6ng/ml 的 HAAH 标准品得标准曲线如图2所示；
小量肺癌样本检测结果如图3所示，敏感性和特异性均为95% ;小量肝癌样本检测结果如图4所示，敏感性和特异性均为95% ;小量结肠癌样本检测结果如图5所示；敏感性和特异性均为95% ;小量乳腺癌样本检测结果如图6所示，敏感性为90%和特异性为95%。
[0024](6)免疫组化检测
1.制备石蜡或是冰冻切片；
2.将切片在室温平衡15分钟，湿盒；
3.用0.3% H2O2的甲醇溶液处理切片，消除内源性过氧化酶的影响干扰；
4.用双蒸水清洗切片3次，每次2分钟左右；
5.抗原修复；
6.封闭用IOOul羊血清或3%的BSA封闭切片标本30分钟，37°C，湿盒；
7.一抗每孔加入20ul—抗，37°C，湿盒，孵育lh，用PBST清洗5次；
8.加入荧光标记二抗，每孔20ul，37°C，湿盒，30分钟，用PBST清洗5次；
9.镜检；
使用本专利所产单克隆抗体作为一抗，进行免疫组化实验，结果如图7所示。
[0025](7)免疫印迹反应检测
1.抗原处理准备抗原(蛋白或细胞裂解液)，用LoadingBuffer稀释抗原，沸水浴3 — 5分钟，变性抗原；
2.配胶根据项目需要，配制合适浓度的分离胶以及浓缩胶；
3.配制电泳缓冲液以及转膜缓冲液，同时将转移缓冲液放入_20°C预冷；
4.上样分别点上适量的样品以及相应的Marker;
5.电泳恒压或是恒流电泳；
6.固定用含20%甲醇的电转缓冲液平衡、固定凝胶30分钟；
7.把转膜所用的滤纸以及膜用电转缓冲液平衡；
8.按照滤纸、膜、凝胶、滤纸的顺序将转移夹分别固定在正极以及负极；
9.转膜4°C，恒流，在转移缓冲液中间放上冰袋，同时用磁力搅拌器搅拌。中间更换冰袋一次，以保证缓冲液温度一直维持在4°C左右；
10.封闭用5%的脱脂奶粉或3%的BSA-PBS封闭膜，室温封闭1小时；
11.一抗加入细胞培养上清、纯化抗体、腹水或稀释血清，室温孵育2小时；
12.洗膜用PBST洗膜3-5次，每次10分钟；13.二抗加上合适稀释度的HRP或AP标记的二抗；
14.洗膜同步骤12；
15.加入底物，显色(或发光)；
免疫印记结果如图8所示，从左往右分别为正常组织，乳腺癌组织，肺癌组织，结肠癌组织。
【权利要求】
1.一种制备人天冬氨酸β羟化酶(HAAH)羧基末端蛋白的工艺，其特征在于，它通过克隆人HAAH蛋白对应的编码核酸序列，利用特定的蛋白表达系统，大量的表达HAAH蛋白羧基末端559-758蛋白片段，并采用相关的技术手段予以纯化。
2.以上所述蛋白表达系统包括大肠杆菌蛋白表达系统。
3.以上所述蛋白表达系统包括酵母蛋白表达系统。
4.以上所述蛋白表达系统包括昆虫细胞蛋白表达系统。
5.一种诊断人体内肿瘤的方法，其特征在于，它通过具有可检查标记的HAAH抗体，特异性的和人体内组织或体液的HAAH蛋白结合，同正常的组织或体液向比较，其增加的结合水平的组织或体液表示有肿瘤存在。
6.人天冬氨酸β羟化酶(HAAH)羧基末端(559-758)重组蛋白可以作为用于检测血液中天冬氨酸β羟化酶自身抗体水平的捕获抗原。
7.人天冬氨酸β羟化酶(HAAH)羧基末端(559-758)重组蛋白可以作为用于定量检测血液中天冬氨酸β羟化酶蛋白水平的免疫检测试剂盒中的标准品。
【文档编号】C12N9/02GK103789280SQ201410083065
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】魏准, 杨旸, 董小林, 张伟 申请人:深圳北京大学香港科技大学医学中心