一种双链siRNA分子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物医药【技术领域】，具体涉及一种双链siRNA分子及其应用，更具体地，本发明针对大鼠垂体瘤细胞MMQ细胞中D2R基因的核苷酸序列设计合成siRNA，所述siRNA转入MMQ细胞后能明显促进催乳素的合成和分泌。
【专利说明】-种双链s i RNA分子及其应用 【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药【技术领域】，具体涉及一种双链siRNA分子及其应用，更具体 地，本发明针对大鼠垂体瘤细胞MMQ细胞中D2R基因的核苷酸序列设计合成siRNA，所述 siRNA转入MMQ细胞后能明显促进催乳素的合成和分泌。 【背景技术】
[0002] RNA干扰（siRNA)是机体内广泛存在的一种双链RNA介导的序列特异性基因沉默 现象[Fire A.，et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNAin Caenorhabditis elegans.Naturel998;391 :806-811]，因其具有沉默效率高、特异 性强以及操作简便等优于传统基因敲除手段的优点而得到迅速发展，现成为生命科学领域 中重要的石开究工具[Arziman Z.，et al. E-RNAi ：a web application to design optimized RNAi constructs. Nucleic Acids Res2005;33:W582-W588]。siRNA 与蛋白质结合形成 RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC)。该复合物能够结合到同源的 mRNA上并诱导其降解。
[0003] 药源性高催乳素血症是临床常见的不良反应，发生率高达42%-66% [Halbreich U. , et al.. Hyperprolactinemia and schizophrenia ：mechanisms and clinical aspects. Journal ofpsychiatric practice2003 ;9 :344-353]，短期内引起泌乳、闭经，长 期会造成体重增加、骨质疏松及增加乳腺癌、子宫内膜癌的发病率，严重影响患者的身心健 康及治疗的依从性。
[0004] 催乳素的调节是一个很复杂的系统，涉及多种神经递质、神经肽、代谢产物、 机体的激素信号改变等。这些因素大体可以分为两类：催乳素释放因子（PRF)和催乳 素抑制因子(PIF) [Madhusoodanan S, . et al. Hyperprolactinemia associated with psychotropics-a review. Human psychopharmacology2010 ;25 :281-297] 〇 多巴胺是 最主要的催乳素抑制因子（PIF)，它通过垂体催乳素细胞膜上的多巴胺D2受体（D2R)， 抑制催乳素的合成和释放[Cookson J·，et al· Prolactin，hyperprolactinaemia and antipsychotic treatment ：a review and lessons for treatment of early psychosis. J Psychopharmacol2012 ；26 :42-45] 〇
[0005] MMQ细胞是一种来源于大鼠垂体瘤细胞的典型高催乳素血症细胞模型[Judd AM.， et al. Characterization of the MMQ cell, a prolactin-secreting clonal cell line that is responsive to dopamine. Endocrinologyl988;123 :2341-2350]。MMQ 细胞的细 胞膜上含有多巴胺D2受体（D2R)，能够对多巴胺及多巴胺类药物反应。溴隐亭等多巴胺受 体激动剂能够激动MMQ细胞上的D2R，抑制其胞内催乳素的分泌。临床中，甘草作为一种中 草药，经常被用来治疗高催乳素血症。甘草苷是一种从甘草中提取的重要天然化合物，尽管 现有文献已报道甘草苷具有治疗咳嗽、炎症、咽炎、抗心律失常、胃溃疡、肿瘤、脂肪肝、心肌 缺血、脑血栓、脑缺氧等作用，还未见关于甘草苷治疗高催乳素血症的报道，但是甘草苷作 为甘草中的活性成分，其作为候选药物在治疗高催乳素血症方面的疗效值得期待。为了研 究候选药物对高催乳素血症的疗效及其作用机制，通常采用siRNA干扰的技术方案：利用 针对D2R的siRNA，干扰D2R的功能，给研究对象施用候选药物，通过检测催乳素的合成和分 泌情况，验证该候选药物是否具有治疗高催乳素血症的功效。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于公开一种高效的针对D2R基因的广谱小分子干扰RNA (SiRNA)。 因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种双链siRNA分子，根据本发明的实施例， 该双链siRNA分子由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成：
[0007] siRNA ：
[0008] 正义链：5, -caGCAGGATTCACTGTGACAT-3,（SEQ ID NO :1)，
[0009] 反义链：5' -ATGTCACAGTGAATCCTGCTG-3'（SEQ ID NO :2);
[0010] 本发明提供了 siRNA分子在制备降低细胞D2R基因表达试剂中的应用。
[〇〇11] 本发明提供了 siRNA分子在制备促进细胞催乳素分泌试剂中的应用。
[0012] 本发明提供了 siRNA分子在制备促进细胞催乳素合成试剂中的应用。
[0013] 优选地，本发明使用的细胞是MMQ细胞。
[0014] 根据本发明的实施例，siRNA能明显降低D2R基因的表达水平。
[0015] 根据本发明的实施例，siRNA能明显缓解甘草苷介导的催乳素分泌的抑制。
[0016] 根据本发明的实施例，siRNA能明显缓解甘草苷介导的催乳素合成的抑制。
[0017] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。 【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1显示了利用免疫印迹的方法检测siRNA对D2R基因的沉默效果；
[0019] 图2显示了 siRNA对催乳素分泌的影响；
[0020] 图3显示了 siRNA对催乳素表达的影响，其中：
[0021] 图3a显示了利用QPCR检测siRNA对催乳素基因转录水平的影响；
[0022] 图3b显示了利用免疫印迹检测siRNA对催乳素基因表达水平的影响。 【具体实施方式】
[0023] 下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅 用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0024] 实施例1 siRNA对D2R基因沉默效果的检测实验
[0025] 1. 1主要仪器：细胞培养箱（Thermo)。
[0026] L 2主要材料和试剂：脂质体2000转染试剂（Invitrogen)，DMEM培养基（Gibco)。
[0027] 1.合成 siRNA
[0028] 在Genebank中找到D2R的基因序列（GenBank-ID :NM_012547)。由上海吉凯基因 公司设计及化学合成，共设计三对siRNA序列，2. 00D(5nmol)*2只，如下：
[0029] siRNAl ：
[0030] 正义链：5, -caGCAGGATTCACTGTGACAT-3,（SEQ ID NO :1)，
[0031] 反义链：5' -ATGTCACAGTGAATCCTGCTG-3'（SEQ ID NO :2);
[0032] siRNA2 ：
[0033] 正义链：5，-caGGATTCACTGTGACATCTT-3，，
[0034] 反义链：5, -AAGATGTCACAGTGAATCCTG-3,；
[0035] siRNA3 ：
[0036] 正义链：：5, -aaCCTGTGTGCCATCAGCATT-3，，
[0037] 反义链：5, -AATGCTGATGGCACACAGGTT-3,；
[0038] 空的靶基因 siRNA(siNT)
[0039] 正义链：5 ' -UUAAGUAGCUUGGCCUUGAtt-3 '，
[0040] 反义链：5' -UCAAGGCCAAGCUACUUAAtt-3,。
[0041] 2.沉默效率验证
[0042] 2. 1细胞培养:MMQ细胞在含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% 0)2培养箱培 养。
[0043] 2. 2细胞铺板并转染：将细胞按1X104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5% C〇2培养箱细胞培养24小时，在无双抗含10% FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染 试剂2000(购自于Invitrogen公司）的说明书转染，实验分为未转染组、阴性对照组和实 验组（20nM)，其中阴性对照组siRNA为通用对照siRNA，即siNT，与D2R基因的序列无同源 性，浓度为20nM/孔。同时分别转染。
[0044] 2. 3免疫印迹（western blot)检测D2R基因蛋白表达水平：按照3. 2的方法转 染MMQ细胞后48小时，用细胞裂解液（150mM氯化钠+1% NP-40(去垢剂）+0. 1% SDS (去 垢剂）+2yg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制剂）（使用前加入）+2yg/ml Leupeptin(蛋白酶 抑制剂）（使用前加入）或ImM PMSF(蛋白酶抑制剂）+1. 5mM EDTA(蛋白酶抑制剂）+lmM NaVanadate(磷酸脂酶抑制剂））收集细胞，用BCA蛋白检测试剂盒进行蛋白浓度的测定， 各实验组取50 μ g蛋白进行SDS-PAGE，转膜，5 %脱脂奶粉封闭，接着加入D2R抗体在4 °C孵 育过夜，膜用TBST液洗涤3次，然后再用辣根过氧化物酶（HRP)标记的山羊抗小鼠（中杉 金桥有限公司，1 :5000)室温孵育lh。用ECL免疫印迹化学发光试剂孵育5min后曝光、显 影、定影。用凝胶成像分析系统对X-光片进行扫描并计算光密度值。蛋白相对表达量=待 测蛋白的光密度值/内参的光密度值。管家蛋白β-actin为内参。
[0045] 2. 4统计处理：所有数据采用均数土标准差的方式，采用SPSS17. 0统计软件对 实验结果进行独立样本t检验和单因素方差分析，P < 0. 05视为差异有显著性（*代表P < 0· 05 ;# 代表 P < 0· 01)。
[0046] 结果分析：siRNA与siNT瞬时转染MMQ细胞48小时后，siRNAl组MMQ细胞D2R 蛋白的表达水平（0. 23±0. 12)与 siNT 组（0. 81±0. 24)、空白对照组（CTRL) (0. 94±0. 21) 相比有了显著减少，siRNA对MMQ细胞的D2R蛋白表达抑制率为73. 7% (F = 23. 89, P = 0. 00)。siRNA2组MMQ细胞D2R蛋白的表达水平（0. 68±0. 19)，siRNA3组MMQ细胞D2R蛋 白的表达水平（0. 57±0. 24)与siNT阴性对照组（0. 81±0. 24)、空白对照组（0. 94±0. 21) 相比，对MMQ细胞的D2R蛋白表达抑制率分别为22%和35%。这些数据表明siRNAl能在蛋 白水平强力抑制D2R的表达（图1)。每组三个平行样。因此在下面的实验中均使用siRNAl 进行基因的沉默，即下文中的siRNA即代表siRNAl。
[0047] 实施例2 D2R基因沉默对MMQ细胞催乳素分泌的影响
[〇〇48] ELISA检测试剂盒检测细胞培养基中催乳素的含量：首先将标准品和待检测样本 各50 μ 1加入到相应的反应孔中。每孔加入100 μ 1酶连物（大连泛邦公司），轻轻混匀30s， 室温60min。用洗漆液洗板5次，加入100 μ 1显色液，轻轻混匀10s,室温20min。每孔加入 50 μ 1终止液，轻轻混匀30s，30min内在ELISA检测仪上测定各孔的吸光度（A450nm值）。 根据标准品的浓度和吸光度做标准曲线，计算待测样本的催乳素含量。每次实验重复3次， 取平均值。
[〇〇49] 细胞培养和细胞转染：方法同实施例1
[0050] 细胞转染48小时后，实验组、阳性对照组、空白对照组每组中细胞分别进行下列 处理：不加药物（CTRL)处理、甘草苷100yM(Liql00)处理、溴隐亭ΙμΜ(ΒΜΤ)处理，24小 时后，收集细胞培养基利用ELISA检测试剂盒检测催乳素的分泌情况。
[0051] 统计处理：所有数据采用均数土标准差的方式，采用SPSS17. 0统计软件对实验结 果进行独立样本t检验和单因素方差分析，P < 0. 05视为差异有显著性（*代表P < 0. 05 ; # 代表 P < 〇· 01)。
[0052] 结果分析：甘草苷处理后与同组的阴性对照（siNT)和空白对照（CTRL)相比，MMQ 细胞催乳素的分泌减少了，但是经过siRNA干扰后，甘草苷抑制MMQ细胞催乳素分泌的结果 消失了，表明甘草苷通过D2R的介导，抑制了催乳素的分泌（图2)。
[0053] 实施例3 D2R基因沉默对MMQ细胞催乳素基因表达的影响
[0054] 1. QPCR检测催乳素基因转录水平的变化
[0055] 1. 1仪器：PCR仪（ABI公司）；实时定量PCR仪（Bio-Rad);细胞培养箱（Thermo)， 等。
[0056] 1. 2材料和试剂：mRNA提取纯化试剂盒（CWbio. Co. Ltd)，脂质体2000转染试剂 (Invitrogen)，DMEM 培养基（Gibco)，HiFi-MMLVcDNA 第一链合成试剂盒
[0057] 1. 3细胞培养:MMQ细胞在含10% FBS的DMHM培养基中，37°C、5% C02培养箱培 养。
[0058] 1.4细胞铺板并转染：将细胞按1X104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5% C〇2培养箱细胞培养24小时，在无双抗含10% FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染 试剂2000(购自于Invitrogen公司）的说明书转染，实验分为未转染组、阴性对照组和实 验组（20nM)，其中阴性对照组siRNA为通用对照siRNA，即siNT，与D2R基因的序列无同源 性，浓度为20nM/孔。同时分别转染。
[0059] 1. 5荧光实时定量PCR(QPCR)检测催乳素基因 mRNA水平：总RNA提取根据总RNA提 取试剂盒（CWbio. Co. Ltd，Cat#CW0581)说明书进行。用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒 (CWbio. Co. Ltd，Cat#CW0744)进行反转录，实验操作按产品说明书进行。GAPDH基因（内参） 的引物为 5'-TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3'（上游引物）和 5'-TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3'（下 游引物）。催乳素基因的引物为5' -TCAATGACTGCCCCACTTCT-3'（上游引物）和 5' -AAACAGAGGGTCATTCCAGG-3'（下游引物）。反应体系：用 UltraSYBR Mixture (With R0X) (CWbio. Co. Ltd，Cat#CW0956)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为： 95°C 10min，（95°C 15s，60°C 60s)*45 个循环。RealTime 反应体系为：
[0060]
【权利要求】
1. 一种双链siRNA分子，其特征在于，所述双链siRNA分子由下述核苷酸序列的正义链 和反义链组成： 正义链：5' -caGCAGGATTCACTGTGACAT-3'（SEQ ID N0:1)， 反义链：5' -ATGTCACAGTGAATCCTGCTG-3'（SEQ ID NO :2)。
2. 权利要求1所述的双链siRNA分子在制备降低细胞D2R基因表达试剂中的应用。
3. 权利要求1所述的双链siRNA分子在制备促进细胞催乳素蛋白分泌试剂中的应用。
4. 权利要求1所述的双链siRNA分子在制备促进细胞催乳素蛋白表达试剂中的应用。
5. 权利要求2至4中任一项所述的应用，其特征在于，所述细胞是MMQ细胞。
【文档编号】C12N15/113GK104109670SQ201410088696
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2014年3月12日
【发明者】王传跃, 徐志卿, 张志洋 申请人:首都医科大学附属北京安定医院