一种烟草白粉病菌生理小种的鉴别方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草白粉病菌生理小种的鉴别方法，其中，按照下述步骤操作：A、鉴别寄主(鉴别寄主体系：烤烟品种CF203、G140、K346、净叶黄和晒烟品种塘蓬)的培育和白粉菌的纯化与繁殖；B、接种、调查和抗性类型划分，将烟草白粉病菌纯化后的分离物接种上述5个鉴别寄主；C、DNA提取；D、利用S42寡聚核苷酸随机引物进行PCR扩增DNA；E、电泳检测PCR结果和数据聚类分析；F、分析生物鉴定与S42寡聚核苷酸随机引物PCR扩增DNA数据聚类分析的结果，将烟草白粉病菌划分为不同的生理小种。本发明弥补了烟草白粉病菌生理小种鉴别寄主体系和鉴别方法的空白，为烟草白粉病菌的研究提供了技术支撑，同时为烟草白粉病的防治与抗病育种奠定了理论基础。
【专利说明】一种烟草白粉病菌生理小种的鉴别方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及农业生物【技术领域】，特别涉及一种烟草白粉病菌生理小种的鉴别方法。
【背景技术】:
[0002]烟草白粉病俗称“上灰”、“下霜”、“上硝”。该病多为害成熟老叶，由下向上发展。叶片发病，初为近圆形的黄褐色小斑，后斑上现白色粉状小点，使病斑呈粉状，斑块扩大，白粉布满整个叶片，病叶先褪绿变褐，后枯死。严重时为害嫩茎，病茎上也布满白粉。病叶烘烤后薄如纸，丧失经济价值。中国各烟区均有发生，其中以华南、西南和华中烟区最为普遍，危害也较重。烟草白粉菌除为害烟草外，还可为害葫芦科、菊科等植物。发病部位以叶片为主，病斑多从下向上扩展。主要发生在大田期。病害症状为:幼苗受害后，叶上长满白粉，叶色变黄，逐渐干枯死亡。大田期成株发病，通常在比较老熟的叶片上先发生，从脚叶开始由下而上逐渐蔓延，很快遍及全株，被害的叶表面出现近圆形的病斑，然后整个叶呈灰色，着生一层白色物。严重时也危害嫩茎，后期病部组织变黄、变褐而枯死。病原为二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum DC.),属于子囊菌亚门，核菌纲，白粉菌目，白粉菌属。苗期和成株期均可发生。但有性阶段很少发现。病菌菌丝具分隔，无色。无性态的分生孢子梗与菌丝垂直，丝状，较短，无分枝，大小约80-120X12-14微米，顶生分生孢子。分生孢子串生，由上而下顺次成熟，无色，单胞，圆筒形，大小为30-32 X 13-15微米。病菌生长适温22°C -28°C。分生孢子萌发最适温度23°C _25°C，最适相对湿度60% -80%。在相对湿度20%以下仍有少数孢子可以萌发，但在相对湿度100%或水滴中却极少能萌发。病菌属专性寄生菌，全部菌丝体长在寄主表面，以 吸胞伸入寄主表皮细胞内吸取养分。病菌存在生理分化现象，有许多不同致病型，它们对不同寄主的致病力差异很大。病菌寄主范围广，除烟草外，还能侵染葫芦科、菊科等100多种植物。传播途径:病菌在病残体、茄科寄主或再生烟上越冬，借风、雨进行传播。发病的最适温度为16-26°C、相对湿度为60-75%。施氮肥过多、烟株生长茂密、田间通风透光不良时，下部叶片易发病。该菌喜中温中湿的环境条件，反而高温高湿时，则不利于孢子的萌发和侵入。
[0003]烟草白粉病不仅可造成烟叶质量大幅下降，而且还可引起烟株死亡，是为害烟草的重要病害之一。据报道侵染烟草的二孢白粉菌是异宗配合的，Morrison用多个相似的株系接种烟草叶圆片，5周后可获得成熟的子囊壳。研究资料还表明，二孢白粉菌包含2种类型，大概2个等位基因控制配合力；此外事实证明来自不同寄主植物的分离物构成了特殊遗传配合力的生理小种。这都证明烟草白粉病菌的生理小种会不断出现。如何阻止病菌变异和不断出现的新的强致病力生理小种，这是目前国际上科学家关注的热点问题之一。因此摸清目前烟草白粉病菌在我国发生的主要生理小种类型，是防治烟草白粉病的基础。
[0004]近年来，分子标记技术如RAPD、AFLP, SSR、SCAR等已广泛应用于植物病原菌生理小种的分类、群体毒性与DNA多态性的研究(时焦等，2002)。Nicholson et al (1999)应用RAH)分析和DNA指纹鉴别了玉米小斑病菌O、C、T 3个生理小种。朴春根等(1996)应用了45个随机引物对我国小麦条锈病菌的6个生理小种进行RAH)分析，结果将供试小种分为两组。研究结果表明，RAH)分析是鉴定种属特异性、群体遗传结构和指纹图谱分析等的有效手段之一。但目前尚无将分子标记技术应用于烟草白粉病菌生理小种与遗传多态性研究的报道。
[0005]生理小种是指种和变种内形态相同，但致病力等方面均有不同表现的群体，这些群体对不同品种的致病力可以存在差异。目前比较常用的传统的生理小种鉴定方法是采用鉴别寄主，配合生理生化特性研究的生物鉴定手段。如中国专利申请2010105435707公开了大麦白粉病菌致病型鉴别寄主体系的构建方法，该方法包括:(I)菌株的采集与病原菌毒性类型的划分；(2)备选大麦品种或品系的收集与鉴别；(3)备选鉴别寄主抗病性和病原菌致病性的测定；(4)鉴别寄主体系的建立等步骤。这种方法为传统的鉴别方法，存在时间长，误差大的缺点。而且，小麦为粮食作物，烟草为经济作物，其种植地区，生长所需条件，物性本身属性等均不相同，所以，针对烟草用常规方法鉴别白粉病菌的生理小种效果不好。鉴于上述技术问题，需要探索出一种方法简单，鉴别准确，筛选快速的一种烟草白粉病菌生理小种的鉴别方法。此方法将生物鉴定与分子生物学鉴定相结合，弥补了烟草白粉病菌生理小种鉴别寄主体系与生理小种鉴别方法的空白，为烟草白粉病菌的研究提供了技术支撑，同时为烟草白粉病的防治与抗病育种奠定了理论基础。
【发明内容】
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[0006]本发明的目的在于克服现有技术的缺乏，提供方法简单，鉴别准确、快速的一种烟草白粉病菌生理小种鉴别方法。弥补烟草白粉病菌生理小种鉴别寄主体系与生理小种鉴别方法的空白，为烟草白粉病菌的研究提供技术支撑，同时为烟草白粉病的防治与抗病育种
奠定理论基础。
[0007]为了实现上述目的，本发明提供了一种烟草白粉病菌生理小种的鉴别方法，其特征在于，按照下述步
[0008]骤操作:
[0009]A、鉴别寄主烟苗的培育和分离物的纯化与繁殖
[0010]烟苗的培育:将晒烟品种塘蓬，烤烟品种CF203、G140、K346和净叶黄按照常规育苗方法于无菌隔离条件下育苗，培育至7-8片真叶时备用；
[0011]分离物的纯化与繁殖:从主要产烟区采集33个新鲜白粉病样品(表1)，然后在无烟草白粉病菌的隔离条件下，用病叶样品接种烟草感病品种中烟90烟株，进行纯化，并利用新形成的单个粉孢子堆上的粉孢子进行病菌繁殖，将繁殖所得纯培养用于生理小种的鉴定;
[0012]表1 33个分离物编号与来源
[0013]
【权利要求】
1.一种烟草白粉病菌生理小种的鉴别方法，其特征在于，按照下述步骤操作: A、鉴别寄主烟苗的培育和白粉菌的纯化与繁殖: 烟苗的培育:将晒烟品种塘蓬，烤烟品种CF203、G140、K346和净叶黄以及晒烟品种塘蓬按照常规育苗方法于无菌隔离条件下育苗，培育至7-8片真叶时备用； 白粉菌的纯化与繁殖:从主要产烟区采集33个新鲜白粉病样品，然后在无烟草白粉病菌的隔离条件下，用病叶样品接种烟草感病品种中烟90烟株，进行纯化，并利用新形成的单个粉孢子堆上的粉孢子进行病菌繁殖，将繁殖所得纯培养用于生理小种的鉴定； B、接种调查和抗性水平划分: 采用喷雾接种法接种，接种用粉孢子浓度为IxlO4~16个孢子/mL，在无烟草白粉病菌的隔离室中，将步骤A中纯化的单个分离物接种到步骤A的5个烟草品种7-8片真叶期的烟苗，每个供试品种接种15~18株；隔离室温度25°C左右，相对湿度65%~75%;各品种烟苗随机排列，自然发病后进行观察记载，接种后3周，4周和5周，按照烟草行业白粉病调查分级标准，分别调查记载单片叶片的发病等级，并根据植物病理学病情指数计算公式计算病情指数，根据3次调查的平均病情指数计算得出相对抗病指数； 病情指数计算公式: 病情指数=100X Σ (各级病叶数X各级代表值)/(调查总叶数X最高级代表值) 相对抗病性评价方法: 依据其相对抗病指数L 00，0.60~0.99和< 0.59将抗病类型分别划分为:免疫(I)、抗病(R)和感病⑶；相对抗病指数和相对病情指数的计算方法为: 相对抗病指数=1-相对病情指数， 相对病情指数=鉴定品种平均病情指数/对照品种平均病情指数(对照品种为发病最严重的品种)； C、DNA提取 白粉病分离物经纯化后接种烟草感病品种中烟90烟株，从发病严重的烟株上收集白粉病菌粉孢子于1.5mL离心管中，于_20°C冰箱中贮藏，以备提取DNA ； DNA提取采用CTAB法，选用北京艾德莱生物试剂有限公司生产的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒提取，研磨前在装有粉孢子的1.5mL离心管中放少许灭过菌的石英砂，利于研磨；用1%的琼脂糖电泳检测DNA质量，将提取好的DNA置于-20°C冰箱中保存，用于PCR ； D、用引物S42进行PCR扩增DNA 利用Invitrogen公司生产的S42寡聚核苷酸随机引物，以步骤C中提取的DNA为模板，进行PCR扩增； PCR(PCR所用试剂除引物外，都从北京艾德莱生物试剂有限公司购买)扩增反应总体积为 25 μ I，包括 2 X PCR Master Mix [Taq DNA 聚合酶(0.05U/uL)、MgC12 (4mmol)、0.4mmoldNTPs (dATP、dCTP、dGTP、dTTP) ] 12.5uL,引物(5umol/L) IuL,模板 DNA (20_40ng/uL) IuL,加ddH20至25uL ;同时以灭菌双蒸水代替模板DNA作为阴性对照；扩增程序为94°C 5min,94°C 30s,37°C 45s,72°C 70s, 44 个循环，72°C 7min ； E、电泳检测和数据分析: 以5000bp DNA MarkerIII (北京艾德莱生物试剂有限公司生产的)为分子量标记，取SuLPCR产物于1.0%琼脂糖凝胶上电泳，经溴乙锭染色后，拍照记录电泳图谱； 电泳图谱中的每一条带均作为I个位点，扩增片段的出现与否分别赋值“I”和“0”，制成0-1矩阵表。然后将制成的0-1矩阵表输入NTSYS-PC软件用UPGMA法进行聚类分析，自动生成树状图； F、分析结果并鉴定生理小种: 接种同一白粉菌分离物后，5个鉴别寄主为步骤A中所述的五种烟苗，发病情况存在差异，首先计算病情指数，然后计算相对抗病指数，划分不同鉴别寄主对某一白粉病菌分离物的抗病类型，根据5个鉴别寄主对不同白粉菌分离物的抗病类型，初步将白粉菌分离物划分为1-4号生理小种， 然后结合分子生物学鉴定，即利用Invitrogen公司生产的S42寡聚核苷酸随机引物进行PCR扩增DNA的结果进行聚类分析，以遗传相似系数0.83为阈值，将供试菌株划分为.4个类群，最终根据生物鉴定和分子生物学试验数据的聚类分析，将白粉病菌进一步划分为.1-6号生理小种，即生物鉴定为同一生理小种类型的，且S42扩增DNA结果的聚类分析聚为同一类的样品，就按生物鉴定划分结果，划分为同一生理小种，即1-4号生理小种。对于生物鉴定了生理小种类型，但在聚类分析中，未聚为同一类的样品，按照他们是否能够侵染塘蓬品种，分为另外2个生理小种，即5号和6号生理小种。如，生物鉴定结果，其中编号为1、.2、3、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19、22、23、24、25、26、27、29、30、31、32、33 的分离物在生物鉴定中属于生理小种I号，在聚类分析中编号为1、2、3、6、7、8、9、10、11、13、14、.15、16、17、19、25、26、27、29、30、31、32、33的分离物也聚为同一类，就划分为生理小种I号；.4和12号分离物在生物鉴定中属于生理小种2号，在聚类分析中也聚为同一类，就划分为生理小种2号；20和21号分离物在生物鉴定中属于生理小种3号，在聚类分析中也聚为同一类，就划分为生理小种3 号；28分离物在生物鉴定中属于生理小种4号，在聚类分析中也单独聚为一类，就划分为生理小种4号；5、18、22、23、24分离物在生物鉴定中属于生理小种I号，但在聚类分析中并未聚为同一类，按照他们是否能够侵染塘蓬品种，分为生理小种5号和生理小种6号，即不能够侵染塘蓬品种的为生理小种5号，能够侵染塘蓬品种的为生理小种6号。
【文档编号】C12Q1/04GK104031988SQ201410201602
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月7日 优先权日:2014年5月7日
【发明者】时焦, 孟坤, 张保全, 徐宜民, 雒振宁, 王海波 申请人:中国农业科学院烟草研究所