一种大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽及其制备方法和用途，该抗氧化胶原肽的氨基酸序列为Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly（SEQIDNo:1），ESI-MS检测给出分子量为631.70Da（[M+H]+632.49Da）。制备时以大黄鱼鱼鳞作为原料，按固液比1g:10~15mL加入2~3%盐酸处理20~24h，过滤除去盐酸后按照固液比1g:10~15mL加入0.08~0.10mol/LNaOH处理20~24h，过滤，蒸馏水洗至pH6.5~7.5，30~35℃干燥后用粉碎机粉碎；取鱼鳞粉末，按照料液比1g:8~10mL加入甘氨酸-NaOH缓冲液，调节pH值至9.0~10.0，最后将酶解液加热到90~95℃灭活5~10min，再依次经离心、超滤和层析，得到抗氧化胶原肽。本发明制备工艺科学合理，酶解过程易于监控，制得的抗氧化胶原肽具有活性强、易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂等应用。
【专利说明】一种大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鱼类抗氧化物质及其制备方法和用途，尤其涉及一种大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白是细胞外基质中最重要的组成部分，维持着皮肤和组织器官的形态和结构，是修复各损伤组织的重要原料物质，也是使身体保持年轻、防止老化的物质。鱼鳞中含有大量的胶原蛋白，与其他胶原蛋白相比，鱼鳞胶原蛋白易分解，容易被消化、吸收，有较高的利用价值。
[0003]鱼鳞胶原蛋白在酸、碱、热、酶的作用下水解，会产生鱼鳞胶原肽，外用可阻止阳光对皮肤的直接伤害，内服可预防游离基对皮肤的摧毁，具有良好的抗紫外损伤和抗氧化功效，已被应用于各种营养保健食品及化妆品中。
[0004]但是， 申请人:发现，以大黄鱼鱼鳞为原料,利用酶解技术制备大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽的工艺研究处于空白阶段，而以酶解产物为材料制备高活性鱼鳞抗氧化胶原肽及其应用更是未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽，该抗氧化胶原肽安全无毒副作用，抗氧化活性强和易于消化吸收，可清除自由基和抑制脂质过氧化作用。
[0006]本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽的制备方法，该工艺科学合理、易操作。
[0007]本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽的应用。
[0008]本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为:一种大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽，其特征在于该抗氧化胶原肽的氨基酸序列为Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQID No:1), ES1-MS 检测给出分子量为 m/z 631.70 Da ([M+H] + 632.49 Da)。
[0009]本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为:一种大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
I)将大黄鱼鱼鳞用自来水洗净，按照固液比I g:l(Tl5mL加入2~3%盐酸处理2(T24h，过滤除去盐酸后，按照固液比I g: 10~15 mL加入0.08~0.10 mol/L NaOH处理20~24 h ;过滤，蒸馏水洗至pH 6.5^7.5，30-35 1:干燥后用粉碎机粉碎。
[0010]2)取粉碎后鱼鳞粉末，按照料液比I g:8~10 mL加入缓冲液，调节pH值至9.0~10.0，于 45~50°C保温 5-10 min;
3)按照鱼鳞质量的1.5~2.0%加入碱性蛋白酶，于45飞(TC温度下酶解4飞h，将酶解液加热到90~95°C灭活5~10 min, 4500~5000 r/min离心10~15 min,取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到抗氧化胶原肽。[0011]作为优选，步骤2)中的缓冲液为pH为10的甘氨酸-NaOH缓冲液。
[0012]作为优选，步骤3)中的蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活力> 1.8 X IO6 U/g。
[0013]作为改进，步骤3)的超滤和层析的具体过程为:
超滤:将上清液调至pH 6.5~7.5，于0.10~0.15 MPa的工作压力和20~25 V的工作温度下采用分子量I kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，得超滤酶解液；层析:将上述超滤酶解液用双蒸水配成8~10 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解液；将上述离子交换层析酶解液用双蒸水配成8~10 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45飞5 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化，根据抗氧化活性得I个高活性抗氧化肽Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)。
[0014]优选，阴离子交换树脂为DEAE-52 cellulose，凝胶为葡聚糖凝胶G_15。
[0015]再优选，反相高效液相色谱条件为:进样量19~21 μ g ;色谱柱为Kromasil C18 ;柱温为30 0C ;流动相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脱:(T35 min乙腈浓度从O至50% ;洗脱速度1.0 mL/min ;紫外检测波长280 nm。
[0016]本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为:一种大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽的应用，其特征在于 Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)对 DPPH自由基、羟基自由基、ABT S自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)具有抗氧化活性强、易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂进行应用。
[0017]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明选用碱性蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合超滤分级和色谱精制，酶解过程易监控，同时制得的胶原肽具有较高的抗氧化活性；与化学合成的抗氧化剂相比较，本发明制得的抗氧化胶原肽具有抗氧化活性强、易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂等。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是本发明的阴离子交换树脂DEAE-52 cellulose层析图；
图2是本发明的阴离子交换树脂DEAE-52 cellulose层析所分离各组分的羟基自由基清除活性图；
图3是本发明的葡聚糖凝胶G-15层析图；
图4是本发明的葡聚糖凝胶G-15层析所分离各组分的羟基自由基清除活性图；
图5是本发明的葡聚糖凝胶G-15制备酶解物(F23)的RP-HPLC图；
图6是本发明的Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)的反相高效液相色谱(RP-HPLC)；
图 7 是本发明的 Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly(SEQ ID No:1)的高分辨质谱(ES1-MS)图和结构式。【具体实施方式】
[0019]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0020]一种大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽肽的制备方法，制备工艺流程如下:大黄鱼鱼鳞〃脱钙、去除非胶原蛋白"酶解"酶解物"超滤"离子交换层析"凝胶过滤层析"高效液相色谱制备"抗氧化胶原肽。
[0021]实施例1:1)将大黄鱼鱼鳞用自来水洗净，按照固液比I g: 10 mL加入2.5%盐酸处理24 h，过滤除去盐酸后按照固液比I g: 15 mL加入0.10 mol/L NaOH处理24 h ;过滤,蒸懼水洗至pH 7.0,35 1:干燥后用粉碎机粉碎。
[0022]2)取粉碎后鱼鳞粉末，按照料液比I g: 10 mL加入甘氨酸-NaOH缓冲液，调节pH值至 9.5,于 45°C保温 10 min;
3)按照鱼鳞质量1.5%加入碱性蛋白酶(酶活力≤1.8X106U/g)，于45 °C温度下酶解5 h，将酶解液加热到95 °C灭活10 min, 4500 r/min离心15 min,取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到抗氧化胶原肽。
[0023]①超滤:将酶解上清液调至pH 7.0，于0.12 MPa的工作压力和25 V的工作温度下采用分子量I kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，得超滤酶解液；
②DEAE-52cellulose阴离子交换层析:将上述超滤酶解液用双蒸水配成10 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.50 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解液(F2)(图1)
③凝胶层析:将上述离子交换层析酶解液(F2)用双蒸水配成10mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物(F23)(图2)
④高效液相色谱精制:将上述凝胶制备酶解物(F23)用双蒸水配成50μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化(条件:进样量20 μ g ;色谱柱为Kromasil C18(250 mm X 4.6 mm, 5 μ m);柱温为室温；流动相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脱:0-35 min乙腈浓度从O至50% ;洗脱速度1.0 mL/min ;紫外检测波长280 nm,根据抗氧化活性得I个高活性抗氧化肽(见图3)。
[0024]⑤结构检测:收集羟基自由基清除活性最高的I个抗氧化肽经检测为单一峰(见图4)，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-PiO-Thr-Gly-Phe-PiO-Gly (SEQID No:1)，ES1-MS 检测给出分子量为 m/z 631.70 Da ([M+H]+ 632.49 Da)(见图 5)。
[0025]将上述制得的大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ IDNo:1)进行DPPH自由基清除实验、羟基自由基清除实验、ABTS自由基清除实验、超氧阴离子自由基清除实验和脂质过氧化抑制实验。实验结果表明:Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly(SEQ ID No:1)对 DPPH 自由基(EC50 0.83 mg/mL)、羟基自由基(EC5tl 0.25 mg/mL)、ABTS(EC50 0.34 mg/mL)和超氧阴离子自由基(EC50 0.15 mg/mL)具有良好的清除作用；同时，Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用。
[0026]最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所 有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种大黄鱼鱼鳞蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)，分子量为 m/z 631.70 Da。
2.—种权利要求1所述的大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)将大黄鱼鱼鳞用自来水洗净，按照固液比Ig:l(Tl5mL加入2~3%盐酸处理2(T24h，过滤除去盐酸后按照固液比I g: 10~15 mL加入0.08~0.lmol/L NaOH处理20~24 h ;过滤，蒸馏水洗至pH 6.5^7.5，3(T35 °C干燥后用粉碎机粉碎； 2)取粉碎后鱼鳞粉末，按照料液比Ig: 8~10 mL加入缓冲液，调节pH值至9.0~10.0，于45~50 °C保温5~10 min ； 3)按照鱼鳞质量1.5~2.0%加入蛋白酶，于45飞O °C温度下酶解4飞h，将酶解液加热到90~95°C灭活5~10 min, 4500~5000 r/min离心10~15 min,取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到抗氧化胶原肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤2)中的缓冲液为pH为10的甘氨酸-NaOH缓冲液。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)中的蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活力≥1.8 X IO6U/g。
5.根据权利要 求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)的超滤和层析的具体过程为: 超滤:将上清液调至pH 6.5~7.5，于0.10~0.15 MPa的工作压力和20~25 1:的工作温度下采用分子量I kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，得超滤酶解液； 层析:将上述超滤酶解液用双蒸水配成8~10 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解液；将上述离子交换层析酶解液用双蒸水配成8~10 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用羟基配成45飞5 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化，根据抗氧化活性得I个高活性抗氧化肽Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述阴离子交换树脂为DEAE-52cellulose，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-15 ;所述反相高效液相色谱条件为:进样量19~21μ g ;色谱柱为Kromasil C18 ;柱温为室温；流动相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脱:0~35 min乙腈浓度从O至50% ;洗脱速度1.0 mL/min ;紫外检测波长280 nm。
7.一种权利要求1所述的大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽的应用，其特征在于Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)对 DPPH 自由基、羟基自由基、ABTS 自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ IDNo:1)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro_Gly(SEQ ID No:1)具有抗氧化活性强、易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂上应用。
【文档编号】A23L1/305GK103992386SQ201410218199
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月22日 优先权日:2014年5月22日
【发明者】迟长凤, 王斌, 陈荫, 胡发远 申请人:浙江海洋学院