用于同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重pcr引物及其设计方法

用于同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重pcr引物及其设计方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR引物及其设计方法，该设计方法包括利用引物设计软件设计同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的多重PCR引物组合、筛选竞争状态优势引物，利用PCR方法对竞争状态优势引物进行扩增验证，最后去除扩增引物中的竞争状态劣势引物，获得多重PCR引物组合，同时还公开了多重PCR的检测方法，与现有技术相比，本发明的优点在于：采用本发明建立的多重PCR的引物组合同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因，具有操作简便、快速，特异性强，灵敏度高等优点。
【专利说明】用于同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR引物及其设计方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种用于同时检测海洋粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的多重PCR引物及其设计方法。
【背景技术】
[0002]粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌，属于可以通过食物、水进行传播的病原菌。它们的生物学特性和致病性有一定的区别，但都可以引起食物中毒和消化系 统疾病。
[0003]粪肠球菌普遍存在于自然界，可引起心内膜炎，胆囊炎，脑膜炎，尿路感染及伤口感染等多种疾病。它对营养要求低，在普通营养琼脂上也可生长，能在10°c或45°C PH9.6或含6.5% NaCl肉汤培养基中生长。该菌对恶劣的外环境和冷冻条件具有较强的抵抗力，作为监测水质卫生，环境卫生质量的污染指标更具有卫生学意义。这种细菌作为一个有卫生学意义的细菌(该菌的污染在某些食品中也常被发现)，在我国有多次出现食物中毒情况，其中有一次与海洋食物清理不净相关。
[0004]迟缓爱德华菌属肠杆菌科，爱德华氏菌属，是引起鱼类水生动物的一种重要病原菌疾病，也能感染人类，可导致腹泻、营养性肝硬化、低烧等症状，有溶血素、侵入上皮细胞因子、杀伤吞噬细胞因子和软骨素酶等多种毒性因子。有该菌引起的食物中毒在新闻报道中较少，但是由其的危害不容忽视。
[0005]肉杆菌是一种直长杆菌，在环境中多有分布，在腐败物中常有发现，在长时间暴露于空气中的肉质品和鱼中也会发现该菌，在我国国内相关报道较少。肉杆菌是一种条件致病菌，一般对人不会引起致病，但是分泌的一些毒素会引起人类的肠道疾病和败血症，是一种在海洋中具备致病性的细菌。
[0006]苏云金杆菌一直被认为是一种微生物源低毒杀虫剂，对人类伤害不大，但是苏云金杆菌和蜡状芽孢杆菌间的区别仅仅在于后者具有杀虫质粒编码，该质粒的丢失可使苏云金杆菌转化成蜡状芽孢杆菌，而蜡状芽孢杆菌是常见的食品污染菌，能产生一种呕吐毒素和多种肠毒素，主要引发呕吐和腹泻型食物中毒。与蜡状芽孢杆菌同属的苏云金杆菌也能产生类似的肠毒素，近来发现它可能与食品中毒有关。我国应当加强对蜡状芽孢杆菌的监测和研究。
[0007]溶藻弧菌与副溶血弧菌形态和生物学功能较为相似，能产生不耐热性肠毒素、耐热性肠毒素和溶血毒素。该菌在海产品中经常出现，也是海生生物的主要致病菌，对人类具有一定的致病性，在公共卫生学上具有重要意义。由该菌引起的食物中毒在沿海地区较为普遍，需要与副溶血弧菌区分鉴别。
[0008]gyrB基因在细菌的分类和检测中具有鉴别作用。gyrB即促旋酶(gyrase)的B亚单位基因，属于信息通路中与DNA复制、限制、修饰或修复有关的蛋白编码基因。此基因存在于大多数细菌中，不会发生频繁的水平转移，在不同的蛋白及蛋白的不同位点，其氨基酸替代率也不相同，可在细菌的系统发育学，特别是在近缘种和菌株的区分及鉴定起到重要作用。
[0009]副溶血弧菌tlh基因是副溶血弧菌所特有的，因此它的编码基因tlh基因常被用作检测副溶血弧菌的靶基因。该基因可产生溶血素。
[0010]粪肠球菌cylA基因是与粪肠球菌致病性相关的一种毒力基因，在致病菌株中分离率较高(高于35% )，并且与其他细菌相比，该基因部分序列同源性较低，所以可选用作为检测致病性粪肠球菌的靶基因。
[0011]聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的分子生物学技术。PCR技术的特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火(复性)、延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93°C左右一段时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55°C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸:DNA模板与引物的结合物在72°C，Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性、退火(复性)、延伸三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。多重PCR是在普通PCR的基础上加以改造，在一个PCR反应体系中同时加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。多重PCR在一次反应中能同时扩增多个目的片段的多个靶序列。该技术可用于多种病原微生物 的同时检测或鉴定，在同一 PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。多重PCR最大的问题在于引物的设计和反应条件的优化。和一般PCR相比较，多重PCR在同一 PCR反应管内需要同时扩增出多个病原菌的目的片段，一次完成多个模板的扩增。在本发明中，在同一反应管内检出粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因，将大大节省时间和试剂，节约经费，为检测提供更多更准确的信息。多重PCR的引物设计要求总体上与一般PCR的引物一致，如引物自身需要有稳定的二级结构，引物之间也不能形成发夹和引物二聚体等。这是因为单对引物扩增单个模板都能扩增出条带清晰的目的片段，但是各种引物混和后扩增会有条带丢失现象出现。各引物之间还存在竞争关系，强势引物可能掩盖弱势引物，导致目的片段丢失。甚至引物之间相互作用产生严重的引物二聚体，导致目的片段丢失。
[0012]多重PCR以其快速、高效、特异性好、灵敏度高的特点，在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物等检测中具有重要作用，符合口岸、卫生、质检等部分快速检测的需要，是一种准确、可靠、科学的分子生物学方法。有鉴于此，尽快开发一种用于同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及三种细菌的毒力基因的多重PCR势在必行。这对于加强水产品中这些致病菌的快速检验检疫、水产养殖病害的调查和防治、无公害水产品检测和生产以及水产品卫生质量监督检验等方面都具有提示和警示的作用。
【发明内容】

[0013]本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种用于同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR引物及其设计方法。
[0014]本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种用于同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR的检测方法，其具有简单、灵敏、快速、特异性强的特点。
[0015]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:该用于同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR引物，其特征在于:该五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR引物分别包括粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的多重PCR引物；
[0016]其中，粪肠球菌的上下游引物为:
[0017]Pl:5，-TGCCGCATGGCATAAGAGTC-3，；
[0018]P2:5， -TGCATCACCTCGCGGTCTAG-3，；
[0019]迟缓爱德华菌的上下游引物为:
[0020]P3:5， -GACTCAACGGCGGATTTCAC-3，；
[0021]P4:5，-TGGCGACACCGAGCAGATT-3，；
[0022]肉杆菌的上下游引物为:
[0023]P5:5’ -CCATGGACAATGATTGTTG-3’ ；
[0024]P6:5， -CTCGAGGCAGCGAGATCTT-3，；
[0025]苏云金杆菌的上下游引物为:
[0026]P7:5’ -CTATTCTCGTATGTTCATTCG-3’ ；
[0027]P8:5’ -CTTCATTACATTCAACCCAG-3’ ；
[0028]溶藻弧菌的上下游引物为:
[0029]P9:5， -GATCGTTTTGACCTGCGAAA-3，；
[0030]PlO:5， -GCATTGAGCGCTACGTGAAT-3，；
[0031]阴沟肠杆菌gyrB基因的上下游引物为:
[0032]Pll:5，-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3，；
[0033]P12:5， -CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3，；
[0034]副溶血弧菌tlh基因的上下游引物为:
[0035]P13:5’ -TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’ ；
[0036]P14:5’ -GTTGATGACACTGCCAGATGC-3’ ；
[0037]粪肠球菌cylA基因的上下游引物为:
[0038]P15:5， -GACTCGGGGATTGATAGGCA-3，；
[0039]P16:5’ -GCTGCTAAAGCTGCGCTTAC-3，；
[0040]进一步地，所述粪肠球菌引物对应的PCR扩增片段大小为1097bp，迟缓爱德华菌引物对应的PCR扩增片段大小为708bp，肉杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为566bp，苏云金杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为458bp，溶藻弧菌引物对应的PCR扩增片段大小为159bp，阴沟肠杆菌gyrB基因引物对应的PCR扩增片段大小为1250bp，副溶血弧菌tlh基因引物对应的PCR扩增片段大小为454bp，粪肠球菌cyIA基因引物对应的PCR扩增片段大小为 405bp。
[0041]本发明提供了一种用于同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的设计方法，其特征在于:包括以下步骤:
[0042]步骤1，利用引物设计软件设计同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为20-23个，引物的熔解温度Tm值为 54°C _63°C，引物的 6(:%为 40% -60% ；
[0043]步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不形成引物二聚体的引物；
[0044]步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC%和碱基数进行比较，当引物的碱基数均相同且内侧引物的GC %小于外侧引物的GC %，或者当引物的碱基数不完全相同且内侧引物的碱基数比外侧引物少一个碱基时，判断为竞争状态劣势引物，进行步骤4 ;否则判断为竞争状态优势引物，进行步骤5 ;
[0045]步骤4，再次筛选竞争状态引物，具体步骤为:重复步骤2，对所保留的引物按照步骤3进行再次判断；
[0046]步骤5，利用PCR方法对竞争状态优势引物进行扩增验证；
[0047]步骤6，去除扩增引物中的竞争状态劣势引物，获得多重PCR引物组合。
[0048]本发明还提 供一种同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR的检测方法，其特征在于包括如下步骤:
[0049]I)细菌的初步分离:从培养基中提取基因组DNA，备作PCR模板；
[0050]2)多重PCR扩增包括:a、多重PCR扩增反应体系:取上述DNA模板I~12 μ L，反应体系为20-30.0 μ L，各反应产物分别为TaqDNA聚合酶5U/y L，0.1-0.25 μ L，PCR缓冲液
2.5 μ L，脱氧核糖核苷三磷酸混合物10mmol/L，2-3.5μ L，引物P1、P2各0.5-1.0 μ L，P3、P4各 1.0-2.5 μ L，P5、P6 各 0.75-2 μ L, P7、P8 各 1.5-4.0yL, P9、P10 各 0.25-0.75 μ L，Pll、Ρ12 各 0.5-1.5 μ L，P13、P14 各 0.25-0.75 μ L, P15、P16 各 0.25-0.75 μ L，余量用重蒸水补足山、扩增反应条件:94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，循环35次，72°C终末延伸IOmin ;c、将步骤b的扩增产物进行电泳检测及结果分析。
[0051]作为优选，所述步骤&中引物？1、？2各0.5 4 1^，？3、？4各1.5 4 1^，？5、？6各1“1^P7、P8 各 2 μ L，Ρ9、PlO 各 0.25 μ L, Pll、Ρ12 各 0.5 μ L, Ρ13、Ρ14 各 0.25 μ L, Ρ15、Ρ16 各
0.75 μ L0
【专利附图】

【附图说明】
[0052]图1多重PCR鉴别粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌属、苏云金杆菌和溶藻弧菌的的电泳检测结果；
[0053]图2多重PCR鉴别阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的电泳检测结果。
【具体实施方式】
[0054]以下通过结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
[0055]I)利用primer express2.0引物设计软件设计同时扩增粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌和阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的多重引物组合；
[0056]2)筛选多重引物组合中PCR检测粪肠球菌的引物；
[0057]3)筛选多重引物组合中PCR检测迟缓爱德华菌的引物；
[0058]4)筛选多重引物组合中PCR检测肉杆菌的引物；
[0059]5)筛选多重引物组合中PCR检测苏云金杆菌的引物；
[0060]6)筛选多重引物组合中PCR检测溶藻弧菌的引物；
[0061]7)筛选多 重PCR同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌的引物组合；
[0062]8)筛选多重引物组合中PCR检测阴沟肠杆菌gyrB基因的引物；
[0063]9)筛选多重引物组合中PCR检测副溶血弧菌tlh基因的引物；
[0064]10)筛选多重引物组合中PCR检测粪肠球菌cylA基因的引物；
[0065]11)筛选多重PCR同时检测阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的引物组合。
[0066]所述的步骤I)，其中涉及的引物参照实验室海洋分离株相应的基因序列和GenBank 上发表(E.faec.16s rRNA 为 GenBank AB362602、AB712374, E.tarda.gyrB 为GenBank FJ158597、KC665637, C.Coll.为 GenBank AF275938, B.thur.hbl 为 GenBankAJ243147, V.alg1.toxR 为 GenBank EU155576、EU155566，E.bact.gyrB 为 GenBankAF302677、AY370837, V.para, tlh 为 GenBank ⑶971655、AB012596)对应的基因序列，应用primer express2.0设计同时检测细菌和毒力基因的特异性引物组合。
[0067]备注:在本专利文本中，E.faec.为粪肠球菌的英文缩写，E.tarda.为迟缓爱德华菌的英文缩写，C.Coll.为肉杆菌的英文缩写，B.thur.为苏云金杆菌的英文缩写，V.alg1.为溶藻弧菌的英文缩写，E.bact.为阴沟肠杆菌的英文缩写，V.para.为副溶血弧菌的英文缩写，E.faec.(16s rRNA) Pl 和 E.faec.(16s rRNA) P2 为根据粪肠球菌 16s rRNA 设计的上游引物Pl和下游引物P2, E.tarda.(gyrB)P3和E.tarda.(gyrB)P4为根据迟缓爱德华菌gyrB基因设计的上游引物P3和下游引物P4，C.Coll.P5和C.Coll.P6为根据肉杆菌公布的一段基因设计的上游引物P5和下游引物P6，B.thur.(hbl)P7和B.thur.(hbl)P8为根据苏云金杆菌hbl基因设计的上游引物P7和下游引物P8，V.alg1.(toxR)P9和V.alg1.(toxR)P10为根据溶藻弧菌toxR基因设计的上游引物P9和下游引物P10，E.bact.(gyrB)Pll和E.bact.(gyrB)P12为根据阴沟肠杆菌gyrB基因设计的上游引物Pll和下游引物P12，V.para, (tlh)P13和V.para.(tlh)P14为根据副溶血弧菌tlh基因设计的上游引物P13和下游引物P14，E.faec.(cylA)P15和E.faec.(cylA)P16为根据粪肠球菌cylA基因设计的上游引物P15和下游引物P16。
[0068]所述的步骤2)、3)、4)、5)、6)和7)，经过筛选，粪肠球菌引物对应的PCR扩增片段大小为1097bp，迟缓爱德华菌引物对应的PCR扩增片段大小为708bp，肉杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为566bp，苏云金杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为458bp，溶藻弧菌引物对应的PCR扩增片段大小为159bp。具体引物序列如下:
[0069]粪肠球菌16s rRNA的上下游引物:
[0070]E.faec.(16s rRNA)Pl:5，-TGCCGCATGGCATAAGAGTC-3，；[0071]E.faec.(16s rRNA)P2:5，-TGCATCACCTCGCGGTCTAG-3，；
[0072]迟缓爱德华菌的上下游引物:
[0073]E.tarda.(gyrB)P3:5，-GACTCAACGGCGGATTTCAC-3，；
[0074]E.tarda.(gyrB)P4:5，-TGGCGACACCGAGCAGATT-3，；
[0075]肉杆菌的上下游引物:
[0076]C.Coll.P5:5’ -CCATGGACAATGATTGTTG-3’ ；
[0077]C.Coll.P6:5，-CTCGAGGCAGCGAGATCTT-3，；
[0078]苏云金杆菌的上下游引物:
[0079]B.thur.(hbl)P7:5，-CTATTCTCGTATGTTCATTCG-3，；
[0080]B.thur.(hb l)P8:5’ -CTTCATTACATTCAACCCAG-3’ ；
[0081]溶藻弧菌的上下游引物:
[0082]V.alg1.(toxR)P9:5，-GATCGTTTTGACCTGCGAAA-3，；
[0083]V.alg1.(toxR)PlO:5，-GCATTGAGCGCTACGTGAAT-3，；
[0084]所述的步骤8) ,9),10)和11)，经过筛选，阴沟肠杆菌gyrB基因引物对应的PCR扩增片段大小为1250bp，副溶血弧菌tlh基因引物对应的PCR扩增片段大小为454bp，粪肠球菌cylA基因引物对应的PCR扩增片段大小为405bp。具体引物序列如下:
[0085]阴沟肠杆菌gyrB基因的上下游引物:
[0086]E.bact.(gyrB)Pl1:5，-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3，；
[0087]E.bact.(gyrB)P12:5， -CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3，；
[0088]副溶血弧菌tlh基因的上下游引物:
[0089]V.para.(tlh)P13:5，-TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3，；
[0090]V.para.(tlh)P14:5，-GTTGATGACACTGCCAGATGC-3，；
[0091]粪肠球菌cylA基因的上下游引物:
[0092]E.faec.(cylA)P15:5，-GACTCGGGGATTGATAGGCA-3，；
[0093]E.faec.(cylA)P16:5’ -GCTGCTAAAGCTGCGCTTAC-3，；
[0094]所述的步骤7)和11)，多重PCR同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因方法最佳反应条件的测定，分别利用5对引物进行5种细菌模板和利用3对引物进行3种细菌模板多重PCR最佳退火温度、引物浓度、模板浓度等的测定，然后根据实验结果进行多重PCR最佳循环次数的测定。
[0095]所述的步骤7)，多重PCR同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌方法的反应体系为25yL，具体如下:10XPCR Buffer(含25mmol/LMgCl2) 2.5 μ L, 1mmoI/L dNTP3 μ L, 1mmoI/L E.faec.(16s rRNA)上下游引物各 0.5 μ L，lOmmol/L E.tarda.(gyrB)上下游引物各 1.5 μ L, lOmmol/L C.Coll.上下游引物各 I μ L,10mmol/L B.thur.(hbl)上下游引物各 2 μ L, 10mmol/L V.alg1.(toxR)上下游引物各0.25 μ L, 5U/ μ L Taq 酶 0.2 μ L，Ε.bact.的 DNA 模板 3 μ L, E.tarda.和 C.Coll.的 DNA 模板各 2.5 μ L，B.thur.的 DNA 模板 2 μ L, V.alg1.的 DNA 模板 0.5 μ L, ddH20 补足至 25 μ L。扩增条件为预变性94°C 5min ;变性94°C 30s，退火56°C 30s，延伸72°C 60s, 30个循环；终延伸 72°C 1min ;4°C保存；[0096]所述的步骤11)，多重PCR同时检测阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因方法的反应体系为25 μ L，具体如下:10XPCR Buffer (含25mmol/L MgCl2) 2.5 μ L，IOmmoI/L dNTP3 μ L, IOmmoI/L E.bact.(gyrB)上下游引物各 0.5 μ L，lOmmol/LV.para, (tlh)上下游引物各 0.25 μ L, lOmmol/L E.faec.(cylA)上下游引物各
0.75 μ L, 5U/ μ LTaq 酶 0.25 μ L, Ε.bact.的 DNA 模板 2 μ L，V.para.的 DNA 模板 1.0 μ L，E.faec.的DNA模板12 μ L，ddH20补足至25 μ L。扩增条件为预变性94 V 5min ；变性940C 30s，退火56°C 30s，延伸72°C 60s, 30个循环；终延伸72°C IOmin将以上PCR产物在
0.5 X TBE,2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，然后在凝胶成像系统中观察。
[0097]图1显示了对粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌样品分别进行多重和单重PCR的检测结果，其中M号泳道为DL2000DNA Marker ；1号泳道为五重PCR扩增结果，在分子量约为1097bp、708bp、566bp、458bp和159bp处分别呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的样品中存在粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌；2号泳道为粪肠球菌的检测结果，呈现分子量约为1097bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有粪肠球菌；3号泳道为迟缓爱德华菌的检测结果，呈现分子量约为708bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有迟缓爱德华菌；4号泳道为肉杆菌的检测结果，呈现分子量约为566bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有肉杆菌；5号泳道为苏云金杆菌的检测结果，呈现分子量约为458bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有苏云金杆菌；6号泳道为溶藻弧菌的检测结果，呈现分子量约为159bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有溶藻弧菌；7号泳道为粪肠球菌和溶藻弧菌的检测结果，呈现分子量约为1097bp和159bp的明亮的、特征的扩增条带，说明样品中含有粪肠球菌和溶藻弧菌；8号泳道为粪肠球菌、肉杆菌和溶藻弧菌的检测结果，呈现分子量约为1097bp、566bp和159bp的明亮的、特征的扩增条带，说明样品中含有粪肠球菌、肉杆菌和溶藻弧菌；9号泳道为粪肠球菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌的检测结果，呈现分子量约为1097bp、566bp、458bp和159bp的明亮的、特征的扩增条带，说明样品中含有粪肠球菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌。
[0098]图2显示了对阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因样品分别进行多重和单重PCR的检测结果，其中M号泳道为DL2000DNA Marker ；1号泳道为三重PCR扩增结果，在分子量约为1250bp、454bp和405bp处分别呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的样品中存在阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因；2号泳道为阴沟肠杆菌gyrB基因的检测结果，呈现分子量约为1250bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有阴沟肠杆菌gyrB基因；3号泳道为副溶血弧菌tlh基因的检测结果，呈现分子量约为454bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有副溶血弧菌tlh基因；4号泳道为粪肠球菌cylA基因的检测结果，呈现分子量约为405bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有粪肠球菌cylA基因。
[0099]实施例1
[0100]利用引物设计软件01igo6.0设计同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为23个，引物的熔解温度Tm值为60°C，引物的6(:%为60% ；[0101]步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不形成引物二聚体的引物；
[0102]步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC%和碱基数进行比较，当引物的碱基数均相同且内侧引物的GC %小于外侧引物的GC %，或者当引物的碱基数不完全相同且内侧引物的碱基数比外侧引物少一个碱基时，判断为竞争状态劣势引物，进行步骤4 ;否则判断为竞争状态优势引物，进行步骤5 ；
[0103]步骤4，再次筛选竞争状态引物，具体步骤为:重复步骤2，对所保留的引物按照步骤3进行再次判断；
[0104]步骤5，利用PCR方法对竞争状态优势引物进行扩增验证；
[0105]步骤6，去除扩增引物中的竞争状态劣势引物，获得多重PCR引物组合。
[0106]具体引物序列如下:
[0107]E.faec.(16s rRNA)Pl:5’ -TGCCGCATGGCATAAGAGTC-3’
[0108]E.faec.(16s rRNA)P2:5’ -TGCATCACCTCGCGGTCTAG-3’
[0109]E.tarda.(gyrB)P3:5， -GACTCAACGGCGGATTTCAC-3，
[0110]E.tarda.(gyrB)P4:5，-TGGCGACACCGAGCAGATT-3，
[0111]C.Co11.P5:5 ’ -CCATGGACAATGATTGTTG-3，
[0112]C.Co11.P6:5，-CTCGAGGCAGCGAGATCTT-3，
[0113]B.thur.(hbI)P7:5 ’ -CTATTCTCGTATGTTCATTCG-3’
[0114]B.thur.(hbl)P8:5’ -CTTCATTACATTCAACCCAG-3’
[0115]V.alg1.(toxR)P9:5，-GATCGTTTTGACCTGCGAAA-3’
[0116]V.alg1.(toxR)PlO:5，-GCATTGAGCGCTACGTGAAT-3，。
[0117]E.bact.(gyrB)Pl1:5，-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3，
[0118]E.bact.(gyrB)P12:5，-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3，
[0119]V.para.(tlh)P13:5’ -TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’
[0120]V.para.(tlh)P14:5’ -GTTGATGACACTGCCAGATGC-3J
[0121]E.faec.(cylA)P15:5，-GACTCGGGGATTGATAGGCA-3’
[0122]E.faec.(cylA)P16:5，-GCTGCTAAAGCTGCGCTTAC-3，
[0123]实施例2用于同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的多重PCR引物设计方法，该方法包括以下步骤:
[0124]步骤I,利用引物设计软件Primer Premier5.0设计同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为22个，弓丨物的熔解温度Tm值为54°C，引物的GC %为40 % ;
[0125]步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不形成引物二聚体的引物；
[0126]步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC%和碱基数进行比较，当引物的碱基数均相同且内侧引物的GC %小于外侧引物的GC %，或者当引物的碱基数不完全相同且内侧引物的碱基数比外侧引物少一个碱基时，判断为竞争状态劣势引物，进行步骤4 ;否则判断为竞争状态优势引物，进行步骤5 ；
[0127]步骤4，再次筛选竞争状态引物，具体步骤为:重复步骤2，对所保留的引物按照步骤3进行再次判断；
[0128]步骤5，利用PCR方法对竞争状态优势引物进行扩增验证；
[0129]步骤6，去除扩增引物中的竞争状态劣势引物，获得多重PCR引物组合。
[0130]具体引物序列如下:
【权利要求】
1.一种用于同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR引物，其特征在于:该五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR引物分别包括粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的多重PCR引物； 其中，粪肠球菌的上下游引物为:
2.根据权利要求1所述的同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR引物，所述粪肠球菌引物对应的PCR扩增片段大小为1097bp，所述迟缓爱德华菌引物对应的PCR扩增片段大小为708bp，所述肉杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为566bp，所述苏云金杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为458bp，所述溶藻弧菌引物对应的PCR扩增片段大小为159bp，所述阴沟肠杆菌gyrB基因引物对应的PCR扩增片段大小为1250bp，所述副溶血弧菌tlh基因引物对应的PCR扩增片段大小为454bp，所述粪肠球菌cylA基因引物对应的PCR扩增片段大小为405bp。
3.一种根据权利要求1所述的用于同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的设计方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤1，利用引物设计软件设计同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为20-23个，引物的熔解温度Tm值为540C _63°C，引物的 GC%^ 40% -60% ； 步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不形成引物二聚体的引物； 步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC%和碱基数进行比较，当引物的碱基数均相同且内侧引物的GC %小于外侧引物的GC %，或者当引物的碱基数不完全相同且内侧引物的碱基数比外侧引物少一个碱基时，判断为竞争状态劣势引物，进行步骤4 ;否则判断为竞争状态优势引物，进行步骤5 ； 步骤4，再次筛选竞争状态引物，具体步骤为:重复步骤2，对所保留的引物按照步骤3进行再次判断； 步骤5，利用PCR方法对竞争状态优势引物进行扩增验证； 步骤6，去除扩增引物中的竞争状态劣势弓丨物，获得多重PCR弓丨物组合。
4.一种应用如权利要求1所述的同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR的检测方法，其特征在于包括如下步骤: 1)细菌的初步分离:从培养基中提取基因组DNA，备作PCR模板； 2)多重PCR扩增 包括:a、多重PCR扩增反应体系:取上述DNA模板I~12μ L，反应体系为20-30.0 μ L，各反应产物分别为TaqDNA聚合酶5U/μ L，0.1-0.25 μ L，PCR缓冲液2.5 μ L，脱氧核糖核苷三磷酸混合物10mmol/L，2-3.5μ L，引物Ρ1、Ρ2各0.5-1.0 μ L，Ρ3、Ρ4各 1.0-2.5μ L，P5、P6 各 0.75_2μ L，P7、P8 各 1.5_4.0 μ L，P9、PlO 各 0.25-0.75μ L，P11、Ρ12 各 0.5-1.5μ L，P13、P14 各 0.25-0.75μ L，P15、P16 各 0.25-0.75 μ L，余量用重蒸水补足山、扩增反应条件:94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，循环35次，72°C终末延伸IOmin ;c、将步骤b的扩增产物进行电泳检测及结果分析。
5.根据权利要求4所述的用于同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR的检测方法，其特征在于:所述步骤a中引物P1、P2各0.5 μ L，P3、P4各1.5 μ L，P5、Ρ6 各 I μ L，Ρ7、Ρ8 各 2 μ L, Ρ9、PlO 各 0.25 μ L, Pll、Ρ12 各 0.5 μ L, Ρ13、Ρ14 各 0.25 μ L,Ρ15、Ρ16 各 0.75 μ L0
【文档编号】C12Q1/68GK104017873SQ201410239848
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2014年5月30日
【发明者】杨季芳, 管峰, 陈吉刚, 毛芝娟 申请人:浙江万里学院