一种高效固定化脂肪酶的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效固定化脂肪酶的制备方法，属于酶化学【技术领域】。本发明所公开的方法是分别用磷酸盐缓冲溶液溶解脂肪酶和经预处理的大孔吸附树脂，再将脂肪酶溶液加入到大孔吸附树脂溶液中震荡均匀后，进行吸附处理，吸附后再加入戊二醛溶液进行固定处理，固定后经真空抽滤、洗涤和干燥后得到固定化脂肪酶。利用本发明的方法所制备的固定化酶，具有高酸解活性、1，3-位专一性和稳定性的特点，其酸解活性是游离酶的2.88倍，且专一性仅损失1.7％，同时在热稳定性、贮存稳定性、操作稳定性和pH耐受范围方面也有显著提高。本发明公开的方法具有工艺简单，制备周期短，产品催化效率高，专一性和稳定性强的特点，适用于产业化推广。
【专利说明】一种高效固定化脂肪酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高效固定化脂肪酶的制备方法，属于酶化学【技术领域】。 技术背景
[0002] 脂肪酶是一种生物催化剂，与化学催化试剂相比具有反应速度快、反应效率高、反 应条件温和、底物专一性强以及可在中性pH条件下操作等优点，同时脂肪酶本身也是一种 蛋白质，可以被微生物生物降解，符合绿色化学的要求，其已在食品、医药、轻工和农业等许 多领域得到应用，尤其在食品加工中的应用越来越广泛。其中更以具有位置特异性的脂肪 酶为代表，这类脂肪酶对于三酰甘油特定位置的脂肪酸优先水解，主要作用于三酰甘油的1 位和3位，因此也被称为snl，3位专一性脂肪酶，因其独特的性质被广泛应用于合成结构油 月旨，如合成低热量油脂、母乳脂肪替代品及新型脂质衍生物等。
[0003] 虽然在合成结构油脂方面snl，3脂肪酶具有反应高效，合成率高等优点，但脂肪 酶的价格昂贵，在反应过程中也比较不稳定，而且很难回收重复再利用，种种缺陷使其在大 规模应用上受到限制，因此目前用于工业生产结构油脂产品的主要还是化学方法。而酶的 固定化就是为了克服以上限制，使酶能像化学催化剂一样在反应过程中稳定操作，且利于 回收和反复使用而发展起来的一项技术。通过固定化可以改善酶的某些性质，如热稳定性 和操作稳定性等，使其达到重复使用的目的，在一定程度上降低成本，推动了其在工业上的 大规模应用。许多国内外学者采用吸附、交联、包埋及共价结合等固定化方法来提高脂肪酶 的活性及稳定性，而吸附法是最常用的一种固定化方法。
[0004] 目前，大多研究都是关于固定化提高脂肪酶的水解活性和酯交换活性，关于提高 脂肪酶酸解活性的研究鲜见报道。酸解活性是指脂肪酶催化甘油三酯与脂肪酸之间发生酰 基转移，从而改变甘油三酯结构组成的活性。脂肪酶酸解活性的提高在甘油三酯与脂肪酸 作用合成结构油脂的研究中具有积极的意义。但是，在现有技术中一般的固定过程会对脂 肪酶的高效性和专一性造成负面影响。对于1，3位专一性脂肪酶来说，固定化常常会使其 专一性发生改变，从而失去在结构油脂合成方面的优越性。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种高效固定化脂肪酶的制备方法，所采取的技 术方案如下：
[0006] -种高效固定化脂肪酶的制备方法，是分别用磷酸盐缓冲溶液溶解脂肪酶和经预 处理的大孔吸附树脂，再将脂肪酶溶液加入到大孔吸附树脂溶液中震荡均匀后，进行吸附 处理，吸附后再加入戊二醛溶液进行固定处理，固定后经真空抽滤、洗涤和干燥后得到固定 化脂肪酶。
[0007] 所述方法的步骤如下：
[0008] 1)大孔吸附树脂的预处理：将大孔吸附树脂加入到乙醇溶液中胀润，用去离子水 洗涤后，再用分别用酸和碱交替处理树脂，蒸馏水冲洗至中性后，干燥，获得预处理大孔吸 附树脂；
[0009] 2)磷酸盐缓冲溶液的溶解：用磷酸盐缓冲溶液浸泡步骤1)所得预处理大孔吸附 树脂，再用磷酸盐缓冲溶液溶解脂肪酶，获得脂肪酶溶液；
[0010] 3)吸附处理：将步骤2)所得脂肪酶溶液加入到经预处理的大孔吸附树脂磷酸盐 溶液中，震荡混合后吸附处理，获得吸附树脂脂肪酶溶液；
[0011] 4)交联处理：向步骤3)所得吸附树脂脂肪酶溶液中加入戊二醛溶液进行固定化 处理，处理完后进行真空抽滤，用去离子水洗涤后干燥，得到固定化脂肪酶。
[0012] 所述方法的步骤1)中所述大孔吸附树脂为NKA-9大孔吸附树脂；所述乙醇溶液浓 度为90-95%，胀润时间为23-25h ;所述用酸和碱交替处理是用4-5%的盐酸和1-2%的氢 氧化钠溶液每处理4h交替；所述干燥，温度为37-40°C，时间为12-15h。
[0013] 所述方法的步骤2)中所述磷酸盐缓冲溶液pH为6. 7-7. 0,浓度为0. 05M ;所述脂 肪酶的添加量为34-35mg/100mg载体。
[0014] 所述方法的步骤3)中所述吸附处理，吸附温度为40-45°C，吸附时间为4-4. 5h，在 吸附处理过程中每隔5-10min进行震荡混匀。
[0015] 所述方法的步骤4)中所述戊二醛溶液浓度为0. 25-0. 75% ;所述固定化处理，固 定时间为2-3h ;所述干燥，干燥温度为37-40°C，干燥时间12-15h。
[0016] 所述方法的具体步骤如下：
[0017] 1)称取500mg的NKA-9树脂，加入95 %乙醇溶液浸泡胀润24h，用去离子水洗涤去 除杂质，再分别用5%盐酸和2%氢氧化钠溶液处理NKA-9树脂，每处理4h交替，交替处理 1次，再用蒸馏水冲洗至中性后，于37°C干燥15h，获得预处理NKA-9树脂；
[0018] 2)取100mg步骤1)所得的预处理NKA-9树脂，用pH6. 5 0. 05M的磷酸盐缓冲溶液 溶解，再取34. 6mg脂肪酶用pH6. 5 0. 05M的磷酸盐缓冲溶液溶解，获得脂肪酶溶液；
[0019] 3)将步骤2)所得脂肪酶溶液加入到预处理NKA-9树脂磷酸盐溶液中，震荡混合均 匀后，在45°C恒温水浴中吸附处理4. lh，处理期间每隔lOmin进行震荡混匀，吸附处理后获 得吸附树脂溶液；
[0020] 4)向步骤3)所得吸附树脂溶液中加入0. 5 %的戊二醛溶液3ml，交联固定2. 5h， 真空抽滤后用去离子水洗涤，37°C干燥15h得到固定化脂肪酶。
[0021] 本发明采用NKA-9大孔吸附树脂为载体对脂肪酶进行固定化。该树脂具有选择 性好，吸附容量大，机械强度高，再生处理方便，吸附速度快及解析容易等优点。本发明以 NKA-9树脂和戊二醛对脂肪酶进行吸附-交联固定化，一方面可以通过树脂的孔隙吸附脂 肪酶，另一方面，利用戊二醛交联可以使酶分子与载体分子间实现多点交联，从而提高其反 应稳定性。与吸附法相比，吸附-交联固定化制备的固定化酶的稳定性更好；与交联法相 t匕，吸附-交联固定化得到的固定化酶的活性更高。
[0022] 本发明以米根霉脂肪酶的酸解活性为评价指标，对固定化工艺进行优化，不仅提 高了脂肪酶在催化反应中的稳定性和重复利用性，而且还提高了脂肪酶的酸解活性。目前 关于固定化提高脂肪酶酸解活性的研究鲜有报道，普遍的固定化研究中是致力于提高脂肪 酶的水解活性和酯化活性，不适合应用于结构油脂的合成方面。本发明米根霉脂肪酶的酸 解活性及稳定性的提高为结构油脂合成方面的大规模应用提供了技术参考，在获得高纯度 及高产率结构油脂产物方面起到积极促进的作用。
[0023] 本发明的有益效果：
[0024] 首先，本发明显著的提高了米根霉脂肪酶的酸解活性。发明人通过单因素实验 和响应面优化，确定了米根霉脂肪酶固定化的最佳工艺参数。在最佳工艺参数条件下，固 定化酶最佳酸解活性为31. 78%，而未进行固定化的游离酶在相同条件下的酸解活性只有 11. 02%。
[0025] 其次，本发明在提高脂肪酶酸解活性的同时有效地保护了脂肪酶的专一性。利用 本发明提供方法制备的固定化米根霉脂肪酶的1，3位专一性几乎没有损失。通过对固定化 米根霉脂肪酶酶解产物的气相分析，固定化米根霉脂肪酶的专一性能够达到原始游离米根 霉脂肪酶的98. 3%，表现出良好的1，3-位专一性。
[0026] 此外，通过固定化技术，本发明提高了米根霉脂肪酶的反应稳定性。通过对制备的 产品固定酶稳定性的测定。利用本发明所提供方法制备的固定化脂肪酶具有良好的热稳 定性、贮存稳定性、操作稳定性和更宽的pH耐受范围。具体为：当温度升高至70°C时，固定 化酶仍能保持31. 8%的相对活性，而此时游离酶已失活；固定化酶在贮存15d后，活性损失 仅为26. 5%，而游离酶的活性损失高达86. 5% ;固定化酶在经过6次重复利用后仍能保持 50. 8%的相对活性；固定化酶对的pH耐受范围为pH4-9,而游离酶的pH范围只有pH5-8。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为给酶量和吸附时间对固定化脂肪酶酸解活性的影响；
[0028] (A，给酶量；B，吸附时间）。
[0029] 图2为给酶量和pH对固定化脂肪酶酸解活性的影响；
[0030] (A，给酶量；C，pH)。
[0031] 图3为吸附时间和pH对固定化脂肪酶酸解活性的影响；
[0032] (B，吸附时间；C，pH)。
[0033] 图4为温度对固定化酶及游离酶活性的影响。
[0034] 图5为pH对固定化酶及游离酶活性的影响。
[0035] 图6为贮存时间对固定化酶及游离酶活性影响。
[0036] 图7为催化反应次数对固定化酶活性的影响。
【具体实施方式】
[0037] 本发明采用吸附-交联法固定化米根霉脂肪酶，先进行吸附固定再进行交联固 定，较传统的吸附交联固定中的吸附交联同时进行方法相比，缩短了交联剂对脂肪酶的作 用时间，减少了交联剂对snl，3位专一性的影响，同时又提高了米根霉脂肪酶酸解活性和 稳定性。下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0038] 实施例1脂肪酶固定化工艺的主要影响因素分析
[0039] 在单因素实验的基础上，确定了影响脂肪酶固定化工艺五个因素的最佳值是 给酶量35mg/100mg载体，pH为7,吸附时间4h，交联剂浓度0.5%，交联时间2.5h，采用 Plackett-Burman设计来确定对固定化脂肪酶性质影响的主次因素，以每个因素的活性最 高点为中心点，并以此5个因素为自变量，以-1，0, +1分别代表自变量的高、中、低3个水 平，以固定化脂肪酶的酸解活性为指标。每个因素取其中心点两侧的两个值，下表为水平编 码表。[0040] 表1主要影响因素水平编码表
【权利要求】
1. 一种高效固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，分别用磷酸盐缓冲溶液溶解脂肪 酶和经预处理的大孔吸附树脂，再将脂肪酶溶液加入到大孔吸附树脂溶液中震荡均匀后， 进行吸附处理，吸附后再加入戊二醛溶液进行固定处理，固定后经真空抽滤、洗涤和干燥后 得到固定化脂肪酶。
2. 权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 大孔吸附树脂的预处理：将大孔吸附树脂加入到乙醇溶液中胀润，用去离子水洗涤 后，再用分别用酸和碱交替处理树脂，蒸馏水冲洗至中性后，干燥，获得预处理大孔吸附树 脂； 2) 磷酸盐缓冲溶液的溶解：用磷酸盐缓冲溶液浸泡步骤1)所得预处理大孔吸附树脂， 再用磷酸盐缓冲溶液溶解脂肪酶，获得脂肪酶溶液； 3) 吸附处理：将步骤2)所得脂肪酶溶液加入到经预处理的大孔吸附树脂磷酸盐溶液 中，震荡混合后吸附处理，获得吸附树脂脂肪酶溶液； 4) 交联处理：向步骤3)所得吸附树脂脂肪酶溶液中加入戊二醛溶液进行固定化处理， 处理完后进行真空抽滤，用去离子水洗涤后干燥，得到固定化脂肪酶。
3. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)中所述大孔吸附树脂为NKA-9大孔吸 附树脂；所述乙醇溶液浓度为90-95%，胀润时间为23-25h ;所述用酸和碱交替处理是用 4-5%的盐酸和1-2%的氢氧化钠溶液每处理4-5h交替；所述干燥，温度为37-40°C，时间为 12-15h。
4. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)中所述磷酸盐缓冲溶液pH为6. 7-7.0， 浓度为〇. 05M ;所述脂肪酶的添加量为34-35mg/100mg载体。
5. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)中所述吸附处理，吸附温度为40-45°C， 吸附时间为4. 0-4. 5h，在吸附处理过程中每隔5-10min进行震荡混匀。
6. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)中所述戊二醛溶液浓度为0.25-0. 75%; 所述固定化处理，固定时间为2-3h ;所述干燥，干燥温度为37-40°C，干燥时间12-15h。
7. 权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤如下： 1) 称取500mg的NKA-9树脂，加入95%乙醇溶液浸泡胀润24h，用去离子水洗涤去除杂 质，再分别用5 %盐酸和2 %氢氧化钠溶液处理NKA-9树脂，每处理4h交替，交替处理1次， 再用蒸馏水冲洗至中性后，于37°C干燥15h，获得预处理NKA-9树脂； 2) 取100mg步骤1)所得的预处理NKA-9树脂，用pH6. 50. 05M的磷酸盐缓冲溶液溶解， 再取34. 6mg脂肪酶用pH6. 50. 05M的磷酸盐缓冲溶液溶解，获得脂肪酶溶液； 3) 将步骤2)所得脂肪酶溶液加入到预处理NKA-9树脂磷酸盐溶液中，震荡混合均匀 后，在45°C恒温水浴中吸附处理4. lh，处理期间每隔lOmin进行震荡混匀，吸附处理后获得 吸附树脂溶液； 4) 向步骤3)所得吸附树脂溶液中加入0.5%的戊二醛溶液3ml，交联固定2. 5h，真空 抽滤后用去离子水洗涤，37°C干燥15h得到固定化脂肪酶。
【文档编号】C12N11/08GK104046609SQ201410288956
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】刘宁, 李春, 张闻修 申请人:东北农业大学