对细胞基因组的预定位点进行基因改造的方法
【专利摘要】本发明公开了重组细胞、用于对细胞进行基因改造的试剂以及对细胞基因组的预定位点进行基因改造的方法，其中该重组细胞过表达：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码Cas9蛋白或其衍生物，所述Cas9蛋白的衍生物与所述Cas9蛋白相比，缺失DNA切割活性，但保留靶点识别活性。利用该重组细胞，能够有效地通过将Che-chiRNA，或Che-gRNA以及tracrRNA转入本发明的重组细胞中，即可容易地执行基因组编辑或基因表达调控，从而有效地实现对细胞基因组的预定位点进行基因改造。
【专利说明】对细胞基因组的预定位点进行基因改造的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，更具体的，本发明涉及重组细胞、用于对细胞进行基因 改造的试剂以及对细胞基因组的预定位点进行基因改造的方法。
【背景技术】
[0002] CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 是近两年被广泛认可的由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。在该 技术中，crRNA(CRISPR_derived RNA)通过喊基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA) 结合形成双链RNA，得到tracrRNA/crRNA二兀复合体。所得到的tracrRNA/crRNA二兀复合 体能够指导Cas9蛋白在与crRNA引导序列匹配的靶定位点剪切双链DNA，从而达到对基因 组DNA进行修饰的目的。CRISPR/Cas9系统能够对多种物种的基因组特定基因位点进行精 确编辑，目前已经成功应用于大、小鼠、人源细胞等基因敲除和敲入的模型制备。
[0003] Cas9系统进行有效工作需要三种元件，即crRNA (CRISPR-derived RNA，靶标识别 20 个或 30 个喊基）、tracrRNA(trans-activating RNA)及 Cas9 蛋白。
[0004] 由于crRNA和tracrRNA可以串联操作，所以三元件系统也可以简化成两元件系 统，即chiRNA(由crRNA及tracrRNA串联简并而成，祀标识别20个碱基）、Cas9蛋白。故 而目前利用Cas9系统进行基因组编辑及基因表达调控的主流策略共有两种：三元件系统、 -兀件系统。
[0005] 然而，目前利用Cas9系统进行基因组编辑及基因表达调控的方法仍有待改进。
【发明内容】
[0006] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0007] 现阶段，利用Cas9系统进行基因组编辑及基因表达调控，主要有两种策略：一是 外源质粒系统策略；二是体外转录合成chiRNA策略。
[0008] 其中，第一种策略（即外源质粒系统策略），是将Cas9系统相关的元件组装在外源 表达质粒系统中，即为将三元件系统或两元件系统中的元件全部整合在一个外源表达载体 上，针对基因组中不同的靶点，每次只需对相应的crRNA或chiRNA部分进行质粒的重组即 可，其他部分不用操作，然后将质粒转入相应的实验模型中就可以使其工作。该策略具有以 下缺点：
[0009] 1.靶点选择的局限：目前常用的靶向识别位点长度为20个碱基，由于U6启动子 后连接的第一个碱基必须为G(鸟嘌呤），因此限定了该20个碱基的第一个碱基必须为G， 这就造成了很强的限制，致使靶点的选择丧失了极大的选择空间；
[0010] 2.单质粒系统：构建好的外源质粒过大，会产生不易转染（尤其对于转染效率本 来就很低的细胞尤甚）或转染拷贝数过低的问题，而这是Cas9系统常见的效率低下的主 因；
[0011] 3.多质粒系统：如需使Cas9系统起效，就要要求全部元件共转入同一细胞，而共 转效率却是此技术策略的瓶颈；
[0012] 4.病毒载体系统：Cas9蛋白过大，为4千多个bp，不易包装，致使病毒的包装成功 率过低，难以高效的行使功能；
[0013] 5.针对不同位点：需要多次构建crRNA或chiRNA的载体表达部分，操作不便；
[0014] 6. -次性针对多位点操作：需要多个质粒共同转染，共转效率低，致使针对多靶 点的操作效率低下；
[0015] 7. Cas9蛋白表达量不稳定：外源表达的Cas9基因转入每个细胞的拷贝数不同，造 成细胞中Cas9蛋白的表达量不稳定、均一，限制了 Cas9系统的工作效率；
[0016] 8.针对高、中通量操作，周期长，时间成本、人力成本过高。
[0017] 第二种策略（即体外转录合成chiRNA策略），是将现有的Cas9二元件系统分 离，即分为：体外转录chiRNA和cas9蛋白。体外转录chiRNA是通过质粒构建的方式将 靶点序列插入到譬如pT7-gRNA这样的载体上，再用T7或SP6等转录酶在实验室体外环境 下制备成chiRNA ;Cas9蛋白的表达在这一方案中有多种形式：通过转染实现的外源表达， Cas9mRNA (亦为体外转录）的胚胎注射，通过病毒载体整合到基因组中，将Cas9基因序列定 点敲入到基因组中。该策略具有以下缺点：
[0018] 1.体外转录ChiRNA靶点选择的局限：目前常用的靶向识别位点长度为20个碱 基，由于T7或SP6启动子后连接的第一或前两个碱基必须为G(鸟嘌呤），因此限定了该20 个碱基的第一或前两个碱基必须为G，这就造成了很强的限制，致使靶点的选择丧失了极大 的选择空间；
[0019] 2.体外转录chiRNA操作环境要求高、技术要求高，转录制备出的RNA在体外环境 中极其不稳定，要极其小心处理以避免环境中无处不在的RNA酶；全流程的操作技术要求 也远高于其他分子生物学实验；
[0020] 3.体外转录chiRNA成本高，中间过程多用到RNA相关的试剂盒，而RNA试剂盒往 往价格不菲，造成全流程成本不低；
[0021] 4.体外转录chiRNA制备步骤多，周期长，流程复杂：需要订购祀点的Oligo、退火 链接、转化、测序鉴定、质粒制备、PCR、PCR产物纯化、转录、转录产物纯化、质量鉴定等诸多 步骤；
[0022] 5. Cas9蛋白如需共转染，共转染效率亦是问题。
[0023] 6.针对高、中通量操作，周期长，时间成本、人力成本过高。
[0024] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种相对于现有技术操作更简便、更加安全稳定、更加高效快速、通量更高，适用 于各种通量的，利用改进的Cas9系统对细胞基因组的预定位点进行基因改造的方法。
[0025] 因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种重组细胞。根据本发明的实施 例，所述细胞过表达：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码Cas9蛋白或其衍生物，所述 Cas9蛋白的衍生物与所述Cas9蛋白相比，缺失DNA切割活性，但保留靶点识别活性。发明人 惊奇地发现，利用该重组细胞，能够有效地通过将Che-chiRNA，或Che-gRNA以及tracrRNA 转入本发明的重组细胞中，即可容易地执行基因组编辑或基因表达调控，从而有效地实现 对细胞基因组的预定位点进行基因改造。
[0026] 另外，根据本发明上述实施例的重组细胞还可以具有如下附加的技术特征：
[0027] 根据本发明的实施例，所述第一核酸分子定位于所述细胞基因组中的H3F3A基因 中。这是因为，H3F3A位于常染色体，将第一核酸分子定位于H3F3A基因操作方便；H3F3A在 任何组织中均有表达，可以保证外源基因的有效表达；而融合表达可以尽可能的避免外源 DNA的非同源重组。
[0028] 根据本发明的实施例，所述细胞过表达：第二核酸分子，所述第二核酸分子编码 tracrRNA〇
[0029] 根据本发明的实施例，所述第一核酸分子具有如下所示的核苷酸序列：atgCCaaag aagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccgacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaa ctctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgacc ggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaag agaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggc caaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcacc ccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactg gtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatetatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccactt cctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaacc agctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagc agacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggaaacctgattgccctgag cctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacct acgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctg tccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgat caagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtaca aagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctac aagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgct gcggaagcagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggc ggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctac tacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctg gaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacc tgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtg aaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgtt caagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtgg aaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaag gacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagaga gatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagat acaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggat ttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagagga catccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggcagccccgcca ttaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaac atcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggat cgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaacgaga agctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgac tacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcga caagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgc tgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcctgagcgaactggat aaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccg gatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgt ccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctg aacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggt gtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagca acatcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaac ggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagt gaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgata agctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctattctgtg ctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcat ggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctga tcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactg cagaagggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaa gggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagc agatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcac cgggataagcccatcagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgc cttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatcc accagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgacaaaaggccggcggccacg aaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaagtaa(SEQIDNO:l)，SEQIDNO:l所不核苷酸序列编码 野生型Cas9蛋白；
[0030] 所述第二核酸分具有如下所示的核苷酸序列：GGTAGTATTAAGTATTGTTTTATGGCTGA TAAATTTCTTTGAATTTCTCCTTGATTATTTGTTATAAAAGTTATAAAATAATCTTGTTGGAACCATTCAAAACAG CATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ ID NO :2)，SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列编码tracrRNA。
[0031] 根据本发明的实施例，所述第二核酸分子定位于所述细胞基因组中的H3F3A基因 中。由此，将第二核酸分子定位于H3F3A基因的操作方便，能够保证第二核酸分子的有效表 达，且融合表达可以尽可能的避免第二核酸分子的非同源重组。
[0032] 根据本发明的实施例，沿着5'端至3'端的方向，所述第一核酸分子位于所述第二 核酸分子的上游。
[0033] 根据本发明的实施例，所述Cas9蛋白的衍生物与所述Cas9蛋白相比具有下列突 变至少之一：D10A和H840A。其中，"D10A"表示与所述Cas9蛋白相比，所述Cas9蛋白的衍 生物的第10个氨基酸D突变为A，"H840A"表示与所述Cas9蛋白相比，所述Cas9蛋白的衍 生物的第840个氨基酸由Η突变为A。由此，重组细胞中Cas9蛋白的衍生物过表达效率高， Cas9蛋白与Che-chiRNA，或Che-gRNA以及tracrRNA高度匹配，有利于用于进行后续的基 因组预定位点的基因改造。需要说明的是，本发明所采用的表达方式"Cas9蛋白"即为野生 型Cas9蛋白，"Cas9蛋白的衍生物"即为Cas9蛋白突变体。
[0034] 根据本发明的实施例，所述基因组过表达基因表达调控元件。需要说明的是，利用 无核酸酶切割活性的Cas9蛋白与特异的转录调节元件（VP16、VP48、VP64、KRAB、SID4X等） 融合表达，能够对基因组内源基因的表达进行人为干预、调控。进而，根据本发明的一个具 体示例，所述基因表达调控元件为SID4X或VP64。其中，SID4X由四个mSin3interacting domain串联而成，可以与转录调控基因 Sin3A、Sin3B的PAH2结构域结合，从而达到抑制基 因表达的效果。VP64由四个VP16结构域串联而成，可以与0ctl、HCF等转录因子结合进而 启动基因的表达。
[0035] 根据本发明的实施例，沿着5'端至3'端的方向，所述第一核酸分子位于所述 SID4X的下游。由此，能够尽可能的降低其他转录因子的竞争结合，使SID4X的作用更稳定。
[0036] 根据本发明的实施例，沿着5'端至3'端的方向，所述第一核酸分子位于所述VP64 的上游。由此，有利于VP64招募转录因子进行基因表达，减少Cas9蛋白对VP64或被招募 蛋白的干扰。
[0037] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于对细胞进行基因改造的试剂。 根据本发明的实施例，该试剂包含：Che-chiRNA ;或者Che-gRNA以及任选地Che-tracrRNA。 由此，将本发明的针对靶基因的试剂转入前述的重组细胞中，即可容易地执行基因组编辑 或基因表达调控，从而有效地实现对细胞基因组的预定位点进行基因改造。
[0038] 根据本发明的实施例，Che-chiRNA 包含序列：5 ' - (N) 2(iGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCA AGUUAAAAU-3'（SEQ ID NO :3)，N = A、U、G或C。由此，由此，相对于现有技术，本发明的 Che-chiRNA的长度为20个碱基的靶向识别位点的第一或前两个碱基不需要必须为G (鸟嘌 呤），从而Che-chiRNA转染靶点的选择局限小。进而，利用本发明的试剂对细胞基因组的预 定位点进行基因改造时，效率高，效果好。
[0039] 根据本发明的实施例，Che-gRNA包含序列：5'-(N)2QGUUUUAGAGCUA-3'（SEQ ID N0 : 4)，N = A、U、G或C。由此，相对于现有技术，本发明的Che-gRNA的长度为20个碱基的靶 向识别位点的第一或前两个碱基不需要必须为G (鸟嘌呤），从而Che-gRNA转入祀点的选择 局限小。进而，利用本发明的试剂对细胞基因组的预定位点进行基因改造时，效率高，效果 好。
[0040] 根据本发明的实施例，Che_chiRNA、Che_gRNA以及Che-tracrRNA的至少之一是化 学合成的。由此，当用于对细胞基因组的预定位点进行基因改造时，RNA靶向识别区域不受 启动子等因素的限制，靶点选择更广泛，RNA质量安全稳定、定量准确，操作简便、高效，整合 后起效快速、通量高。
[0041] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种对细胞基因组的预定位点进行基因 改造的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：提供前面所述的重组细胞；以及将前面所 述的试剂引入到所述重组细胞中，其中，所述Che-chiRNA或Che-gRNA的基序（N) 2(|是基于 所述预定位点的序列设计的。由此，能够容易地执行基因组编辑或基因表达调控，从而有效 地实现对细胞基因组的预定位点进行基因改造，且相对于现有技术操作更简便、更加安全 稳定、更加高效快速、通量更高，适用于各种通量。
[0042] 根据本发明的实施例，所述基因改造包括对预定位点进行基因敲除或表达调控。
[0043] 需要说明的是，在本文中所使用的术语"基因改造"应做广义理解，其指任何能够 影响基因转录、翻译、表达、序列的任何操作，例如，可以上调或者下调相关基因的表达，启 动相关基因的转录和翻译，切断相关基因的序列，在相关基因的序列中造成突变，诸如插 入、缺失以及置换等。当然，本领域技术人员能够理解的是，可以在相同的基因中同时进行 多个基因改造的操作。
[0044] 另外，根据本发明的实施例，相对于现有的利用Cas9系统进行基因组编辑及基因 表达调控的方法，本发明的对细胞基因组的预定位点进行基因改造的方法至少具有以下优 占·
[0045] 1.根据本发明的实施例，化学合成RNA靶向识别区域不受启动子等因素的限制， 靶点选择更广泛；
[0046] 2.根据本发明的实施例，化学合成RNA质量安全稳定、定量准确：由于是通过化学 合成方法制备而成，全流程得到标准质控监督，通过对RNA进行5'端、3'端、单链或双链等 修饰，可以达到RNA即有效又稳定的效果；且合成过程中分子量已知、合成量已知，可以做 到精确定量，方便后续的操作；
[0047] 3.根据本发明的实施例，化学合成RNA高效、操作简便：由于RNA的分子量较小， 在转染效率相同的情况下，当与前述现阶段的两种利用Cas9系统进行基因组编辑及基因 表达调控的策略使用相同质量的转染物时，RNA的拷贝数更高，会招募更多的Cas9蛋白进 行工作，所以更加高效；由于是通过化学合成方法制备而成，RNA的转染可像siRNA转染一 般轻松完成，而且转染试剂与siRNA转染试剂相同，方便实验室的使用；
[0048] 4.根据本发明的实施例，化学合成RNA起效快速、通量高：因为Cas9蛋白已整合 到基因组中，在细胞内已经表达，所以RNA进入到细胞内部即开始招募Cas9蛋白进行工作； 可将多个合成RNA混合在一起进行多靶点操作，亦可用多个合成RNA进行并行实验，以此提 高工作通量及效率；
[0049] 5.根据本发明的实施例，Cas9蛋白精确整合到基因组中的特定位点，表达稳定， 可做到在表达时间及表达量上的准确调通；不会造成对基因组造成安全性和稳定性等方面 的破坏。
[0050] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0051] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中 ：
[0052] 图1显示了根据本发明一个实施例，流式细胞术检测基因重组效率的结果；
[0053] 图2显示了根据本发明一个实施例，用于鉴定Cas9基因插入H3F3A基因中的PCR 示意图以及PCR产物的电泳结果；
[0054] 图3显示了根据本发明一个实施例，T7内切酶检测细胞靶点破坏情况的电泳结 果；
[0055] 图4显示了根据本发明一个实施例，qPCR检测细胞内CXCR4和MyoDl基因的表达 量的结果。
【具体实施方式】
[0056] 下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是，下列实施例仅仅是为了解释本发 明，而不对本发明的范围造成任何限制。
[0057] 实施例1 :在HELA细胞中进行基因敲除
[0058] 1、制备携带外源基因的细胞
[0059] 将H3F3A基因内部靶点破坏质粒pDSB-H3. 3与带有插入基因片段的同源重组工具 质粒Donor-KI-l/Donor-KI-2共转染到Hela细胞中。
[0060] 其中，pDSB-H3. 3依次包含下列序列：U6启动子，H3F3A gRNA-1，U6启动子， H3F3A gRNA-2, CBh启动子，Flag标签蛋白的编码基因，Cas9(D10A)蛋白的编码基因。其 中Cas9(D10A)蛋白为野生型Cas9蛋白的衍生物，其相对于野生型Cas9蛋白（SEQ ID N0 : 1所示核苷酸序列编码的蛋白）具有D10A突变，Cas9(D10A)蛋白的编码基因，相对于SEQ ID N0 :1所示核苷酸序列第74位碱基由A突变为C。
[0061] Donor-ΚΙ-Ι依次包含下列序列：H3F3A同源重组臂左臂，SA剪切序列，H3F3A最后 一个外显子上的⑶S序列（不含终止密码子），2A自断裂序列，puromycin抗性基因 ，polyA 尾，CBh启动子，Flag标签蛋白的编码基因，Cas9基因（序列如SEQ ID NO :1所示），bGH polyA尾，H3F3A同源重组臂右臂。
[0062] Donor-KI-2依次包含下列序列：H3F3A同源重组臂左臂，SA剪切序列，H3F3A最后 一个外显子上的⑶S序列（不含终止密码子），2A自断裂序列，puromycin抗性基因 ，polyA 尾，CBh启动子，Flag标签蛋白，Cas9基因（序列如SEQ ID NO :1所示），bGH polyA尾，HI 启动子，short tracrRNA序列，H3F3A同源重组臂右臂。
[0063] 需要说明的是，上述各载体均是通过PCR方法获得上述的相应各组件片段，然后 依次添加到T载体上而构建获得的。
[0064] 共转染前24小时，将细胞以40%的密度接种到24孔板的一个孔中。
[0065] 上述转染是采用转染试剂：X_tremeGENE HP DNA Transfection Reagent,按说明 书进行操作的。具体地，将DNA总量1 μ g稀释于lOOuL 0ΡΤΙ-ΜΕΜ培养基中，再加入3 μ L X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent混匀静置15分钟，取50 μ L加入有细胞培养 的孔中，震荡混匀，24小时后更换培养基即可。
[0066] 然后，通过流式细胞术检测基因重组效率，图1显示了流式细胞术的结果。其中， 如图1所示，通过特异性抗体anti-Flag将Cas9蛋白标记上绿色突光，WT为野生型对照。 进而，基于流式细胞术的结果，将绿色荧光阳性的细胞分选出，进行培养之后，PCR鉴定外源 片段（即Cas9基因）准确插入到H3F3A的基因中。图2显示了 PCR示意图以及PCR产物 的电泳结果。如图2所示，分别用同源重组臂外侧的两个引物P1、P2,和插入片段内部的两 个引物P3、P4,三种组合方式对绿色荧光阳性细胞样品进行PCR，并将PCR产物进行1%琼 脂糖凝胶电泳；其中，PCR示意图中KI fragment表示插入H3F3A基因中的Cas9基因，电 泳图中ΚΙ-l泳道为采用pDSB-H3. 3与Donor-ΚΙ-Ι共转染后的PCR产物，KI-2泳道为采用 PDSB-H3. 3与Donor-KI-2共转染后的PCR产物。
[0067] 由此，制备获得仅携带Cas9的Hela细胞（即采用Donor-ΚΙ-Ι共转染获得的重组 细胞）、同时携带Cas9+tracrRNA的Hela细胞（即采用Donor-KI-2共转染获得的重组细 胞）。
[0068] 2、针对人基因组中基因 EMX1、PVALB的靶点设计、合成che-chiRNA和che-gRNA。
[0069] 其中，che-chiRNA和che-gRNA的设计原则为：
[0070] a.序列必须符合（N)2CINGG的序列，（N)2CI靶向识别区域，NGG为Cas9切割位点；
[0071] b.所使用的靶点序列在全基因组出现错配的概率尽可能的接近0。
[0072] 分别在EMX1和PVALB基因的全长中搜索符合上述原则的靶点，然后按照 che-chiRNA和che-gRNA设计的原则生成相应的RNA序列。本实施例的RNA由美国IDT公 司生产。
[0073] 结果如下所示：
[0074] 针对EMX1基因：
[0075] che-gRNA 序列为：GGGGCCACUAGGGACAGGAUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID N0 : 5)；
[0076] che-chiRNA 序列为：GGGGCCACUAGGGACAGGAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUA AGGCUAGUCCG(SEQ ID NO ：6)〇
[0077] 针对PVALB基因：
[0078] che-gRNA 序列为：AUUGGGUGUUCAGGGCAGAGGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO : 7)；
[0079] che-chiRNA 序列为：AUUGGGUGUUCAGGGCAGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUA AGGCUAGUCCG(SEQ ID NO :8)。
[0080] 3、转染
[0081] 利用前面针对EMX1、PVALB的靶点合成的che-chiRNA分别转染前面获得的仅携 带Cas9的Hela细胞（即采用Donor-ΚΙ-Ι共转染获得的重组细胞）；利用前面针对EMX1、 PVALB的靶点合成的che-gRNA分别转染同时携带Cas9+tracrRNA的Hela细胞（即采用 Donor-KI-2共转染获得的重组细胞）。其中，每一个细胞的每一个基因的che-chiRNA或 che-gRNA的转染均是单独进行，即均是独立地实验，由此，每个独立实验都是一种细胞敲除 一个基因，从而仅携带Cas9的Hela细胞能够分别检测两个基因，携带Cas9+tracrRNA的细 胞也能够分别检测两个基因。
[0082] 在进行上述转染前24小时，将细胞以40%的密度接种到24孔板的一个孔中。
[0083] 上述转染是采用转染试剂"Lipofectamine? RNAiMAX Transfection Reagent"(Life technologies)，按说明书操作进行的。具体地，将lOpmol RNA稀释于50μ L 0ΡΤΙ-ΜΕΜ 培养基中，3 μ L Lipoibctamine? RNAiMAX Transfection Reagent 稀释于 50 μ L 0ΡΤΙ-ΜΕΜ培养基中，将两者混合室温静置5分钟，取50 μ L加入有细胞培养的孔中，震荡混 匀，24小时后更换培养基。
[0084] 4、使用T7内切酶检测靶点破坏情况。
[0085] 将细胞转染后48小时收集细胞，分别使用试剂QuickExtract? DNA Extraction Solution (Epicentre)制备基因组 DNA。
[0086] 然后，使用针对靶点附近区域设计的引物进行PCR。
[0087] 其中，PCR采用的引物为：
[0088] EMXl-test-F:AAAACCACCCTTCTCTCTGGC(SEQ ID NO ：9),
[0089] EMXl-test-R:GGAGATTGGAGACACGGAGAG(SEQ ID NO： 10),
[0090] PVALB-test-F:CTGGAAAGCCAATGCCTGAC(SEQ ID NO： 11),
[0091] PVALB-test-R:GGCAGCAAACTCCTTGTCCT(SEQ ID NO :12)。
[0092] PCR 试剂：Qfflot Start High-Fidelity2X Master Mix (NEB)，反应体系（总体积 40 μ L) :2X Master Mix20 μ L，基因组DNA样品 5 μ L，引物混合液（10 μ Μ) 3 μ L，ddH2012 μ L。 反应程序：1. 98°C 30s ;2· 98°C 5s ;3· 60°C 10s ;4· 72°C 30s ;5· 72°C lm，其中第 2 至第 4 步 进行35个循环。
[0093] 然后，将PCR反应产物重新的变性退火：向10uL PCR产物中加入2yL NEB buffer2, ddH20补足至20yL，退火程序为：1.95°C 10分钟，2.每秒递减2°C至85°C，3.每 秒递减0· 2°C至25°C，4. 25°C 1分钟。
[0094] 退火后，向退火产物中加入1 μ L T7内切酶（NEB)，37°C反应30分钟（T7内切酶 可以对靶点已破坏和未破坏链的退火产生的双链DNA进行切割），再将反应产物进行电泳， 以便利用?7内切酶检测靶点破坏情况。图3显示了 T7内切酶检测靶点破坏情况的电泳结 果。从图3的电泳结果中可以看出，利用本发明的技术，有效地在携带Cas9的细胞中分别 敲除了 EMX1基因和PVALB基因，并且也有效地在携带Cas9和tracrRNA的细胞中分别敲除 了 EMX1基因和PVALB基因。
[0095] 实施例2在Hela细胞中进行基因表达调控
[0096] 按照与实施例1类似的方法，构建同时携带Cas9突变体（D10A，H840A)和转录调 控元件（SID4X或VP64)的Hela细胞。其中，SID4X或VP64是和Cas9突变体（D10A，H840A) 串联在载体上的，其载体构建方法也是使用常用的PCR和分子克隆的方法；细胞重组的方 法和策略与实施例1相同，仅是Donor中的Cas9(D10A，H840A)DNA序列前面多了 SID4X或 后面多了 VP64 ;其他包括转染条件等与实施例1完全相同。其中Cas9(D10A，H840A)蛋白 为野生型Cas9蛋白的衍生物，其相对于野生型Cas9蛋白（SEQ ID N0:1所示核苷酸序列编 码的蛋白）同时具有D10A和H840A突变。
[0097] 然后，以 SID4X-Cas9(D10A，H840A)、Cas9(D10A，H840A)-VP64 敲入基因组为例，在 Hela细胞中进打基因表达调控，具体如下：
[0098] 靶点选择在目的基因（hMyoDl、hCXCR4)的转录因子结合区域或5' UTR区域。各 Che-chiRNA序列如下：
[0099] hMYOD 1 -1:GCCUGGGCUCCGGGGCGUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CG(SEQ ID NO ：13)；
[0100] hMYOD 1 -2 ：GGGCCCCUGCGGCCACCCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CG(SEQ ID NO :14)
[0101] hMY0Dl-3 :CCUCCCUCCCUGCCCGGUAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CG(SEQ ID NO :15);
[0102] hMYOD 1 -4：GAGGUUUGGAAAGGGCGUGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CG (SEQ ID NO :16);
[0103] hCXCR4-l :ACUUACACUGAUCCCCUCCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAMAUAAGGCUAGUC CG (SEQ ID NO :17);
[0104] hCXCR4-2 ：AGGUAGCAAAGUGACGCCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CG (SEQ ID NO :18);
[0105] hCXCR4-3 ：GAACCAGCGGUUACCAUGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CG(SEQ ID NO ：19)；
[0106] hCXCR4-4 :CAAACUGAAGUUUCUGGCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CG(SEQ ID NO :20)。
[0107] 将 hMyoDl、hCXCR4 的 che-chiRNA 分别转入 Hela-Cas9a、Hela-Cas9i 细胞系，其 中 Hela_Cas9a 细胞系为携带 Cas9 (D10A，H840A)-VP64 的 Hela 细胞，Hela_Cas9i 细胞系为 携带SID4X-Cas9(D10A，H840A)的Hela细胞系。转染条件与实施例1相同，转染后48小时 收集细胞，并米用试剂 iScript? RT-qPCR Sample Preparation Reagent (Bio-Rad)制备总 RNA，然后采用试剂 iScript? One-St印 RT-PCR Kit with SYBR? Green (Bio-Rad)进行 一步法qPCR反应。结果见图4。图4显示了 qPCR检测细胞内CXCR4和MyoDl基因的相对 表达量的结果。如图4所示，纵坐标表示相对表达量，单位为倍数。由图4可知，内源基因 CXCR4的表达被明显抑制，内源基因 MyoDl被激活，大量表达。其中，需要说明的是，内源基 因 MyoDl大量表达主要是因为，本实施例采用的Cas9突变体（D10A，H840A)不具备基因组 的破坏能力，只是识别靶点，而本实施例的靶点设计在基因的转录调控区域，而与Cas9串 联的VP64招募了转录因子将被识别的基因激活、启动表达。
[0108] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何 的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0109] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【权利要求】
1. 一种重组细胞，其特征在于，所述细胞过表达： 第一核酸分子，所述第一核酸分子编码Cas9蛋白或其衍生物，所述Cas9蛋白的衍生物 与所述Cas9蛋白相比，缺失DNA切割活性，但保留靶点识别活性。
2. 根据权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述第一核酸分子定位于所述细胞 基因组中的H3F3A基因中。
3. 根据权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞过表达： 第二核酸分子，所述第二核酸分子编码tracrRNA。
4. 根据权利要求3所述的重组细胞，其特征在于，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
5. 根据权利要求3所述的重组细胞，其特征在于，所述第二核酸分子定位于所述细胞 基因组中的H3F3A基因中。
6. 根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，沿着5'端至3'端的方向，所述第一 核酸分子位于所述第二核酸分子的上游。
7. 根据权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述Cas9蛋白的衍生物与所述Cas9 蛋白相比具有下列突变至少之一：D10A和H840A。
8. 根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述基因组过表达基因表达调控元 件。
9. 根据权利要求8所述的重组细胞，其特征在于，所述基因表达调控元件为SID4X或 VP64。
10. 根据权利要求9所述的重组细胞，其特征在于，沿着5'端至3'端的方向，所述第一 核酸分子位于所述SID4X的下游。
11. 根据权利要求9所述的重组细胞，其特征在于，沿着5'端至3'端的方向，所述第一 核酸分子位于所述VP64的上游。
12. -种用于对细胞进行基因改造的试剂，其包含： Che-chiRNA ;或者 Che-gRNA 以及任选地 Che-tracrRNA。
13. 根据权利要求12所述的试剂，其特征在于，Che-chiRNA包含序列： 5' - (N) 2(lGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU-3'，N = A、U、G 或 C。
14. 根据权利要求12所述的试剂，其特征在于，Che-gRNA包含序列： 5' - (N) 20GUUUUAGAGCUA-3'，N = A、U、G 或 C。
15. 根据权利要求12所述的试剂，其特征在于，Che-chiRNA、Che-gRNA以及 Che-tracrRNA的至少之一是化学合成的。
16. -种对细胞基因组的预定位点进行基因改造的方法，其特征在于，包括： 提供权利要求1?11任一项所述的重组细胞；以及 将权利要求12?15任一项所述的试剂引入到所述重组细胞中， 其中，所述Che-chiRNA或Che-gRNA的基序（N)2CI是基于所述预定位点的序列设计的。
17. 根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述基因改造包括对预定位点进行基 因敲除或表达调控。
【文档编号】C12N15/63GK104152414SQ201410346231
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】李卓, 裴端卿 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院