一种曲霉菌定量检测荧光pcr试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种曲霉菌定量检测荧光PCR试剂盒，包括阳性工作标准品、阴性工作标准品、检测反应液、红细胞裂解液、稀释液及DNA聚合酶，在阳性工作标准品、阴性工作标准品及检测反应液中均含有特异性引物与特异性探针，所述特异性引物正向序列为SQ1或其互补链，反向序列为SQ2或其互补链，特异性探针序列为SQ3或其互补链。本发明定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，检测速度快，能直接检测PCR过程中的变化，与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染。
【专利说明】—种曲霉菌定量检测荧光PCR试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于体外核酸诊断试剂【技术领域】，特别是一种曲霉菌定量检测荧光PCR试剂盒。
【背景技术】
[0002]曲霉菌是一种典型的丝状菌，在环境中广泛存在，主要通过呼吸道吸入霉菌孢子进入人体，首先侵入感染肺部进而引发肺曲霉菌病。在血液系统疾病、肺结核、慢性支气管炎、支气管扩张、肺癌等免疫抑制患者中曲霉已成为仅次于白念珠菌的重要致病真菌。曲霉菌感染已成为最常见的、传播最广的条件致病菌之一，但早期诊断困难，常常导致治疗时机延误，病死率高达30%~50%。传统的真菌分离、培养和组织病理鉴定等诊断方法敏感性低、阳性率低。早期、快速、简便、敏感、特异的诊断方法是目前条件性曲霉菌感染实验诊断研究领域的热点。
[0003]荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染。
[0004]曲霉菌感染中最常见的是烟曲霉感染，但目前国内并没有检测烟曲霉的荧光PCR产品，更没有检测更大范围的多种曲霉菌荧光PCR检测产品。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术的不足，而提出一种曲霉菌定量检测荧光PCR试剂盒。
[0006]本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的:
[0007]一种曲霉菌定量检测荧光PCR试剂盒，包括阳性工作标准品、阴性工作标准品、检测反应液、红细胞裂解液、稀释液、DNA聚合酶，其特征在于:在阳性工作标准品、阴性工作标准品及检测反应液中均含有特异性引物与特异性探针，所述特异性引物及特异性探针的DNA序列分别为:
[0008]特异性引物正向序列SQl:5’ -AAGCACGGCTTGTGTGTTGG-3’或其互补链；
[0009]特异性引物反向序列SQ2:5’ -AGCCCCATACGCTCGAGGA-3’或其互补链；
[0010]特异性探针序列SQ3:5’ -FAM-AAGGCAGCGGCGGCA-MGB-3’ 或其互补链。
[0011]而且，所述特异性引物与特异性探针根据曲霉菌ITS序列特性设计，针对曲霉菌ITS序列设计的引物和探针用于检测曲霉菌。
[0012]而且，在所述阳性工作标准品中含有插入烟曲霉特异DNA序列SQ4的pGM_T载体质粒，所插入序列SQ4如下:
[0013]SQ4:Gaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgcccccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctgttctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccctctcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacctgctctgtaggcc。
[0014]而且，所述阳性工作标准品含有重组质粒的浓度为1.0X 13~1.0X 107。
[0015]本发明的优点和积极效果是:
[0016]1、本发明定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化，与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染。
[0017]2、本发明灵敏度和特异性高，由于采取特异性引物和探针的双保险设计，灵敏度和特异性均有很大提高，能在临床症状出现之前检测到曲霉的感染。
[0018]3、本发明检测速度快，加上样本处理总共仅需2个小时，步骤简单，可同时进行高通量样本检测。
[0019]4、根据多种曲霉菌ITS序列特性设计的引物和探针可以检出多种曲霉菌。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为曲霉菌阳性反应液的荧光PCR扩增曲线和阴性反应液荧光PCR扩增曲线；
[0021]图2为曲霉菌临床样本的荧光PCR扩增曲线。
【具体实施方式】
[0022]以下结合附图对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0023]一种曲霉菌定量检测荧光PCR试剂盒，包括阳性工作标准品、阴性工作标准品、检测反应液、红细胞裂解液、稀释液、DNA聚合酶，本发明的创新点是，在阳性工作标准品、阴性工作标准品及检测反应液中均含有特异性引物与特异性探针，所述特异性引物与特异性探针根据曲霉菌ITS序列特性设计，针对曲霉菌ITS序列设计的引物和探针用于检测曲霉菌。
[0024]其中，所述异性引物及特异性探针的DNA序列分别为:
[0025]特异性引物正向序列SQl:5’ -AAGCACGGCTTGTGTGTTGG-3’或其互补链；
[0026]特异性引物反向序列SQ2:5’ -AGCCCCATACGCTCGAGGA-3’或其互补链；
[0027]特异性探针序列SQ3:5’ -FAM-AAGGCAGCGGCGGCA-MGB-3’ 或其互补链。
[0028]在本发明的具体实施中，在所述阳性工作标准品中含有插入烟曲霉特异DNA序列SQ4的pGM-T载体质粒，所插入序列SQ4如下:
[0029]SQ4:Gaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgcccccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctgttctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccctctcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacctgctctgtaggcc,
[0030]在本发明的具体实施中，所述阳性工作标准品含有重组质粒的浓度为1.0X 13~1.0XlO7O
[0031]应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0032]实例:试剂盒的制备
[0033](I)引物和探针设计与合成
[0034]本实施例根据多种曲霉菌ITS序列的特性设计引物和探针，正向引物 5’ -AAGCACGGCTTGTGTGTTGG-3’，反向引物 5’ -AGCCCCATACGCTCGAGGA-3’，探针5’ -FAM-AAGGCAGCGGCGGCA-MGB-3’，其数据均来源于GenBank中的核糖体ITS序列，引物和探针由Iifetechnologies公司合成。
[0035](2)曲霉阳性模版的制备
[0036]本实例中含有曲霉核酸序列质粒作为阳性模版用于制备阳性工作标准品。
[0037]使用引物:5’ -GAAGGATCATTACCGAGTGAGGG-3 ’ 和引物:5’ -GGCCTACAGAGCAGGTGACAAAG-3’扩增烟曲霉基因靶序列，将经过纯化的PCR产物连接到PGM-T载体上；然后转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，经过筛选构建好的重组质粒作为阳性标准品，将构建的重组质粒经双向DNA测序鉴定，提取质粒，紫外分光光度计定量，并保存于-20。。。
[0038] (3)阳性工作标准品与阴性工作标准品的制备
[0039]分别将103、104、105、106、107拷贝的阳性标准品加入到阳性反应液中配制成阳性工作标准品，将没有重组的17拷贝的PGM-T质粒加入到阴性反应液中配制成阴性标准工作品O
[0040](4)荧光PCR反应液组成
[0041]
【权利要求】
1.一种曲霉菌定量检测荧光PCR试剂盒，包括阳性工作标准品、阴性工作标准品、检测反应液、红细胞裂解液、稀释液及DNA聚合酶，其特征在于:在阳性工作标准品、阴性工作标准品及检测反应液中均含有特异性引物与特异性探针，所述特异性引物及特异性探针的DNA序列分别为: 特异性引物正向序列SQl:5’ -AAGCACGGCTTGTGTGTTGG-3’或其互补链； 特异性引物反向序列SQ2:5’ -AGCCCCATACGCTCGAGGA-3’或其互补链； 特异性探针序列SQ3:5’ -FAM-AAGGCAGCGGCGGCA-MGB-3’或其互补链。
2.根据权利要求1所述的曲霉菌定量检测荧光PCR试剂盒，其特征在于:所述特异性引物与特异性探针根据曲霉菌ITS序列特性设计，针对曲霉菌ITS序列设计的引物和探针用于检测曲霉菌。
3.根据权利要求1所述的曲霉菌定量检测荧光PCR试剂盒，其特征在于:在所述阳性工作标准品中含有插入烟曲霉特异DNA序列SQ4的pGM-T载体质粒，所插入序列SQ4如下:
SQ4:Gaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgcccccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctgttctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccctctcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacctgctctgtaggcc0
4.根据权利要求1或3所述的曲霉菌定量检测荧光PCR试剂盒，其特征在于:所述阳性工作标准品含有重组质粒的浓度为1.0X 13~1.0X 107。
【文档编号】C12Q1/68GK104164511SQ201410420833
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月25日 优先权日:2014年8月25日
【发明者】何永胜, 杨希寅, 李可可, 藏丹戎, 辛鹤林, 苑庆华 申请人:天津喜诺生物医药有限公司