体外酶法钾测定试剂、其制备方法及其使用方法
【专利摘要】本发明公开体外酶法钾测定试剂，包括分装的体积相同的第一试剂和第二试剂，所述第一试剂内物质浓度如下：pH为7.3温度为25℃的MOPS缓冲液200mmol/L、白蛋白1.00g/L、三磷酸苷5.62mmol/L、EGTA0.982mmol/L、α-酮戊二酸32.7mmol/L、尿素38.3mmol/L、尿素氨基水解酶230u/L、谷氨酸水解酶4320u/L和NaN30.50g/L，第二试剂内物质浓度如下：NaHCO330.9mmol/L、NADH0.845mmol/L、MgSO416mmol/L和NaN30.30g/L，所述第一试剂和第二试剂中的溶剂均为纯水。本发明体外酶法钾测定试剂可长期稳定保存，测定准确性高、成本低、解决Shigeki方法不能应用的问题。
【专利说明】体外酶法钾测定试剂、其制备方法及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及钾测定试剂，特别是涉及体外酶法钾测定试剂。
[0002] 本发明还涉及上述体外酶法钾测定试剂的制备方法以及该体外酶法钾测定试剂 的使用方法。
【背景技术】
[0003] 人体血清中钾的含量测定是临床体外诊断测定项目之一，也是临床常规急诊诊断 中不可缺少的项目。血清钾高于参考值上限，多见于肾上腺皮质功能减退，特别危重患者， 血清钾上升至8mmol/L，患者可能发生心室纤颤；血清钾低于参考值下限，多见于肾小管疾 病，出现严重腹泻、呕吐，肾上腺皮质功能亢进等症状。
[0004] 目前医院测定血清钾多使用离子选择电极（ISE)。其电极是对钾专一性强的缬霉 素膜，是比较理想的测定血清或尿中钾离子浓度方法。缬霉素膜专一性强，但使用寿命短， 一般三个月左右就要更换一次。
[0005] 酶法测定钾的优点是利用分光光度计原理，在全自动生化分析仪上进行测定，全 自动生化仪是医院测定其它众多项目必备仪器，利用生化仪测定钾，医院不需要再购置和 维护离子选择电极设备。上生化仪测定，操作方便，节省开支。酶法测定结果与离子电极法 等效。同样是医院测定钾的理想方法之一。
[0006] 酶法测定钾的方法是上世纪80年代末由Berry. MN等人提出的，他是利用K+是丙 酮酸激酶的激活剂原理，建立起酶法测定血清钾的基本方法，随后德国B. Μ公司正式推出 酶法测定钾的试剂盒，并在全世界市场上销售，受到医院的欢迎。但Berry的原理中，Κ+离 子是丙酮酸激酶的激活剂，Na+离子也是该酶的激活剂，而且血清中Na+离子浓度是K+离子 的12倍。为了保证测定K+离子专一性，必须去除血清中的Na+离子，去除Na+离子依靠加 入一种对Na+专一的人工合成离子穴（Cryptand)。此离子穴价格昂贵，造成钾试剂成本奇 高。这是Berry方法的不利方面。
[0007] 1987年日本人Shigeki Kimura等人提出另一个测定钾的酶法原理，它利用K+是 尿素氨基水解酶（Urea amidolyase简称UAL. EC3. 5. 1. 45)水解尿素的激活剂原理，建立测 定K+的方法。
[0008] 起反应如下：
[0009] (l)Urca (尿素）+ATP(三磷酸腺苷）+HC03_(碳酸氢 钠）UAL(願=縣角權)-ADP (二磷酸腺苷）+HC03-+NHJ氨离子）+0H_ Mg2 ·Κ+
[0010] (2)NH； +a_酮戊二酸+NADH GLDH(谷氨酸脱氢酶）
[0011] UAL水解Urea时需加入ATP、HC03_作为底物，在Mg++和K+离子激活下，生成NH 4+和 0H+,生成的MV,加入a-酮戊二酸和NADH，在GLDH的作用下生成glutamate和NAD+,在 340nm波长下，激活剂K+的多少与NADH下降成正比，建立起测定K+基本方法。
[0012] Shigeki等人的具体测定试剂分为试剂1和试剂2 :各试剂内成分及浓度如下：
[0013] 试剂 1 :
[0014] BSA(白蛋白）....................3g/L
[0015] a-酮戊二酸…· · 14. 4mmol/L
[0016] NADH............................................0.53臟01/1
[0017] Urea............................................4. 47mmol/L
[0018] NaHC03........................................... 51. 4mmol/L
[0019] EGTA.............................................. 0. 5mmol/L
[0020] Magnesium acetate......................... . 7. 2mmol/L
[0021] UAL...............................................330.4U/L
[0022] GIDH.............................................· 43. 2Ku/L
[0023] Imidazole buffer......· · 200mmol/L pH7. 0 37°C
[0024] 试剂 2
[0025] BSA (白蛋白）....................................3g/L
[0026] ATP................................................9. 72mmol/L
[0027] Urea.............................................. 4. 47mmol/L
[0028] NaHC03........................................... 51. 4mmol/L
[0029] EDTA.............................................. 0. 5mmol/L
[0030] Magnuesium acetate (醋酸缓）............· 7. 2mmol/L
[0031] Imidazole buffer…·200mmol/L ρΗ7· 0 37°C
[0032] 其中，NADH为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，是一种转递质子（更准确来说是氢离子） 的辅酶，它出现在细胞很多代谢反应中。EGTA为乙二醇二乙醚二胺四乙酸，即GEDTA，EGTA 是最为被广泛使用的钙离子选择性的螯合剂，用于在镁存在下，测定钙。它与钙离子形成的 复合物比与镁离子形成的复合物要稳定100, 〇〇〇倍，被用来制备钙缓冲液和控制钙离子 的浓度。容量分析及光度分析中测量微量金属的络合剂、掩蔽剂。也可滴定钡、锶、铜、镁 和锌。Magnesium acetate是乙酸镁,无色单斜晶体，易潮解。溶于水，水溶液通常为中性 或弱酸性。在空气中易潮解，加热脱水。用作试剂、医药、催化剂等。UAL是尿素氨基水解 酶，别名 Urea-amidohydrolase。GIDH 是 glutamate dehydrogenase，即谷氨酸脱氢酶，催化 谷氨酸脱氨生成α-酮戊二酸和氨的反应。且谷氨酸脱氢酶是唯一既能利用NAD+又能利 用NADH+作为还原当量的酶。是一种不需氧的脱氢酶。Imidazole buffer为咪唑缓冲液， 分子式C3H4N2,分子量68,08g/mol，微溶于苯、石油醚，溶于乙醚、丙酮、氯仿、吡啶，易溶于 水、乙醇。缓冲范围：6. 27. 8。可用于含有His蛋白质亲和层析中做洗脱液（树脂上的 二价阳离子Ni2+可与咪唑基团结合。BSA是牛血清白蛋白，是牛血清中的一种白蛋白，包含 583个氨基酸残基，分子量为66. 430kDa，等电点为4. 7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛 的应用，例如在western blot中作为Blocking agent;在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过 提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶 的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。ATP是三磷 酸腺苷的缩写，其结构式是:A-P?P?P，它是一种含有高能磷酸键的有机化合物，它的大 量化学能就储存在高能磷酸键中。
[0033] 用Shigeki方法，基本原理与Berry相同，它的优点不受Na+干扰，不需要用昂贵的 Na+离子穴（crgptand),试剂成本低，简单易行。但主要的缺点是试剂1和试剂2随存放时 间延长，其测定值迅速下降。
[0034]
【权利要求】
1. 体外酶法钾测定试剂，其特征在于：包括分开包装的体积相同的第一试剂和第 二试剂，所述第一试剂内的物质及各物质浓度如下所示：pH为7. 3温度为25°C的MOPS 缓冲液 200mmol/L、白蛋白 1. 00g/L、三磷酸苷 5. 62mmol/L、EGTA 0· 982mmol/L、α -酮 戊二酸32. 7mmol/L、尿素38. 3mmol/L、尿素氨基水解酶230u/L、谷氨酸水解酶4320u/ L和NaN30. 50g/L，第二试剂内的物质及各物质浓度如下所示：NaHC0330. 9mmol/L、 NADHO. 845mmol/L、MgS0416mmol/L和叠氨钠0. 30g/L，所述第一试剂和第二试剂中的溶剂均 为纯水。
2. 权利要求1所述的体外酶法钾测定试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： A. 制备第一试剂：在温度为25°C的条件下将PH为7. 3的MOPS缓冲液200mmol、白蛋 白 1. 00g、三磷酸苷 5. 62mmol、EGTAO. 982mmol、α -酮戊二酸 32. 7mmol、尿素 38. 3mmol、尿 素氨基水解酶230u、谷氨酸水解酶4320u、NaN30. 50g依次加入纯水中配置成1L溶液，搅拌 25-35分钟后按照160ml -份分开封闭包装； B. 制备第二试剂：将 NaHC0330. 9mmol、NADH 0· 845mmol、MgS0416mmol、叠氨钠 0· 30g 和 纯水配置成1L溶液，搅拌25-35分钟后按照160ml -份分开封闭包装； C. 组合包装，将一份包装后的第一试剂与一份包装后的第二试剂封装在测定试剂盒 内。
3. 权利要求1或2所述的体外酶法钾测定试剂的使用方法，其特征在于：每160 μ 1第 一试剂与160 μ 1第二试剂混合后对血清样本进行测定。
【文档编号】C12Q1/34GK104152535SQ201410425391
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月26日 优先权日:2014年8月26日
【发明者】朱以桂, 朱小晖 申请人:北京瑞正善达生物工程技术有限公司