一种提高虎杖中白藜芦醇含量的培养基及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高虎杖中白藜芦醇含量的培养基，其组分按每升培养基水溶液中所含物质的质量计包括：KNO3 1900mg,NH4NO31650mg，CaCl·2H2O 440mg，MgSO4·7H2O 370mg，KH2PO4 170mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2EDTA 37.3mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，H3BO3 6.2mg，KI 0.83mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，肌醇100mg，甘氨酸 2mg，盐酸吡哆醇0.5mg，盐酸硫胺素0.5mg，烟酸0.5mg，琼脂 6.5g，蔗糖30g，布洛芬 5-20mg，乙酰水杨酸1-5mg，谷氨酰胺30-70mg，S-亚硝基-N-乙酰青霉胺 15-25mg。该培养基对虎杖的生长发育具有较好的促进效果，能显著提高虎杖中白藜芦醇的合成速度及含量。
【专利说明】一种提高虎杖中白藜芦醇含量的培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高虎杖中白藜芦醇含量的培养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来的大量研究发现白藜芦醇可降低血液粘稠度，抑制血小板凝结，并能促进 血管舒张，保持血液畅通，预防癌症的发生及发展，具有抗动脉粥样硬化和防治冠心病，缺 血性心脏病，高血脂的作用，还具抑制肿瘤的作用和雌激素样作用，可用于治疗乳腺癌等疾 病，还证实白藜芦醇具有抗氧化及抗衰老的功效，因此成为非常有前途的保健型药物。
[0003] 白藜芦醇在植物中的含量一般都很低，虎杖是白藜芦醇含量最高的植物，多年生 根中白藜芦醇含量最高可达lmg/g，叶中含量也可达到0. 7647 mg/g，因此成为工厂化提取 白藜芦醇的主要植物。然而，虎杖是一种野生药用植物，生长速度慢，靠传统的采挖远远满 足不了人们对白藜芦醇的需求。
[0004] 利用植物组织培养技术在室内大量繁殖虎杖是一个很有发展前景的方法。植物组 织培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞和原生质体，培养在人工配制的 培养基上，给予适当的培养条件，使细胞增殖或使其长成完整的植株。
[0005] 提供一种适合虎杖生长的培养基，以提高白藜芦醇含量正是本发明的目的。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一是提供一种提高虎杖中白藜芦醇含量的培养基。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是： 构成该培养基的组分按每升培养基水溶液中所含物质的质量计包括： KNO3 1900mg, NH4NO3 1650 mg, CaCl · 2H20 440 mg, MgSO4 · 7H20 370 mg, KH2PO4 170 mg, FeSO4 *7H20 27.8 mg, Na2EDTA 37.3 mg, MnSO4 *4H20 22.3 mg, ZnSO4 *7H20 8.6 mg, H3BO3 6. 2 mg, KI 0· 83 mg, Na2MoO4 · 2H20 0· 25 mg, CuSO4 · 5H20 0· 025 mg, CoCl2 · 6H20 0.025 mg,肌醇100 mg,甘氨酸2 mg,盐酸批卩多醇0.5 mg,盐酸硫胺素0.5 mg,烟酸0.5 mg,琼脂 6. 5g,鹿糖30g,布洛芬 5-20 mg,乙酰水杨酸1-5 mg,谷氨酰胺30-70 mg, S-亚硝基-N-乙酰青霉胺15-25 mg。
[0008] 本发明的目的之二是提供一种提高虎杖中白藜芦醇含量的培养基的制备方法。
[0009] 本发明采用包含以下步骤的制备方法来达到本发明的目的： (1) 大量元素母液的配制 称取 KNO3 19000mg，NH4NO3 16500mg，MgSO4WH2O 3700mg，KH2PO4 1700mg，CaCl2CH2O 4400mg，分别用蒸馏水充分溶解后，按先后次序倒入1000ml的容量瓶中，充分混合，最后定 容到 IOOOml ; (2) 微量元素母液的配制 称取 MnS04.4H20 2230mg，ZnS04.7H20 860mg，H3BO3 620mg，KI 83mg，Na2MoO4CH2O 25mg，CuS04*5H20 2. 5mg，C〇C12*2H20 2. 5mg，分别用蒸馈水充分溶解后，按先后次序倒入 IOOOml的容量瓶中，充分混合，最后定容到IOOOml ; (3) 铁盐母液的配制 称取Na2*EDTA 3730mg，FeSO4MH2O 2780mg，分别用蒸馏水充分溶解后，按先后次序倒 入500ml的容量瓶中，充分混合，最后定容到500ml ; (4) 有机化合物母液的配制 称取甘氨酸IOOmg,盐酸批卩多醇25mg，盐酸硫胺素 25mg，烟酸25mg，肌醇5000mg，分别 用蒸馈水充分溶解后，按先后次序倒入500ml的容量瓶中，充分混合，最后定容到500ml ; (5) 植物生长调节剂母液的配制 将布洛芬、乙酰水杨酸和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺用蒸馏水分别配制成浓度均为 1的布洛芬母液、乙酰水杨酸母液和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺母液；将谷氨酰胺用 蒸馈水配制成浓度为IOmg^r 1的谷氨酰胺母液； (6) 培养基的配制 (a)将6. 5g琼脂和30g蔗糖加入到少于IOOOml的蒸馏水中，加热使琼脂和蔗糖完全 融化；(b)然后再加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml、铁盐母液10ml、有机化合物 母液IOml ;(c)高压灭菌锅灭菌后，冷却至60-70°C时，加入布洛芬母液5-20ml、乙酰水杨 酸母液l-5ml、谷氨酰胺母液3-7ml、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺15-25ml，用蒸馏水定容至 1000ml，调节pH值为5. 8?6. 4,冷却凝固后即得凝胶状培养基。
[0010] 本发明组方中提供了虎杖生长所需的氮、磷、钾等大量元素，铜、铁、锰等微量元 素，以及肌醇、甘氨酸等有机化合物，为虎杖的生长提供丰富的营养物质。尤其是植物生长 调节剂布洛芬、乙酰水杨酸、谷氨酰胺和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺的引入，在改善虎杖的生 长代谢、缩短生长周期以及提高白藜芦醇合成速度等方面具有积极的意义；其中，布洛芬（ Ibuprofen)和乙酰水杨酸（Aspirin)都是人工合成的解热镇痛抗炎药，具有较好的解热、 镇痛作用，可用于感冒、发烧等。这两种医药的结构和某些生长素类植物生长调节剂有共 同之处，是一种植物生长调节物质，不仅参与植物开花、种子发育、膜透性、吸收等生理活 性，还与植物抗病性有关。谷氨酰胺是合成生物体内极其重要的抗氧化剂-还原型谷胱甘 肽的前体物质，是构成蛋白质中氨基酸和合成含氨生物物质的氮源，与组织生长和修补有 密切的关系，在生命活动中起重要作用；S-亚硝基-N-乙酰青霉胺是一氧化氮的供体，一氧 化氮是一种广泛分布于生物体的气体活性分子，具有多种生理功能，一氧化氮是生物体内 分布极为广泛的信号分子之一，除哺乳动物外，一氧化氮在原生动物、细菌、酵母和植物中 也作为一种普遍存在的信号分子而起作用。
[0011] 本发明具有以下优点：（1)营养丰富，可使虎杖生长更旺盛，（2)提高了虎杖中白 藜芦醇的合成速度，使虎杖中白藜芦醇含量明显增加，达到野生虎杖白藜芦醇含量，并且比 野生虎杖的生长周期缩短10倍左右。
【具体实施方式】
[0012] 以下通过实施例进一步说明本发明技术方案，这些实施例仅是用来详细展现本发 明的技术构思及其可实施性，并不是对本发明保护范围的限制，利用本发明技术构思做出 的等效替换和变通仍然在本发明的保护范围之内。
[0013] 实施例1 提高虎杖中白藜芦醇含量的培养基，其组分按每升培养基水溶液中所含物质的质量计 为： KNO3 1900mg, NH4NO3 1650 mg, CaCl · 2H20 440 mg, MgSO4 · 7H20 370 mg, KH2PO4 170 mg, FeSO4 *7H20 27.8 mg, Na2EDTA 37.3 mg, MnSO4 *4H20 22.3 mg, ZnSO4 *7H20 8.6 mg, H3BO3 6. 2 mg, KI 0· 83 mg, Na2MoO4 · 2H20 0· 25 mg, CuSO4 · 5H20 0· 025 mg, CoCl2 · 6H20 0.025 mg,肌醇100 mg,甘氨酸 2 mg,盐酸批咳醇0. 5 mg,盐酸硫胺素0. 5 mg,烟酸 0.5 mg,琼脂6. 5g,鹿糖30g,布洛芬5 mg,乙酰水杨酸I mg,谷氨酰胺30 mg, S-亚硝 基-N-乙酰青霉胺15 mg。
[0014] 实施例2 提高虎杖中白藜芦醇含量的培养基，其组分按每升培养基水溶液中所含物质的质量计 为： KNO3 1900mg, NH4NO3 1650 mg, CaCl · 2H20 440 mg, MgSO4 · 7H20 370 mg, KH2PO4 170 mg, FeSO4 *7H20 27.8 mg, Na2EDTA 37.3 mg, MnSO4 *4H20 22.3 mg, ZnSO4 *7H20 8.6 mg, H3BO3 6. 2 mg, KI 0· 83 mg, Na2MoO4 · 2H20 0· 25 mg, CuSO4 · 5H20 0· 025 mg, CoCl2 · 6H20 0.025 mg,肌醇100 mg,甘氨酸 2 mg,盐酸批咳醇0. 5 mg,盐酸硫胺素0. 5 mg,烟酸 0.5 mg,琼脂6. 5g,鹿糖30g,布洛芬IOmg,乙酰水杨酸2 mg,谷氨酰胺50 mg, S-亚硝 基-N-乙酰青霉胺20 mg。
[0015] 实施例3 提高虎杖中白藜芦醇含量的培养基，其组分按每升培养基水溶液中所含物质的质量计 为： KNO3 1900mg, NH4NO3 1650 mg, CaCl · 2H20 440 mg, MgSO4 · 7H20 370 mg, KH2PO4 170 mg, FeSO4 *7H20 27.8 mg, Na2EDTA 37.3 mg, MnSO4 *4H20 22.3 mg, ZnSO4 *7H20 8.6 mg, H3BO3 6. 2 mg, KI 0· 83 mg, Na2MoO4 · 2H20 0· 25 mg, CuSO4 · 5H20 0· 025 mg, CoCl2 · 6H20 0.025 mg,肌醇100 mg,甘氨酸2 mg,盐酸批卩多醇0.5 mg,盐酸硫胺素0.5 mg,烟酸0.5 mg,琼脂 6. 5g,鹿糖30g,布洛芬 20 mg,乙酰水杨酸5 mg,谷氨酰胺70 mg, S-亚硝 基-N-乙酰青霉胺25 mg。
[0016] 实施例4 提高虎杖中白藜芦醇含量的培养基的制备方法，步骤如下： (1) 大量元素母液的配制 称取 KNO3 19000mg，NH4NO3 16500mg，MgSO4WH2O 3700mg，KH2PO4 1700mg，CaCl2CH2O 4400mg，分别用蒸馏水充分溶解后，按先后次序倒入IOOOml的容量瓶中，充分混合，最后定 容到 IOOOml ; (2) 微量元素母液的配制 称取 MnS04.4H20 2230mg，ZnS04.7H20 860mg，H3BO3 620mg，KI 83mg，Na2MoO4CH2O 25mg，CuS04*5H20 2. 5mg，C〇C12*2H20 2. 5mg，分别用蒸馈水充分溶解后，按先后次序倒入 IOOOml的容量瓶中，充分混合，最后定容到IOOOml ; (3) 铁盐母液的配制 称取Na2*EDTA 3730mg，FeSO4MH2O 2780mg，分别用蒸馏水充分溶解后，按先后次序倒 入500ml的容量瓶中，充分混合，最后定容到500ml ; (4) 有机化合物母液的配制 称取甘氨酸IOOmg,盐酸批卩多醇25mg，盐酸硫胺素25mg，烟酸25mg，肌醇5000mg，分别 用蒸馈水充分溶解后，按先后次序倒入500ml的容量瓶中，充分混合，最后定容到500ml ; (5) 植物生长调节剂母液的配制 将布洛芬、乙酰水杨酸和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺用蒸馏水分别配制成浓度均为 1的布洛芬母液、乙酰水杨酸母液和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺母液；将谷氨酰胺用 蒸馈水配制成浓度为IOmg^r 1的谷氨酰胺母液； (6) 培养基的配制 (а) 将6. 5g琼脂和30g蔗糖加入到少于IOOOml的蒸馏水中，加热使琼脂和蔗糖完全融 化；(b)然后再加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml、铁盐母液10ml、有机化合物母 液IOml ; (c)高压灭菌锅灭菌后，冷却至60-70°C时，加入布洛芬母液10ml、乙酰水杨酸母 液2ml、谷氨酰胺母液5ml、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺20ml，用蒸馏水定容至1000ml，调节 PH值为6,冷却凝固后即得凝胶状培养基。
[0017] 实施例5 提高虎杖中白藜芦醇含量的培养基的制备方法，步骤如下： (1) 大量元素母液的配制，该步骤与实施例4的步骤（1)相同； (2) 微量元素母液的配制，该步骤与实施例4的步骤（2)相同； (3) 铁盐母液的配制，该步骤与实施例4的步骤（3)相同； (4) 有机化合物母液的配制，该步骤与实施例4的步骤（4)相同； (5) 植物生长调节剂母液的配制，该步骤与实施例4的步骤（5)相同； (б) 培养基的配制 (а) 将6. 5g琼脂和30g蔗糖加入到少于IOOOml的蒸馏水中，加热使琼脂和蔗糖完全融 化；(b)然后再加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml、铁盐母液10ml、有机化合物母 液IOml ;(c)高压灭菌锅灭菌后，冷却至60-70°C时，加入布洛芬母液5ml、乙酰水杨酸母液 lml、谷氨酰胺母液3ml、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺15ml，用蒸馏水定容至1000ml，调节pH 值为5. 8,冷却凝固后即得凝胶状培养基。
[0018] 实施例6 提高虎杖中白藜芦醇含量的培养基的制备方法，步骤如下： (1) 大量元素母液的配制，该步骤与实施例4的步骤（1)相同； (2) 微量元素母液的配制，该步骤与实施例4的步骤（2)相同； (3) 铁盐母液的配制，该步骤与实施例4的步骤（3)相同； (4) 有机化合物母液的配制，该步骤与实施例4的步骤（4)相同； (5) 植物生长调节剂母液的配制，该步骤与实施例4的步骤（5)相同； (б) 培养基的配制 (a)将6. 5g琼脂和30g蔗糖加入到少于IOOOml的蒸馏水中，加热使琼脂和蔗糖完全融 化琼脂直至沸腾；(b)然后再加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml、铁盐母液10ml、 有机化合物母液IOml ; (c)高压灭菌锅灭菌后，冷却至60-70°C时，加入布洛芬母液20ml、 乙酰水杨酸母液5ml、谷氨酰胺母液7ml、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺25ml，用蒸馈水定容至 1000ml，调节pH值为6. 4,冷却凝固后即得凝胶状培养基。
[0019] 下面通过对比试验来验证本发明对提高虎杖中白藜芦醇含量有积极效果。
[0020] 一、制备培养基 1.对照培养基的制备：即制备不含布洛芬、乙酰水杨酸、谷氨酰胺、S-亚硝基-N-乙酰 青霉胺的培养基。该培养基大致按照实施例4的方法制备，其制备步骤包括（1)- (5)五个 步骤，其中步骤（1)-(4)与实施例4完全相同，步骤（5)也由（a)、（b)和（c)三个小步骤 构成，其中的（a)和（b)与实施例4的步骤（6)中的（a)和（b)完全相同，不同之处在于步 骤（c)，步骤（c)按下述操作：高压灭菌锅灭菌后，用蒸馏水定容至1000ml，调节pH值为6， 装入培养瓶冷却凝固，记为1号培养基。
[0021] 2.含布洛芬和乙酰水杨酸培养基的制备：制备含布洛芬和乙酰水杨酸的培养基。 该培养基大致按照实施例4的方法制备，也包括步骤（1)- (6)，其中步骤（1)- (4)与实施 例4的步骤（1) - (4)完全相同，步骤（5)按照实施例4的步骤（5)所述的方法只配制布洛 芬和乙酰水杨酸的母液，步骤（6)中的（a)和（b)与实施例4的步骤（6)中的（a)和（b)完 全相同，不同之处在于步骤（c)，步骤（c)按下述操作：高压灭菌锅灭菌后，冷却至60-70°C 时，加入布洛芬母液IOml和乙酰水杨酸母液2ml，用蒸馈水定容至1000ml，调节pH值为6， 装入培养瓶冷却凝固，记为2号培养基。
[0022] 3.含乙酰水杨酸、谷氨酰胺和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺培养基的制备：制备含 乙酰水杨酸、谷氨酰胺和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺的培养基。该培养基大致按照实施例4 的方法制备，也包括步骤（1)- (6)，其中步骤（1)- (4)与实施例4的步骤（1)- (4)完全 相同，步骤（5)按照实施例4的步骤（5)所述的方法只配制乙酰水杨酸、谷氨酰胺和S-亚 硝基-N-乙酰青霉胺的母液，步骤（6)中的（a)和（b)与实施例4的步骤（6)中的（a)和 (b)完全相同，不同之处在于步骤（c)，步骤（c)按下述操作：高压灭菌锅灭菌后，冷却至 60-70°C时，加入乙酰水杨酸母液2ml、谷氨酰胺母液5ml和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺20ml， 用蒸馏水定容至1000ml，调节pH值为6,装入培养瓶冷却凝固，记为3号培养基。。
[0023] 4.含布洛芬、乙酰水杨酸、谷氨酰胺和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺培养基的制备： 即制备含布洛芬、乙酰水杨酸、谷氨酰胺和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺的培养基。该培养基 完全按照实施例4的方法制备，只是培养基溶液装入培养瓶中冷却凝固，记为4号培养基。
[0024] 二、虎杖组培苗的接种 取约0. 5厘米长的带芽的虎杖无菌苗茎段，将其形态学下端插入到上述四种培养基 中，每瓶中插入4段，并均匀分布，插完后用封口膜将培养瓶封口。
[0025] 三、培养及观察 将已接种无菌苗的培养瓶置于恒温培养箱或培养室中培养约1个月。培养条件为温 度25°C左右，光照为20001X，每天光照时间为14小时。四周后，从每种培养基中随机抽取 3株虎杖组培苗，观察虎杖组培苗的生长状况，用直尺测量其高度，并对其叶片进行记数，然 后称量鲜重，统计好数据。
[0026] 培养1个月后，所测得的虎杖组培苗的芽数、叶数、株高和鲜重见表1。
[0027] 表1虎杖组培苗的芽数、叶数、株高和鲜重表
【权利要求】
1. 一种提高虎杖中白藜芦醇含量的培养基，其特征在于构成该培养基的组分按每升培 养基水溶液中所含物质的质量计包括： KNO3 1900mg, NH4NO3 1650 mg, CaCl ? 2H20 440 mg, MgSO4 ? 7H20 370 mg, KH2PO4 170 mg, FeSO4 *7H20 27.8 mg, Na2EDTA 37.3 mg, MnSO4 *4H20 22.3 mg, ZnSO4 *7H20 8.6 mg, H3BO3 6. 2 mg, KI 0? 83 mg, Na2MoO4 ? 2H20 0? 25 mg, CuSO4 ? 5H20 0? 025 mg, CoCl2 ? 6H20 0.025 mg,肌醇100 mg,甘氨酸2 mg,盐酸批卩多醇0.5 mg,盐酸硫胺素0.5 mg,烟酸0.5 mg,琼脂 6. 5g,鹿糖30g,布洛芬 5-20 mg,乙酰水杨酸1-5 mg,谷氨酰胺30-70 mg, S-亚硝基-N-乙酰青霉胺15-25 mg。
2. 权利要求1所述提高虎杖中白藜芦醇含量的培养基的制备方法，其特征在于包括以 下步骤： (1) 大量元素母液的配制 称取 KNO3 19000mg，NH4NO3 16500mg，MgSO4WH2O 3700mg，KH2PO4 1700mg，CaCl2CH2O 4400mg，分别用蒸馏水充分溶解后，按先后次序倒入1000ml的容量瓶中，充分混合，最后定 容到 IOOOml ; (2) 微量元素母液的配制 称取 MnS04.4H20 2230mg，ZnS04.7H20 860mg，H3BO3 620mg，KI 83mg，Na2MoO4CH2O 25mg，CuS04*5H20 2. 5mg，C〇C12*2H20 2. 5mg，分别用蒸馈水充分溶解后，按先后次序倒入 IOOOml的容量瓶中，充分混合，最后定容到IOOOml ; (3) 铁盐母液的配制 称取Na2*EDTA 3730mg，FeSO4MH2O 2780mg，分别用蒸馏水充分溶解后，按先后次序倒 入500ml的容量瓶中，充分混合，最后定容到500ml ; (4) 有机化合物母液的配制 称取甘氨酸IOOmg,盐酸批卩多醇25mg，盐酸硫胺素25mg，烟酸25mg，肌醇5000mg，分别 用蒸馈水充分溶解后，按先后次序倒入500ml的容量瓶中，充分混合，最后定容到500ml ; (5) 植物生长调节剂母液的配制 将布洛芬、乙酰水杨酸和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺用蒸馏水分别配制成浓度均为 1的布洛芬母液、乙酰水杨酸母液和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺母液；将谷氨酰胺用 蒸馈水配制成浓度为IOmg^r 1的谷氨酰胺母液； (6) 培养基的配制 (a)将6. 5g琼脂和30g蔗糖加入到少于IOOOml的蒸馏水中，加热使琼脂和蔗糖完全 融化；(b)然后再加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml、铁盐母液10ml、有机化合物 母液IOml ; (c)高压灭菌锅灭菌后，冷却至60-70°C时，加入布洛芬母液5-20ml、乙酰水杨 酸母液l-5ml、谷氨酰胺母液3-7ml、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺15-25ml，用蒸馏水定容至 1000ml，调节pH值为5. 8?6. 4,冷却凝固后即得凝胶状培养基。
【文档编号】C12P7/22GK104313061SQ201410450833
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月5日 优先权日:2014年9月5日
【发明者】夏海武, 曹慧, 万永霞, 郭祖宝 申请人:潍坊学院