一种提高淀粉酶热稳定性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高淀粉酶热稳定性的方法，属于酶工程【技术领域】。本发明通过甘油与钾离子的协同添加显著提高淀粉酶的热稳定性，大大提高了酶的工业化应用价值，同时该发明操作简单、成本低廉，具有较好的推广潜力。
【专利说明】一种提高淀粉酶热稳定性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高淀粉酶热稳定性的方法，属于酶工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 在酶法合成过程中，酶的热稳定性是很关键的一个因素。酶的热稳定性高不仅可 以延长酶的储存时间、减少酶在运输过程中酶活的损失，而且可以使酶在较高反应温度下 延长酶的反应时间，提高生产效率，进而有效的降低生产成本。
[0003] 淀粉酶指作用于淀粉或其衍生物的一类酶，可催化水解或转苷反应。淀粉酶在食 品、医药、纺织等工业中具有十分广泛的应用，提高淀粉酶的热稳定性对于其工业化应用具 有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种提高酶热稳定性的酶液，由酶和稳定剂组成，所述稳定剂活性 成分为甘油和钾离子。
[0005] 所述酶液中甘油含量为5% -20% (w/v)，钾离子浓度为0. ImM-ImM。
[0006] 所述甘油含量为5 % -20% (w/v)，是指每IOOmL酶液中含有甘油5g至20g。
[0007] 所述酶液中酶的终浓度为5-20 μ Μ。
[0008] 所述酶液，在本发明的一种实施方式中以水为溶剂。
[0009] 所述钾离子是除KOH外的能形成钾离子的化合物，如KC1、kno3、K 2S04、κη2ρο4、 K2HPO4'K3PO4 等。
[0010] 所述酶液中的酶为淀粉酶
[0011] 所述淀粉酶是淀粉分支酶、中温α -淀粉酶、β -淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、麦芽四糖 生成酶或麦芽六糖生成酶中的任 种。
[0012] 所述淀粉酶优选淀粉分支酶。
[0013] 本发明还提供一种提高酶的热稳定性的方法，是将甘油和钾离子用于提高酶的热 稳定性。
[0014] 所述提高酶的热稳定性的方法，是在酶液中加入以甘油和钾离子为活性成分的稳 定剂，混合后的酶液中甘油终浓度为5% -20% (w/v)，钾离子终浓度为0. ImM-ImM。
[0015] 所述提高酶的热稳定性的方法，混合后的酶液中酶终浓度为5-20 μ Μ。
[0016] 所述提高酶的热稳定性的方法，是将淀粉酶加入以甘油和钾离子为活性成分 的体系中，混合后的酶液中甘油含量与酶液的质量体积比为5 % -20 %，钾离子浓度为 0. lmM-lmM。
[0017] 经试验确定，本发明对淀粉分支酶、中温α -淀粉酶、β -淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、 麦芽四糖生成酶、麦芽六糖生成酶等均有一定效果。
[0018] 本发明方案能够提高淀粉酶热稳定性的原因可能是甘油的添加能够排斥酶分子 周围的渗透质，使酶优先水化，提高其构象的稳定性；钾离子的添加能够增强这种水化作 用，同时有些酶上可能存在钾离子结合位点，能够进一步增强酶构象的稳定。本发明通过甘 油与钾离子的协同添加显著提高淀粉酶的热稳定性，大大提高了酶的工业化应用价值，同 时该发明操作简单、成本低廉，具有较好的推广潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1不同浓度甘油对淀粉分支酶热稳定性的影响，其中，:未添加甘油；★ :20% 甘油；? :10%甘油；Λ :7. 5%甘油；〇：5%甘油
[0020] 图2不同浓度钾离子对淀粉分支酶热稳定性的影响，其中，:未添加钾离子；〇： 0. ImM钾离子；Λ :0. 5mM钾离子；? :lmM钾离子
[0021] 图3甘油和钾离子对淀粉分支酶热稳定的影响，其中，:未添加助剂；〇：10%甘 油；Λ :10%甘油和0. 5mM钾离子
【具体实施方式】
[0022] 实施例1
[0023] 淀粉分支酶的热稳定性分析方法：淀粉分支酶在一定温度下保温，不同时间点取 样，迅速冷却至〇°C，测定酶的残余活力，以未保温酶液的活力为100 %。绘制相对酶活与时 间的曲线。
[0024] 淀粉分支酶活力的测定方法：取适当稀释的酶液300 μ L，加入装有预先用50mM的 MOPS缓冲液（pH7. 0)配制的lOOmg/mL直链淀粉溶液中，在50°C下反应120min。反应结束 后沸水浴中灭酶15min。将反应液在室温下保温20min后，尚心取上清液lmL，加入ImL醋 酸钠缓冲液（ρΗ3· 5)和 100μ L 异淀粉酶（1000U，Sigma，15284)，在 37°C下 200r/min 的摇 床中反应20h。反应结束后在沸水浴中灭酶15min，利用_硝基水杨酸法测定体系中还原糖 量。一个酶活单位定义为单位时间内产生Immol的α-1，6糖苷键所需要加入淀粉分支酶 的量。
[0025] 实施例2
[0026] 将来源于Geobacillus thermoglucosidans STB02的淀粉分支酶与甘油混合均 匀制得酶溶液，其中甘油终浓度分别为5%、7. (w/v)，酶浓度为5μΜ，将该 酶溶液于4°C静置60min，在65°C下测定淀粉分支酶的热稳定性，结果如图1所示，该淀粉 分支酶6511C下的半衰期约为50min，与空白对照相比，添加甘油后淀粉分支酶的热稳定性 显著提高，终浓度为5^-20% (w/v)的甘油均能将该淀粉分支酶65°C下的半衰期提高至 120min 以上。
[0027] 实施例3
[0028] 在淀粉分支酶溶液中，加入KCl使钾离子终浓度分别为0. lmM、0. 5mM、lmM，酶的终 浓度为20 μ M，混匀，4°C静置60min，65°C下测定淀粉分支酶的热稳定性，结果如图2所示， 与空白对照相比，淀粉分支酶的热稳定性变化不大。
[0029] 实施例4
[0030] 将甘油水溶液与来源于Geobacillus thermoglucosidans STB02的淀粉分支酶混 合，使甘油终浓度为10% (w/v)，酶浓度为10 μ M，并添加 KCl溶液，钾离子终浓度为0.5mM， 混匀，4°C静置60min，在65°C下测定淀粉分支酶的热稳定性，结果如图3所示，与不添加助 剂的空白对照或者只添加10%甘油的对照相比，淀粉分支酶的热稳定性显著提高。在65°C 下保温2h，其相对活力为空白的4. 6倍；与单独添加甘油相比，是其在65°C下保温2h后残 余活力的1. 3倍。
[0031] 实施例5
[0032] 将甘油水溶液与来源于Geobacillus thermoglucosidans STB02的淀粉分支酶 混合，使甘油终浓度为20% (w/v)，并添加 K2SO4溶液，钾离子终浓度为ImM，混匀，4°C静置 60min，分别在45°C、50°C、55°C下测定淀粉分支酶的热稳定性，与不添加助剂的空白对照或 者只添加20%甘油的对照相比，淀粉分支酶的热稳定性显著提高。在45°C、50°C、55°C下分 别保温4h，其相对活力为空白的5-8倍；与单独添加甘油相比，是其在对应温度下保温4h 后残余活力的1. 1-2. 5倍。
[0033] 实施例6
[0034] 在来源于Geobacillus thermoglucosidans STB02的淀粉分支酶酶液中，加入以 甘油和钾离子为活性成分的稳定剂，使甘油终浓度为5% (w/v)，酶浓度为5 μ M，钾离子终 浓度为〇. ImM，混匀，4°C静置60min，在55°C下测定淀粉分支酶的热稳定性，与不添加助剂 的空白对照或者只添加5%甘油的对照相比，淀粉分支酶的热稳定性显著提高。在55°C下 分别保温4h，其相对活力为空白的4. 6倍；与单独添加甘油相比，是其在对应温度下保温4h 后残余活力的1. 56倍。
[0035] 实施例7
[0036] 麦芽六糖生成酶的热稳定性分析方法：酶液在一定温度下保温，不同时间点取样， 迅速冷却至〇°C，测定酶的残余活力，以未保温酶液的活力为100%。绘制相对酶活与时间 的曲线。
[0037] 麦芽六糖生成酶活力的测定方法：采用DNS法。取适当稀释的酶液0· 2mL，加入装 有I. SmL预先用20mM柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液（pH6. 5)配置的1% (w/v)可溶性淀粉溶 液的IOmL比色管中，在45°C下反应15min后，加入2. OmLDNS停止反应，在沸水浴中准确加 热5min，冷水冷却至室温，加入4. OmL蒸馈7jC，震荡均勻，在540nm下测定吸光值，用蒸馈水 调零点。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成Iug还原 糖所需的酶量。
[0038] 实施例8
[0039] 将甘油水溶液与来源于Bacillus stearothermophilus的麦芽六糖生成酶混 合，使甘油终浓度为20% (w/v)，酶浓度为10 μ M，并添加 KNO3溶液，钾离子终浓度为 0. ImM-ImM,混勻，4°C静置60min，在60°C下测定麦芽六糖生成酶的热稳定性，与不添加助 剂的空白对照或者只添加20%甘油的对照相比，麦芽六糖生成酶的热稳定性显著提高。在 60°C下保温lh，其相对活力为空白的1.2-3倍；与单独添加甘油相比，是其在60°C下保温 Ih后残余活力的L 1-2倍。
[0040] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1. 一种酶热稳定性提高的酶液，其特征在于，由酶和稳定剂组成，稳定剂活性成分为甘 油和钾离子。
2. 根据权利要求1所述的酶液，其特征在于，所述酶为淀粉酶。
3. 根据权利要求1所述的酶液，其特征在于，甘油与酶液的比例为5g至20g每IOOmL, 钾离子浓度为〇. ImM-ImM。
4. 根据权利要求1所述的酶液，其特征在于，所述酶液中酶终浓度为5-20 μ Μ。
5. 根据权利要求2所述的酶液，其特征在于，所述淀粉酶是淀粉分支酶、中温α-淀粉 酶、β -淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、麦芽四糖生成酶或麦芽六糖生成酶中的任一一种。
6. 根据权利要求1-4所述的任一酶液，其特征在于，所述酶液中钾离子是以下化合物 溶解后的钾离子：KC1、KN03、K 2S04、ΚΗ2Ρ04、Κ2ΗΡ0 4、Κ3Ρ04。
7. -种提高淀粉酶热稳定性的方法，其特征在于，是将甘油和钾离子用于提高酶的热 稳定性。
8. 根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述方法是将淀粉酶加入以甘油和钾离子 为活性成分的体系中，混合后的酶液中甘油与酶液的比例为5g至20g每IOOmL,钾离子浓度 为 0·ImM-ImM。
9. 根据权利要求7方法，其特征在于，将酶液加入以甘油和钾离子为活性成分的体系 中，混合后的酶液中酶终浓度为5-20 μ M，甘油与酶液的比例为5g至20g每IOOmL,钾离子 浓度为0. ImM-ImM ;所述酶为淀粉分支酶、中温α -淀粉酶、β -淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、麦芽 四糖生成酶或麦芽六糖生成酶中任 种。
10. 根据权利要求7方法，其特征在于，将淀粉分支酶加入以甘油和钾离子为活性 成分的体系中，混合后的酶液中甘油与酶液的比例为5g至20g每IOOmL,钾离子浓度为 0. lmM-lmM。
【文档编号】C12N9/26GK104212788SQ201410465826
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】顾正彪, 李才明, 李兆丰, 班宵逢, 程力, 洪雁 申请人:江南大学