陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒及制备方法
【专利摘要】本发明提供的一种陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒及制备方法，包括如下试剂：Mastermix反应液；P-mix-1反应液；P-mix-2反应液；DNA分子量标准物；本发明解决了陈旧性生物样本的种属鉴定问题，不仅可以直接应用于刑事案件的侦破工作，维护社会安定，也可以通过对考古遗迹中动物考古学信息的挖掘，来揭示古代人们对食物的选择，狩猎和家畜饲养等重要的经济与文化背景。还可以帮助海关打击野生动物走私活动，保护野生动物资源，另外可以用于鉴定动物的中药材品质，打击假冒伪劣药材。
【专利说明】陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供一种陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒，本发明同时还提供了该陈旧性 动物样本种属鉴定试剂盒的制备方法，属于生物检材的种属鉴定【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 法医物证鉴定实践中，不明来源生物检材的种属鉴定是重要的一个鉴定环节。陈 旧性生物样本的鉴定，成为现阶段法医DNA检验的难题，也制约了许多重要物证的价值。同 时在考古分析、海关稽查以及中药材质量鉴定过程中也常常会遇到对陈旧性生物检材种属 鉴定的需求。
[0003] 传统的种属鉴定方法的普遍存在的不足之处有以下几点：一、某些检测体系缺乏 必需的内对照。单独扩增测mtDNA的编码基因，如cytb基因、12SrRNA基因、5SrRNA基因等 进行种属鉴别时缺乏必需的内对照，因而若检测为阴性结，并不能判定检材为非人类，也有 可能是检材已被破坏，或者是DNA提取不当等原因，在种属鉴定过程中有可能得到假阴性 的结果。二、扩增测序mtDNA的编码基因，检测过程烦琐，测序费用昂贵。三、所用的方法大 多基于新鲜或是保存较好的组织样本，扩增片段普遍在300-1200bp，对大部分陈旧性生物 检材和所有考古样本均不适用。四、多次实验反应会造成耗用模板量过大，使微量、高降解 的陈旧性生物样本无法完成检测。五、种属关系较近的样本无法鉴定。如黄牛和水牛，山羊 和绵羊。
[0004] 目前，国内已经有上百家单位开展了法医DNA检测项目，每年检验各类案件数 十万起，在许多重特大、疑难案件的侦破中发挥了关键性作用，取得了巨大的成功。但是在 现场检材中遗留着许多陈旧性生物样本，仍然没有得到有效的利用，其原因就是没有针对 陈旧性生物样本的DNA鉴定方法。
【发明内容】
[0005] 本发明公开一种陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒，针对陈旧性生物样本的DNA严 重降解的特点，设计以线粒体基因组中的cytb基因和高可变I区为目标序列的小片段扩增 方体系，并首次创建平行复合PCR方法，使种属鉴定结果通过简单的琼脂糖凝胶电泳，即可 根据DNA片段长度来对样本进行判断。构建了一套简捷、高敏感的mtDNA种属鉴定体系，促 进法医DNA检验技术的进步，为刑侦人员提供更多的信息和证据。
[0006] 本发明同时还提供了陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒的制备方法。
[0007] 本发明的技术解决方案如下： 选择mtDNA基因组为检测目标，建立优化的复合扩增体系。其中cytochrome b基因 (细胞色素 b基因，cytb基因）作为mtDNA编码基因，其编码序列区域进化缓慢，相对保守， 因而具有较稳定性，作为反应的内对照片段；以mtDNA高可变I区的变异区为目标区，通过 对Genebank中人和猪、牛、羊、马、狗等常见家养动物以及鹿、猴、熊、虎等野生动物的线粒 体基因组序列进行比对分析，设计2对荧引物，针对高度降解的生物检材，以适合的片段大 小（< 200bp)对不同种属的单一或混合样本进行检测，根据不同动物种属的扩增片段长 度的差异，在同一反应中鉴定一个或是多个具体动物的种属。
[0008] 通过对引物的修订和调整，建立平行复合扩增体系：在这个体系中分为两组平行 进行扩增：第一组将Cytb引物和mtDNA引物放在一组形成Ρ-mix-l进行复合扩增反应；第 二组复合体系将Cytb引物和另一对mtDNA引物结合形成P-mix-2,两组平行进行用于陈旧 性动物种属鉴定。
[0009] 本发明提供的一种陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒，是由以下物质组成： 试剂盒包括如下试剂： ⑴Master mix反应液 ⑵Ρ-mix-l反应液 ⑶P-mix-2反应液 ⑷DNA分子量标准物； 2. 上述陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒的组分特征在于：试剂盒内含有Master mix反应液lml，其组分为：0. IM Tris-HCl缓冲液，pH为8. 2 ;0. 1%牛血清白蛋白； 5mM Mgcl2 ;2mM dNTP ;2U/y L TaqDNA 聚合酶；Ρ-mix-l 反应液 0· Iml,其组分包 括：25uM 引物 A:ACGAAACAGGATCCAACAAC,引物 B:GGTGTAGTTGTCTGGGTCTCC,引物 C: CCATCAACACCCAAAGCTG 和引物 D: CATTTAATGCACGACGTACAT; P-mix-2 反应液 0· Iml,其组 分包括：25uM 引物 A :ACGAAACAGGATCCAACAAC,引物 B:GGTGTAGTTGTCTGGGTCTCC,引物 E :CCCATGCATATAAGCACGTAC 和引物 F : GAGGCATGGTGATTAAGCTC. 3. 本发明同时还提供了陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒的制备方法，包括以下步 骤： ⑴对生物检材进行DNA提取步骤： DNA的提取方法采用先裂解组织样本，随后使用硅胶法提取DNA的策略。具体步骤如 下： ① ·取0. I-Ig动物组织，加入含有0. 5M EDTA，0. 5% SDS，0. 4 g/L蛋白酶K的裂解 液，56°C水浴3小时； ② ·将含有DNA的裂解液500 r/min，离心8 min，取2mL上清液加入到离心超滤管 中，6800 r/min离心3小时，将含有DNA的裂解液浓缩到100 μ L。
[0010] ③.使用硅胶法提取上一步浓缩的裂解液中DNA。4°C保存备用。
[0011] ⑵平行复合扩增体系 ① 准备PCR反应体系1 Master mix 反应液 8. 5 μ L Ρ-mix-l 反应液 IuL 样本DNA模板 2. 5 μ L ② 准备PCR反应体系2 Master mix 反应液 8. 5 μ L P-mix-2 反应液 1 μ L 样本DNA模板 2. 5 μ L 建议加入样本的DNA含量范围在10-20ng/μ L，根据样本量进行稀释或者浓缩。
[0012] (3)将上述PCR体系加到200 μ L体积的PCR管中，轻轻涡旋震荡三次； ⑷将上述PCR反应体系放入PCR自动扩增仪进行DNA扩增反应，反应程序设置为： 95°C初始变性5分钟，94°C热变性30秒，54°C退火30秒，72°C延伸45秒；7个循环， 94°C热变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸45秒；33个循环；72°C终延伸10分钟，最后 4 C保温。
[0013] (5) PCR产物电泳分析 所得的PCR产物均要进行电泳检测，具体方法如下：取5 μ LPCR扩增产物与1 μ L6X加 样缓冲液混合后，加入3%琼脂糖凝胶的加样孔中，电泳电压恒压在90V电泳50分钟，EB染 色。使用凝胶成像分析仪检测。
[0014] 6.根据电泳结果进行样本种属的鉴定 每种动物每个PCR反应均检出两条电泳条带，其中一条为相同片段大小的Cytb基因的 扩增产物片段，将此条带作为反应体系的内对照(见图1)，显示DNA模板的提取质量和PCR 扩增的有效性。另一条带则显示出的扩增产物的长度差异（见图2-3)，比对DNA片段长度 (见下表)。根据2个平行复合扩增体系的结果组合即可判断样本的种属特异性。
[0015] 表1. 10种常见动物在两组复合体系中经过PCR扩增得到的片段长度
【权利要求】
1. 一种陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒，其特征在于是由以下物质组成： ⑴ Master mix 反应液 lml ; ⑵ P-mix-1 反应液 0· lml ; (3) P-mix-2 反应液 0· lml ; ⑷DNA分子量标准物； 其中， Master mix反应液组分为：0. 1M Tris-HCl缓冲液，pH为8. 2 ;0. 1%牛血清白蛋白；5mM Mgcl2 ;2mM dNTP ;2U/ μ L TaqDNA 聚合酶； P-mix-1 反应液组分包括：25uM 的引物 A :ACGAAACAGGATCCAACAAC，引 物 B :GGTGTAGTTGTCTGGGTCTCC，引物 C :CCATCAACACCCAAAGCTG 和引物 D : CATTTAATGCACGACGTACAT ； P-mix-2 反应液组分包括：25uM 的引物 A :ACGAAACAGGATCCAACAAC，引 物 B:GGTGTAGTTGTCTGGGTCTCC，引物 E:CCCATGCATATAAGCACGTAC 和引物 F: GAGGCATGGTGATTAAGCTC ； DNA分子量标准物用于凝胶电泳中双链线状DNA分子量大小的参照。
2. 根据权利要求1所述陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒的制备方法，包括以下步骤： 1) 对生物检材进行DNA提取： ① 取0. Ι-lg动物组织，加入含有0. 5M EDTA，0. 5% SDS，0.4 g/L蛋白酶K的裂解液， 56°C水浴3小时； ② 将含有DNA的裂解液7500 r/min，离心8 min，取2mL上清液加入到离心超滤管中， 6800 r/min离心3小时，将含有DNA的裂解液浓缩到100 μ L ; ③ 使用硅胶法提取上一步浓缩的裂解液中DNA ;4°C保存备用； 2) 平行复合扩增体系 ①准备PCR反应体系1 Master mix 反应液 8. 5 μ L Ρ-mix-l 反应液 1 μ L 样本DNA模板 2. 5 μ L ②准备PCR反应体系2 Master mix 反应液 8. 5 μ L P-mix-2 反应液 1 μ L 样本DNA模板 2. 5 μ L 建议加入样本的DNA含量范围在10-20ng/μ L，根据样本量进行稀释或者浓缩； 3) 将上述PCR体系加到200 μ L体积的PCR管中，轻轻涡旋震荡三次； 4) 将上述PCR反应体系放入PCR自动扩增仪进行DNA扩增反应：95°C初始变性5分钟， 94°C热变性30秒，54°C退火30秒，72°C延伸45秒；7个循环，94°C热变性30秒，50°C退火 30秒，72°C延伸45秒；33个循环；72°C终延伸10分钟，最后4°C保温； 5. PCR产物电泳分析 取5μ LPCR扩增产物与1 μ L6X加样缓冲液混合后，加入3 %琼脂糖凝胶的加样孔中， 电泳电压恒压在90V电泳50分钟，ΕΒ染色。
【文档编号】C12Q1/68GK104263821SQ201410465741
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】崔银秋, 赵洪玉, 张雪梅, 宁超 申请人:吉林大学