一种检测口蹄疫a型病毒的试剂盒及制备和使用方法

一种检测口蹄疫a型病毒的试剂盒及制备和使用方法
【专利摘要】本发明公开一种用于检测口蹄疫A型病毒的试剂盒，及试剂盒制备方法和这种试剂盒的非疾病诊断目的的使用方法。本发明的扩增口蹄疫A型病毒的引物的基因序列有四条；本发明的检测口蹄疫A型病毒的试剂盒内包括有前述基因序列的四条引物。相关的实验表明，本发明的可特异性快速扩增口蹄疫A型病毒的核酸，通过核酸电泳检测到特异性条带，同时具有特异性。相关的实验提示本发明的序列可在制备快速鉴别口蹄疫A型病毒的GeXP诊断试剂盒中的应用，并在口蹄疫病毒流行病学研究中应用。
【专利说明】-种检测口蹄疫A型病毒的试剂盒及制备和使用方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测口蹄疫A型病毒的试剂盒，及试剂盒制备方法和这种试 剂盒的非疾病诊断目的的使用方法。

【背景技术】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的动物急性、烈性传染病，主要危害猪、牛、羊痘偶蹄动物，发病 率极高，造成了巨大的政治、经济损失，因此被世界卫生组织（OIE)列为A类传染病的首位。 FMDV可以分为7个血清型，即A型、0型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型和SAT 3型， 每个血清又有许多不同的亚型，且各血清型之间没有交叉性免疫，同一血清型的各亚型之 间仅有部分交叉免疫。
[0003] 口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的动物急性、烈性传染病，主要危害猪、牛、羊痘偶蹄动物，发病 率极高，造成了巨大的政治、经济损失，因此被世界卫生组织（OIE)列为A类传染病的首位。 FMDV可以分为7个血清型，即A型、0型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型和SAT 3型， 每个血清又有许多不同的亚型，且各血清型之间没有交叉性免疫，同一血清型的各亚型之 间仅有部分交叉免疫。
[0004] 口蹄疫病毒的分型鉴别诊断一直是研究的热点。研究表明，口蹄疫病毒的A、0、 Asia 1三种血清型的RNA序列同源性约为70%左右，然而其编码结构蛋白的Pl区域的差异 比较好，该区域的核苷酸序列也常常被用来进行口蹄疫病毒的分型及进化分析。在病毒的 这些基因中，VPl蛋白参与病毒的吸附、入侵、免疫反应，并且与病毒的血清型特异性有关。 因此VPl的基因序列通常被用来进行FMDV不同毒株之间的亲缘关系分析，从而研究口蹄 疫的分子流行病学规律。准确鉴定分离株种属和弄清其来源将有助于口蹄疫的流行病学分 析，具有重要意义。
[0005] 由于RT-PCR快速，灵敏和可靠性的优点，该方法已被广泛地用于口蹄疫诊断。近 年来各种RT-PCR检测方法已用于早期上皮细胞，细胞培养分离和其组织中口蹄疫病毒RNA 的检测（Meyer RF, et al.，1991)。Rodriguez等首次可通过RT-PCR对口蹄疫病毒0型、 A型和C型进行分型检测（Rodriguez A, et al. ,1992)。自此以后不同血清型特异性 引物RT-PCR方法已被用于口蹄疫病毒7个血清型份分型检测（Callens, et al.，1997; Vangrysperre, et al.，1996)。这些检测引物位于口蹄疫病毒基因组的不同位置，包括5' 非编码区、开放阅读框和3'端非编码区。为了提高RT-PCR诊断灵敏度，多组引物结合的多 重检测也被用于口蹄疫的检测（Giridharan P，et al.，2005; Bao H，et al.，2008)，但是 这些RT-PCR方法的灵敏度依然有限，若前期再结合ELISA方法一起使用必然会使该过程更 加耗时费力。
[0006] 最近，实时荧光定量RT-PCR方法已被用于口蹄疫病毒的检测，该方法不需要PCR 后期处理(例如凝胶分析)且通过应信号来直接监视目标cDNA的扩增。TaqMan实验的检测 效果同抗原结合ELISA的病毒分离实验一样（Reid SM, etal. ,2003)。目前，两种不同的 实时荧光定量RT-PCR TaqMan实验已普遍使用，一种针对5'非编码区的内部核糖体进入位 点（IRES) (Reid SM, et al.，2002)和第二种针对3D (RNA聚合酶）的编码序列。实时荧 光定量RT-PCR方法的速度和准确性可以从样品核酸提取到实验建立的计算机操作的偶联 进一步提高。这使得该检测适合于主要指示病例诊断和在持续疫情中的检测。实时/定量 RT-PCR试验目前在许多发达国家作为一种口蹄疫病毒诊断和定量的常规测试。但是，这些 实验不是专门设计用于的区分口蹄疫病毒血清型。已经证明5'端非编码区检测在A血清 型病毒的检测中更敏感，而在3D检测试验对检测SAT病毒具有更高的灵敏度（King DP, et al.，2006)。另外，由于探针靶向区域的核苷酸错配，这些检测方法不能检测少量的FMDVs。 因此，任何一种单独的检测方法不能100%的检测FMDV。最近，Tam等报道了用于口蹄疫病 毒检测和病毒分型荧光多重rRT-PCR检测方法，该方法具有更高的检测灵敏度，但却不能 区分某些血清型之间的交叉反应性（Tam S，et al.，2009)。
[0007] rRT-PCR便携式设备使得FMDV野外样品的检测成为可能，然而这种设备比较昂 贵、比较脆弱且精密度要求比较高。因此，其他的方法，如环介导扩增的方法被用来进行野 外样品的检测。LAMP在一个恒定的温度扩增特异性核苷酸序列，因此不需要热循环仪。该 方法基于DNA序列通过一自动循环链置换反应扩增的原理，使用一组两个特别设计的内引 物和两个外引物和具有链置换高活性的DNA聚合酶进行该测定法（et al.，2000)。引物在 初始阶段识别6个独立的靶序列和在LAMP反应的后期阶段识别4个独立的序列，使用标准 的水浴或加热块进行该反应少于一个小时，然后对结果用肉眼进行可视化观察。其优点为 其简单操作，反应快速且结果直观，这使得该方法已被许多疾病流行国家进行野外样品检 测。已有口蹄疫病毒高通量的RT-LAMP的建立，然而该方法由于容易污染造成假阳性，就尚 未得广范的认可（Dukes JP, et al.，2006)。
[0008] ELISA和RT-PCR结合的口蹄疫检测方法具有很高的可靠性和准确性，但样品从采 样点到实验室的运输问题成为口蹄疫病毒早期诊断的最大障碍。因此，在疑似疫情点急需 一种可以用于疾病快速诊断和特异性检测的方法。由Reid等人建立一种基于单克隆抗体 的口蹄疫层析试纸条技术（Reid SM, et al.，2001)。该试纸条检测上皮悬浮液测试中的口 蹄疫病毒抗原灵敏性与常规抗原ELISA灵敏性一样，且对口蹄疫病毒血清型0, A，C和Asia 1在细胞培养上清有着100%等效的敏感性，但是却不能够对这些血清型进行区分。因此， 急需一种灵敏度高的能够特异性区分不同FMDV型别的高通量的检测方法。
[0009] 研究表明，口蹄疫病毒的A、0、Asia 1三种血清型的RNA序列同源性约为70%左 右，然而其编码结构蛋白的Pl区域的差异比较好，该区域的核苷酸序列也常常被用来进行 口蹄疫病毒的分型及进化分析。在病毒的这些基因中，VPl蛋白参与病毒的吸附、入侵、免 疫反应，并且与病毒的血清型特异性有关。因此VPl的基因序列通常被用来进行FMDV不同 毒株之间的亲缘关系分析，从而研究口蹄疫的分子流行病学规律。准确鉴定分离株种属和 弄清其来源将有助于口蹄疫的流行病学分析，具有重要意义。根据口蹄疫病毒VPl基因组 序列构建进化树分析发现，A型有10个亚型（I - X);0型也有10个亚型，即欧洲-南美洲 型（Euro-SA)、中东-南非型（ME-SA)、东南亚型（SEA)、中国型（CHY)、西非型（WA)、东非1型 (EA-1)、东非 2 型（EA-2)、东非 3 型（EA-3)、印尼 1 型（ISA-I)和印尼 2 型（ISA-2);Asia 1 有6个亚型（I -VI)。此外，VPl基因也常被用来进行A、0、Asia 1的分型检测。因此，本 发明选择口蹄疫病毒的A型VPl序列作为靶基因的区域，根据GeXP多重PCR检测体系引物 的要求设计口蹄疫病毒A型的特异性引物。


【发明内容】

[0010] 本发明提供一种可克服现有技术不足的、具有快速、高灵敏度、高通量的、可用于 检测口蹄疫A型病毒的扩增口蹄疫A型病毒的引物，由这种引物构成的检测试剂盒，这种试 剂盒的制备方法和非疾病检测的这种试剂盒使用方法。
[0011] 本发明的扩增口蹄疫A型病毒的引物的基因序列为SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、 SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4;本发明的检测口蹄疫A型病毒的试剂盒内包括有前述基因序 列为 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 的四条引物，其中引物 SEQ ID No. 3的5'端添加有Cy5荧光标签。
[0012] 本发明的试剂盒非疾病诊断目的的使用方法是：首先以A型病毒的RNA为模板，用 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 引物进行扩增，再对 PCR 产物的 进行毛细管电泳分析，根据毛细管电泳信号分析图上241bp处是否出现峰值，且信号大于 2000判定被检样品的阴阳性。
[0013] 相关的实验表明，本发明的序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 (即FMDV-A-F和 FMDV-A-R)可特异性快速扩增口蹄疫A型病毒的核酸，通过核酸电泳检测到特异性条带，但 同等条件下不能扩增口蹄疫〇型病毒、口蹄疫病毒Asia 1病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡 病病毒的核酸。
[0014] 相关的实验提示本发明的序列可在制备快速鉴别口蹄疫A型病毒的GeXP诊断试 剂盒中的应用，并在口蹄疫病毒流行病学研究中应用。

【专利附图】

【附图说明】
[0015] 图1为口蹄疫A型病毒引物特异性验证的核酸电泳检测结果。其中口蹄疫A型病 毒引物可以特异性地扩增出FMDV-A型的基因组片段，而口蹄疫Asia 1型病毒、口蹄疫0型 病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒均无特异性条带产生，说明口蹄疫A型病毒的GeXP 引物的特异性非常高。
[0016] 图2为口蹄疫A型病毒引物PCR灵敏性验证的核酸电泳检测结果。其中M为DL2000 Marker ;1为IO9个拷贝；2为IO8个拷贝；3为IO7个拷贝；4为IO 6个拷贝；5为IO5个拷贝； 6为IO4个拷贝；7为IO3个拷贝；8为IO 2个拷贝；9为10个拷贝。由图可见109~104个拷 贝的模板均由特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。从图可以看出本发明所 设计的口蹄疫A型病毒GeXP引物在58°C条件下PCR反应最少可以检出IO 4个拷贝的模板。
[0017] 图3为口蹄疫A型病毒GeXP引物的GeXP-PCR特异性检测结果。从图可以看出口 蹄疫病毒A型241bp处出现峰值，且信号大于2000时认为是阳性结果。同时用口蹄疫A型 病毒的引物对口蹄疫〇型病毒、口蹄疫Asia 1型病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒基 因组进行GeXP反应时没有任何信号峰出现，这说明口蹄疫A型病毒的GeXP引物具有非常 好的特异性。
[0018] 图4至图7分别为不同拷贝的模板口蹄疫A型病毒用本发明的GeXP引物的扩增 后用GeXP-PCR检测的灵敏性检测结果。其中图4为10 4C〇pieS，图5为103C〇pieS，图6为 102copies，图7为lOcopies。结果显不104copies/ML?IO 2 copies/ML的模板均可以检测到 特异性的峰值，随着模板量的检测，峰值的信号强度也不断的减弱，在10 copies/ML时特异 性的信号峰值不足2000。从图中可以看出本发明中所设计的口蹄疫A型病毒GeXP引物在 本发明检测体系中可以检测出l〇 2copies/ML的模板。

【具体实施方式】
[0019] 以下结合实施例对本发明进行详细解说. 1.序列的制备 根据GeXP引物设计要求和NCBI公布的FMDV-A型的基因组，选择保守区域设计特异性 引物，并通过添加通用引物形成特异性嵌合引物，而通用引物序列属于非生物源性的核苷 酸序列，此外合成通用引物序列，并在上游通用引物的5 '端添加Cy5荧光标签。本发明的 可特异性扩增口蹄疫A型病毒核酸的引物：AGGTGACACTATAGAATAGGGTGATCTAGGGTCTCTCGC， 在本发明中被命名为 FMDV-A-F ;GTACGACTCACTATAGGGACAGGAGCTGCITTGCAGGTGCAAT，在本 发明中被命名为FMDV-A-R。用于本发明的通用引物：Cy5 AGGTGACACTATAGAATA，在本发明 中被命名为UWD-F ;GTACGACTCACTATAGGGA，本发明中被命名为UEV-R。
[0020] 2.病毒基因组提取 单层细胞长至80%以上融合后，接种病毒，37°C孵育30min后弃去毒液。加入细胞维持 液，37°C 5% CO2培养，定期观察细胞病变（CPE)，待90%以上细胞出现CPE后收毒。将病毒 反复冻融3次，置-20°C冰箱保存备用。使用TaKaRa公司DNA提取试剂盒提取细胞毒株中 的 RNA。
[0021] 3. FMDV-A引物特异性验证 以提取纯化的病毒RNA为模板进行扩增，实验体系如下：

【权利要求】
1. 用于检测口蹄疫A型病毒的引物，其特征在于引物基因序列为SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4。
2. -种检测口蹄疫A型病毒的试剂盒，其特征在于试剂盒内包括有基因序列为SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 的四条引物，其中引物 SEQ ID No. 3 的 5' 端添加有Cy5荧光标签。
3. 权利要求2所述试剂盒非疾病诊断目的的使用方法，其特征在于：首先以A型病毒 的 RNA 为模板，用 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 引物进行扩增， 再对PCR产物的进行毛细管电泳分析，根据毛细管电泳信号分析图上241bp处是否出现峰 值，且信号大于2000判定被检样品的阴阳性。
【文档编号】C12Q1/70GK104212916SQ201410465735
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】张强, 卢昌, 赵志荀, 吴国华, 颜新敏, 李应国, 岳华, 周晓黎, 李健, 朱海霞, 代雪玲, 田波, 芦晓立, 高顺平, 王曼 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所