一种那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法
【专利摘要】本发明提供了一种那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法，利用新型ARTP育种系统诱变那西肽活跃链霉菌，通过响应面法优化24深孔板发酵条件，并且利用24深孔板培养法建立高通量筛选突变体的方法，获得高产稳产那西肽突变株。本发明验证24深孔板效价及摇瓶效价之间的相关性，使其筛选方法非常准确快速，同时与传统摇瓶发酵筛选相比，24深孔板法能显著提高那西肽高产菌株的筛选效率。
【专利说明】一种那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物诱变育种、发酵工程领域，尤其涉及一种那西肽活跃链霉菌高 产菌株的高通量筛选方法。
【背景技术】
[0002] 那西肽（Nosih印tide)是种含硫多肽类抗生素，又称诺西肽，主要有活跃链霉菌 产生。它具有促进动物的生长、提高饲料利用率、增强动物的抗病能力，且在动物体内无残 留，对人畜安全，对环境污染小等优点，是一种理想的饲用抗生素换代品。
[0003] 目前，在欧盟、日本、台湾等地区，那西肽作为唯一饲用抗生素在饲料添加。国内的 科研工作者在那西肽活跃链霉菌种的选育及发酵工艺优化等方面做了大量的研究，使那西 肽的生产技术得到很大提高。但目前工业发酵单位总体水平较低，生产菌种的性能仍有很 大的提升空间。
[0004] 利用新型ARTP育种方法诱变那西肽活跃链霉菌可以快速有效地获得那西肽活跃 链霉菌突变库。近年培养基优化方法已由传统的非统计优化法逐渐转向统计优化法，即通 过实验设计与结果分析，建立相关的数学模型，再求解模型的最优值并进行校验。其中响应 面优化法在生物医药领域取得了一系列良好的效果。高通量筛选是获得高产突变株的关键 步骤。
[0005] 目前关于高产那西肽活跃链霉菌株的筛选方法通常是随机筛选法或抗性平板筛 选法，然后采用摇瓶逐个进行发酵培养并测定菌株的目标产量，该方法筛选工作量大、周期 长、效率低及成本高。
【发明内容】
[0006] 针对目前筛选那西肽活跃链霉菌高产菌株的方法耗时、费力、低效率、成本较高， 本发明通过提供一种那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法，可以有效地解决上述 存在的问题；同时优化24深孔板的发酵条件，验证24深孔板效价及摇瓶效价之间的相关 性。
[0007] 本发明是这样实现的，一种那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法，包括 以下步骤：
[0008] (1)采用常压室温等离子体处理那西肽活跃链霉菌150s ;
[0009] (2)将诱变后待筛选的那西肽活跃链霉菌稀释涂布于固体平板，在37±0. 5°C下 培养72h ;
[0010] (3)用牙签挑取诱变后的单菌落孢子接入每孔装有4?6mL固体培养基的24深孔 板中进行固体培养，同时--对应地用接种铲挖0. 2?0. 3cm2的菌体接入装有2. 55mL种 子培养基的24深孔板进行液体培养；种子培养结束分别转接装有0. 93mL发酵培养基的24 深孔板，发酵培养结束测效价，对应的固体培养孔板菌落作保存，液体培养28 ±0. 5 °C，转速 260r/min，种子培养 40h，发酵 120h，固体培养 37±0. 5°C，72h ;
[0011] (4)接种24深孔板固体培养的菌落于斜面试管培养好后用于摇瓶发酵，测效价。
[0012] 优选地，在步骤（3)中，种子培养基（％)为：豆饼粉2.0,葡萄糖3.0,玉米浆2.0， MgSO4 · 7H20 0· 05,（NH4)2S04 0· 3,轻质碳酸钙 0· 5,115°C灭菌 25min。
[0013] 优选地，在步骤（3)中，所述固体培养基（％)为：可溶性淀粉2,豆饼粉0· 5, KNO3 0· 1，NaCl 0· 05, MgSO4 · 7H20 0· 05, K2HPO4 · 3H20 0· 05, FeSO4 · 7H20 0· 001，琼脂 2. 0-3. 0， 121°C灭菌20min ;步骤（3)中所述的种子培养基（％ ):豆饼粉2.0,葡萄糖3.0,玉米浆 2. 0, MgSO4 · 7H20 0· 05,（NH4)2SO4 0· 3,轻质碳酸钙 0· 5,115°C灭菌 25min。
[0014] 优选地，在步骤⑶中，所述发酵培养基（％)为：淀粉7.0,淀粉酶（淀粉的 〇· 1%)，葡萄糖 0.5,酵母粉 0.2,黄豆粉（含油）4.0,（NH4)2SO4 0· I，KN03 0.05，NaCl 0.4， 轻质碳酸钙〇. 4,115°C灭菌25min。
[0015] 本发明克服现有技术的不足，提供一种那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选 方法，利用新型ARTP育种系统诱变那西肽活跃链霉菌，通过响应面法优化24深孔板发酵条 件，并且利用24深孔板培养法建立高通量筛选突变体的方法，获得高产稳定的那西肽突变 株。
[0016] 相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：利用新型ARTP育种方 法诱变那西肽活跃链霉菌，利用多孔板培养法建立高通量筛选突变体的方法，该方法验证 24深孔板效价及摇瓶效价之间的相关性，使其筛选方法非常准确快速，同时与传统摇瓶发 酵筛选相比，24深孔板法能显著提高那西肽高产菌株的筛选效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1是本发明实施例1中种子培养基装液量对24深孔板培养效价的影响；
[0018] 图2本发明实施例2中发酵培养基装液量对24深孔板培养效价的影响；
[0019] 图3本发明实施例3中发酵时间对24深孔板培养效价的影响；
[0020] 图4是本发明实施例5中突变株24深孔板效价与摇瓶效价之间的相关性；
[0021] 图5是本发明实施例6中突变株的相对效价；
[0022] 图6本发明实施例7中孔板发酵后分光光度计与酶标仪测孔板效价的相关性；
[0023] 图7本发明实施例8中摇瓶发酵后分光光度计与酶标仪测摇瓶效价的相关性。
【具体实施方式】
[0024] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0025] 菌株：那西肽产生菌活跃链霉菌（Streptomyces actuosu)NXT-NAlO菌株由安徽 工程大学实验室保藏，该菌株已在文章"响应面法优化那西肽发酵条件"（中国抗生素杂 志，2013, 38(6) :430-433)中公开。
[0026] 仪器及试剂：ZHWY-C2112B恒温恒湿培养箱：上海智城分析仪器制造公司； HTS-T008恒温振荡器：上海甘薇生物技术有限公司；超净台：苏州净化设备有限公司， Sorvall ST 16R离心机：赛默飞世尔，酶标仪：赛默飞世尔；ARTP育种机：北京思清源生物 科技有限公司。化学药品均为国产分析纯。
[0027] 那西肽的含量测定：723分光光度计比色法、96孔板酶标仪比色法。
[0028] 实施例1 24深孔板种子培养基装液量对那西肽效价的影响
[0029] 种子培养基分别选取初始装液量为0· 7mL、l. 0mL、L 3mL、l. 6mL、l. 9mL、2. 2mL、 2. 5mL、2. 8mL、3. lmL，比较其对24深孔板中那西肽产量的影响，结果如图I所示。由图I可 看出，当初始装液量在2. 5mL时那西肽的产量最高。
[0030] 实施例2 24深孔板发酵培养基装液量对那西肽效价的影响
[0031] 按质量百分比（％ )将淀粉7. 0,淀粉酶（淀粉的0· 1 % )，葡萄糖0· 5,酵母粉0· 2， 黄豆粉（含油）4.0,（NH4)2SO4 0·1，ΚΝ03 0.05，NaCl 0.4,轻质碳酸钙 0.4,115°C灭菌 25min 得到发酵培养基。
[0032] 分别在 0· 7mL、I. OmL、I. 3mL、I. 6mL、I. 9mL、2. 2mL、2. 5mL、2. 8mL、3. lmL、3. 4mL 的 发酵培养基装液量下进行发酵试验，比较其对那西肽产量的影响，结果如图2所示。当24 深孔板中发酵培养基在I. OmL的条件下24深孔板发酵的产量最高。
[0033] 实施例3发酵时间对24深孔板培养效价的影响
[0034] 选择不同的发酵时间测定那西肽的产量，结果如图3所示。由图3可以看出，在发 酵前期，随着发酵时间的延长那西肽的产量在增大，但发酵120h后其产量有所下降，因此， 发酵时间选择120h为宜。
[0035] 实施例4响应面模型的建立及方差分析
[0036] 在单因素实验结果的基础上设计Box-Behnken中心组合实验，以24深孔板发酵的 那西肽效价为响应值，对种子培养基装液量（A)、发酵培养基装液量（B)和发酵时间（C)设 计响应面分析试验。结果如表1所示：
[0037] 表I Box-Behnken实验设计与结果
[0038]
【权利要求】
1. 一种那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 采用常压室温等离子体处理那西肽活跃链霉菌150s ; (2) 将诱变后待筛选的那西肽活跃链霉菌稀释涂布于固体平板，在37±0.5°C下培养 72h ； (3) 用牙签挑取诱变后的单菌落孢子接入每孔装有4?6mL固体培养基的24深孔板 中进行固体培养，同时--对应地用接种铲挖0. 2?0. 3cm2的菌体接入装有2. 55mL种子 培养基的24深孔板进行液体培养；种子培养结束分别转接装有0. 93mL发酵培养基的24 深孔板，发酵培养结束测效价，对应的固体培养孔板菌落作保存，液体培养28 ±0. 5 °C，转速 260r/min，种子培养 40h，发酵 120h，固体培养 37±0. 5°C，72h ; (4) 接种24深孔板固体培养的菌落于斜面试管培养好后用于摇瓶发酵，测效价。
2. 如权利要求1所述的那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法，其特征在于， 在步骤（3)中，种子培养基（％)为：豆饼粉2. 0,葡萄糖3. 0,玉米浆2. 0，MgS04*7H20 0. 05， (NH4)2SO4 0? 3,轻质碳酸钙 0? 5,115°C灭菌 25min。
3. 如权利要求2所述的那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法，其特征在于， 在步骤（3)中，所述固体培养基（％ )为：可溶性淀粉2,豆饼粉0.5，KN03 0? l，NaCl 0.05， MgS04.7H20 0.05 ,K2HPO4 .3H20 0.05 ,FeSO4 .7H20 0.001，琼脂 2. 0-3.0,121 °C 灭菌 20min; 步骤（3)中所述的种子培养基（％):豆饼粉2.0,葡萄糖3.0,玉米浆2.0, MgSO4 ? 7H20 0.05,（NH4)2SO4 0.3,轻质碳酸钙 0.5,115°C灭菌 25min。
4. 如权利要求3所述的那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法，其特征在于， 在步骤（3)中，所述发酵培养基（％ )为：淀粉7. 0,淀粉酶（淀粉的0. 1 % )，葡萄糖0. 5,酵 母粉 0.2,黄豆粉（含油）4.0,（NH4)2SO4 0. 1，KNO3 0.05, NaCl 0.4,轻质碳酸钙 0.4,115°C 灭菌25min。
【文档编号】C12R1/46GK104313109SQ201410513049
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】薛正莲, 周扬, 秦艳飞, 赵世光, 王洲 申请人:安徽工程大学