鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其引物组的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。实验证明，本发明具有检测时间短、检测敏感性高且特异性强的优点，可实现同时检测和鉴别鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒两种病原体，并对其相应病原含量进行定量，因而可用于鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此本发明对鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的防治有重要意义。
【专利说明】鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR 检测试剂盒及其引物组
【技术领域】
[0001] 本发明属于RT-PCR检测【技术领域】，尤其涉及一种鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病 毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其引物组。
【背景技术】
[0002] 鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS)和禽呼肠孤病毒（Avian reovirus， ARV)是禽类重要的病原体之一，可以引起多种综合症，给养鸡业造成巨大的经济损失。鸡滑 液囊支原体主要引起鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽等的一种以关节渗出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜 炎为特征的急性或慢性传染性疾病，在鸡群中普遍存在，主要侵害商品肉鸡、蛋鸡或种鸡。 禽呼肠孤病毒是呼肠孤病毒科的RNA病毒，主要危害鸡和火鸡，可引起肠道疾病、慢性呼吸 疾病、心肌炎、关节炎/矮小综合症、营养不良综合症等。鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒 的混合感染在全球鸡群中普遍存在，并且导致鸡只出现严重的免疫抑制、抑郁、生长发育迟 缓，降低产蛋量、蛋品质以及孵化率和饲料转化率，降低屠宰时胴体质量，使屠体废弃率升 高等。鉴别、控制和清除这些病原体依赖于准确和及时对感染群做出诊断。高度敏感、准确、 快速有效的诊断方法对于这些禽病在鸡群中的有效监测和防控是必须的。因此，迫切需要 建立一种快速敏感的鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的检测技术，尤其在感染早期若能检 测出这些病原体，将为这些疾病的有效防控争取宝贵时间。目前，这两种病原体的传统检测 方法有病原培养分离、血清学监测等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等 缺点，在实际应用中具有一定的局限性。
[0003] 荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现 多重反应和实时性好等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时 间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速 检测。多重荧光PCR采用多对弓I物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。但是， 建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要 保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检 测通道。目前，还未见有应用多重荧光定量PCR技术对鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒进 行检测和诊断的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种检测时间短、灵敏度高和特异性强的鸡滑液 囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其引物组，以实现同时检 测并定量鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒两种病原体。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病 毒的二重荧光定量RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和 4,它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4和5的碱基序列。
[0006] 鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物 组和探针组；引物组有引物1至4,它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4和 5的喊基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 3和6的喊基序 列。
[0007] 探针A的5'端标记有报告荧光染料R0X，3'端标记有淬灭荧光染料Eclipse ;探 针B的5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记有淬灭荧光染料Eclipse。
[0008] 弓丨物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为1 :1 :1 :1 :1 :1。
[0009] 该试剂盒含有以下试剂：
[0010] A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B ;
[0011] B液：MS+ARV模板，作为阳性对照；
[0012] C液：灭菌蒸馏水，作为阴性对照。
[0013] A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0.3μΜ，引物3、引物4、探针B终浓度均 为 0· 3 μ Μ。
[0014] 针对目前缺乏对鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒同时进行检测和诊断的有效可 靠的技术，发明人研究筛选了两套特异性的探针和引物，并通过进行不同浓度的配比，获得 最佳引物和探针的浓度组合，据此建立了鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量 RT-PCR的检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，本发明具有如下优点：
[0015] 本发明的实验证明，本发明的引物和方法具有如下优点：
[0016] 1)检测时间短
[0017] 应用本发明可实现一管二检的目的，并且反转录和PCR -步完成，仅需约30分钟， 并且反应结果可以直接通过电脑观察，而常规的RT-PCR方法起码需要3. 5小时来完成扩增 反应，然后还得花2小时进行凝胶电泳来观察结果；
[0018] 2)检测敏感性高且特异性强
[0019] 当鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒同时存在时，本发明对其检测的CT值与单个 病毒检测的CT值比较，结果基本一样，并未影响对鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的检出 及检出的敏感性。另外，利用本发明还可对样品中相应病原含量进行定量，并且检测敏感性 非常高，均能检测到10个拷贝的鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒，比常规PCR方法敏感性 高100倍，因而可用于鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒疫苗和药物疗效的评估，以及其致 病机理等方面的研究。因此，本发明对鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的防治有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1是荧光定量RT-PCR检测鸡滑液囊支原体的敏感性（R0X通道）结果图，图中： 1?8分别为IX IO8?IX IO1拷贝/μ 1，9空白对照（为灭菌蒸馏水）。
[0021] 图2是荧光定量RT-PCR检测鸡滑液囊支原体的敏感性（R0X通道）的标准曲线。
[0022] 图3是荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的敏感性（FAM通道）结果图，图中： 1?8分别为IX IO8?IX IO1拷贝/μ 1，9空白对照（为灭菌蒸馏水）。
[0023] 图4是荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的敏感性（FAM通道）的标准曲线。
[0024] 图5是荧光定量RT-PCR检测鸡滑液囊支原体的特异性（R0X通道）结果图，图中： 1鸡滑液囊支原体+禽呼肠孤病毒，2鸡滑液囊支原体，3禽呼肠孤病毒，4传染性支气管 炎病毒，5鸡传染性喉支气管炎病毒，6新城疫病毒，7 H9亚型禽流感病毒，8鸡毒支原体 S6株，9鸡毒支原体K-2221株，10鸡依阿华支原体，11火鸡支原体，12 dH20。
[0025] 图6是荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的特异性（FAM通道）结果图，图中：1 鸡滑液囊支原体+禽呼肠孤病毒，2鸡滑液囊支原体，3禽呼肠孤病毒，4传染性支气管炎 病毒，5鸡传染性喉支气管炎病毒，6新城疫病毒，7 H9亚型禽流感病毒，8鸡毒支原体S6 株，9鸡毒支原体K-2221株，10鸡依阿华支原体，11火鸡支原体，12 dH20。
[0026] 图7是荧光定量RT-PCR检测鸡滑液囊支原体的批内重复性（R0X通道）结果图， 图中：1_3分别为第一天、第四天和第七天；4.空白对照。
[0027] 图8是荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的批内重复性（FAM通道）结果图，图 中：1_3分别为第一天、第四天和第七天；4.空白对照。
【具体实施方式】
[0028] 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂 等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：
[0029] Lightcycler2. 0荧光定量PCR仪（Roche) ;DNA片断回收试剂盒和质粒小量提取 试剂盒均购自BioDev公司；pMD18_T试剂盒和Premix ExTaq (Probe qPCR)试剂盒均购自 大连宝生物公司；M-MLV体外转录试剂盒和TRizol RNA提取试剂均购自Invitrogen公司。
[0030] 禽呼肠孤病毒（简称为ARV)记载在"用反转录聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒的 研究"，中国预防兽医学报，1999, 21 (5) :365-367,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获 得；
[0031] 鸡滑液囊支原体（简称为MS)记载在"应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、 鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究"，畜牧与兽医，2000, 32 (5) : 4-6,公众可从广西 壮族自治区兽医研究所获得；
[0032] 鸡新城疫病毒记载在"用反转录聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒的研究"，中国预 防兽医学报，1999, 21 (5) :365-367,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
[0033] 传染性支气管炎病毒记载在"应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液 囊支原体和禽衣阿华支原体的研究"，畜牧与兽医，2000, 32 (5) : 4-6,公众可从广西壮族自 治区兽医研究所获得；
[0034] 鸡传染性喉气管炎病毒记载在"应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑 液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究"，畜牧与兽医，2000, 32(5) :4-6,公众可从广西壮族 自治区兽医研究所获得；
[0035] H9亚型禽流感病毒记载在"多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流 感病毒方法的建立"，中国人兽共患病学报，2006,（09) :858-860,公众可从广西壮族自治区 兽医研究所获得；
[0036] 鸡毒支原体S6株记载在"应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支 原体和禽衣阿华支原体的研究"，畜牧与兽医，2000, 32 (5) : 4-6,公众可从广西壮族自治区 兽医研究所获得；
[0037] 鸡毒支原体K-2221株记载在"应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液 囊支原体和禽衣阿华支原体的研究"，畜牧与兽医，2000, 32 (5) : 4-6,公众可从广西壮族自 治区兽医研究所获得；
[0038] 火鸡支原体记载在"应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体 和禽衣阿华支原体的研究"，畜牧与兽医，2000, 32 (5) :4-6,公众可从广西壮族自治区兽医 研究所获得；
[0039] 禽衣阿华支原体记载在"应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支 原体和禽衣阿华支原体的研究"，畜牧与兽医，2000, 32 (5) :4-6,公众可从广西壮族自治区 兽医研究所获得。
[0040] 实施例1、引物与Taqman探针的设计与合成
[0041 ] 根据GenBank中鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的保守序列，采用Primer Express 3.0软件，设计了多套探针和引物，通过分析其引物之间的二聚体，选定两对特异 性引物和两条Taqmam探针（表1)。
[0042] 表1引物和TaqMan探针序列（5' -3'）
【权利要求】
1. 鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测引物组，其特征在于 包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4,它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 1和 2、SEQ. ID. No. 4和5的喊基序列。
2. -种鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征 在于包括引物组和探针组；引物组有引物1至4,它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、 SEQ. ID. No. 4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 3 和6的碱基序列。
3. 根据权利要求2所述的鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检 测试剂盒，其特征在于：所述探针A的5'端标记有报告荧光染料R0X，3'端标记有淬灭荧 光染料Eclipse ;所述探针B的5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记有淬灭荧光染料 Eclipse。
4. 根据权利要求2所述的鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检 测试剂盒，其特征在于：所述引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为1 : 1 ： 1 ： 1 ： 1 ： 1 〇
5. 根据权利要求4所述的鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检 测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂： A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B ; B液：MS+ARV模板，作为阳性对照； C液：灭菌蒸馏水，作为阴性对照。
6. 根据权利要求5所述的鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检 测试剂盒，其特征在于：所述A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0. 3 μ M，引物3、引物 4、探针Β终浓度均为0. 3 μ Μ。
【文档编号】C12R1/35GK104263858SQ201410522610
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】谢芝勋, 黄莉, 谢丽基, 邓显文, 罗思思, 谢志勤, 庞耀珊, 刘加波 申请人:广西壮族自治区兽医研究所