一种基于TALEN 介导的Sp110 巨噬细胞特异打靶载体及重组细胞的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于TALEN介导的Sp110巨噬细胞特异打靶载体及重组细胞，对牛胎儿成纤维细胞进行基因打靶获得的M-S位点定点敲入Sp110基因的牛胎儿成纤维细胞。利用打靶载体中的MSR1启动子，使得定点敲入的Sp110在且仅在牛的外周血巨噬细胞中正常转录和表达。本发明利用电穿孔的方法将打靶载体和TALEN位点特异性核酸切割酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，通过PCR和Southern Blotting筛选和验证获得了打靶的阳性克隆细胞。以该阳性克隆细胞为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚胎。将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫中，最终生产成活的转基因克隆牛。
【专利说明】-种基于TALEN介导的Sp110巨噬细胞特异打靶载体及 重组细胞
【技术领域】
[0001] 本发明属于转基因克隆动物【技术领域】，涉及一种基于TALEN介导的SpllO巨噬细 胞特异打祀载体及重组细胞。
【背景技术】
[0002] 牛结核病是由牛分支杆菌（Mycobacterium bovis, M. bovis)和结核分支杆菌 (Mycobacterium tuberculosis, MTB)等结核分支杆菌复合群引起的一种慢性消耗性传染 疾病，其主要表现为牛生产力明显下降、乳房炎和结核性胸膜炎等症状。牛结核的传播和流 行严重影响了地区农业经济的发展，特别是对动物及动物产品的国际贸易有着重大的影响 (Biet et al.，2005)。
[0003] SPllO核体蛋白基因 （SPllOnuclear body protein)是新近发现的介导结核分枝 杆菌天然免疫的一个基因，该基因能够限制结核分枝杆菌在巨噬细胞内的繁殖，并且能调 节巨噬细胞的死亡方式（Behar，2011)。SPllO基因的发现为预防牛结核病的流行和传播提 供了一种新思路。
[0004] TALEN(Transcription Activator-Like Effector nucleases)是由植物致病细 菌Xanthomonas分泌的一类具有转录激活功能的蛋白。由于TALE的DNA结合域中的重复 氨基酸序列模块可以与单碱基发生特异性结合，因此理论上可以任意选择靶DNA序列进行 改造，是一种非常有效的基因组改造工具酶。TALENs由于具有一些比锌指核酸酶（ZFNs)更 优越的特点，现在成为了科研人员用于研究基因功能和潜在基因治疗应用的重要工具。应 用TALEN介导的基因组修饰已成功应用于多种模式动物，如果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠等。
[0005] 转基因动物在家畜品种改良方面具有巨大的应用潜力。在实际生产中，转基因 技术可以改善动物肉质，提高增长率、饲料利用率，改善乳质及其成分，改良繁殖性能等 (Niemann et al.，2005)。通过转基因技术，提高动物自身对结核分支杆菌的抵抗力将是今 后控制牛结核病的重要思路。
【发明内容】
[0006] 本发明解决的问题在于提供一种基于TALEN介导的SpllO巨噬细胞特异打靶载体 及重组细胞，在牛28号染色体M-S位点定点整合SPllO基因构建牛胎儿成纤维细胞系，以 该细胞系作为核供体细胞，为研制抗结核病的转基因牛提供坚实的基础。
[0007] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0008] -种基于TALEN介导的SpllO巨噬细胞特异打靶载体，包括TALEN真核表达载体 和打靶载体；
[0009] 所述的TALEN真核表达载体包括TALEN左臂表达载体和TALEN右臂臂表达载体， 分别识别TALEN靶点的上游和下游识别位点，TALEN靶点位于牛基因组28号染色体SFTPAl 和MATlA基因的基因间序列；
[0010] 所述的打靶载体上克隆有重组基因 MSRl-SpllO-PolyA，并克隆有作为同源臂的 TALEN靶点上游和下游的同源序列；
[0011] 所述的重组基因 MSRl-SplIO-PolyA是在SpllO基因的上游连接牛巨噬细胞特异 性启动子MSR1，在下游连接PolyA。
[0012] 所述的TALEN左臂表达载体上克隆有TALEN左臂，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1 所示；
[0013] 所述的TALEN右臂表达载体上克隆有TALEN右臂，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2 所示。
[0014] 所述还在TALEN左臂/TALEN右臂的下游连接T2A间隔、荧光标签GFP和mCherry。
[0015] 所述的重组基因 MSRl-SPlIO-PloyA中，SPl 10的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示， MSRl的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
[0016] 所述的同源臂包括分别位于重组基因 MSRl-SPllO-PloyA上游、下游的上游同源 臂和下游同源臂，上游同源臂与MSRl-SPllO-PloyA之间还设有一对同向的Loxp，Loxp之 间设有第一筛选基因，下游同源臂的下游还设有第二筛选基因。
[0017] 所述上游同源臂的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，下游同源臂的核苷酸序列如 SEQ. ID. NO. 6 所示。
[0018] 所述的TALEN真核表达载体为pCS2-TALEN，其TALEN左臂表达载体和TALEN右臂 表达载体，分别通过在pCS2-Fok I载体上连接TALEN左臂、TALEN右臂而构建；
[0019] 所述的打靶载体为pLR-SP110-Neo,是将MSRl-SPllO-PloyA插入到打靶骨架载体 pCS2-Neo的第二Loxp的下游，将上游同源臂连接在第一 Loxp的上游，将下游同源臂连接在 MSRl-SPllO-PloyA的下游而构建。
[0020] 一种基于所述的TALEN介导的SpllO巨噬细胞特异打靶载体构建的重组细胞，以 牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，通过TALEN真核表达载体和打靶载体共同转染到宿主细胞 中，将目的基因 SpllO整合到宿主细胞的基因组的28号染色体M-S位点。
[0021] 所述的共同转染是将TALEN真核表达载体和打靶载体共同电转到宿主细胞中，电 转染参数设置如下：电压：510V ;脉冲时间：3ms ;电击次数1次。
[0022] 所述的TALEN介导的SpllO巨噬细胞特异打靶载体构建的重组细胞作为核移植构 建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0024] 本发明提供的基于TALEN介导的SpllO巨噬细胞特异打靶载体及重组细胞，是通 过TALEN进行介导、定点打靶、特异启动子启动、目的基因 SpllO表达与胶原样凝集素家族 的成员协调作用来进行细胞的重组，进而构建抗结核病的转基因牛。
[0025] 本发明构建的TALEN介导中，TALEN靶点位于牛基因组28号染色体SFTPA1和 MATlA基因的基因间序列。该位点附近的SFTPD，MBLl和SFTPAl均属于胶原样凝集素家族 的成员，且在巨噬细胞表面存在受体，可以识别结合并介导结核杆菌进入巨噬细胞，促进巨 噬细胞的吞噬和杀伤能力。在TALEN识别、切割后产生双链断裂，启动DNA双链断裂修复， 同时引入同源臂载体，利用DNA双链断裂引发的DNA重组修复过程，使组装的目的DNA序列 特异的插入该区域。
[0026] 在TALEN的介导下，通过基因打靶技术使SpllO基因定点整合到牛28号染色体 M-S位点（牛28号染色体ΜΑΤΙΑ和SFTPAl基因间序列）。该位点附近的SFTPD，MBLl和 SFTPAl均属于胶原样凝集素家族的成员，且在巨噬细胞表面存在受体，可以识别结合并介 导结核杆菌进入巨噬细胞，促进巨噬细胞的吞噬和杀伤能力。将SPllO插入到该区域，使其 有可能协同作用于巨噬细胞，进一步提高巨噬细胞抗结核感染的能力。
[0027] 进一步的，本发明通过基因打靶技术使SpllO基因定点整合到牛28号染色体M-S 位点。由于该位点附近基因簇的功能对于巨噬细胞非常重要，因此可以确定该段染色质在 巨噬细胞中处于活化状态。将SPllO插入到该区域，可以避免插入的外源基因由于异染色 质化而失活。
[0028] 本发明构建的巨噬细胞特异性打靶载体，目的基因 SpllO是由巨噬细胞清道夫受 体1启动子启动转录。这样可以使得目的基因 SpllO在且仅在牛的外周血巨噬细胞中正常 转录和表达。这样可以提高转基因动物的安全性。
[0029] 本发明通过共转染打靶载体pLR-SPllO-Neo和对应的TALEN位点特异性核酸切割 酶表达载体，构建转基因的牛胎儿成纤维细胞系。经G418筛选获得阳性克隆细胞，并进行 PCR和Southern Blotting鉴定证实目的基因 SPllO定点整合到牛胎儿成纤维细胞基因组 M-S位点。以包含目的基因 SPllO的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆牛的核 供体细胞，通过SCNT获得转基因克隆牛，该克隆牛能够检测到SPllO基因的表达，而且侵 染、感染结果表明对牛分支杆菌具有一定的抗性，为预防牛结核打下了坚实的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1-1是TALEN模块组装方法的示意图；
[0031] 图1-2是TALEN表达载体的构建示意图。
[0032] 图2是TALEN真核表达载体的图谱。
[0033] 图3是Surveyor nuclease assay对TALEN切割活性检测结果图。
[0034] 图4是打靶载体pLR-SPIlO-Neo的图谱。
[0035] 图5是打靶载体pLR-SPllO-Neo经NotI酶切线性化的琼脂糖凝胶电泳检测图。M 为 DNA marker，泳道 1 为 NotI 酶切线性化的 pLR-SP110-Neo,泳道 2 为 pLR-SPllO-Neo
[0036] 图6是打靶载体pSPlIO-Neo经Sail和NheI双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳检测 图。M 为 DNA marker，泳道 1 为 Sail 和 NheI 双酶切的 pLR-SPlIO-Neo。
[0037] 图7是转染打靶载体pLR-SPllO-Neo的牛胎儿成纤维细胞经G418筛选出来的单 细胞克隆图。
[0038] 图8是阳性单克隆细胞鉴定示意图。
[0039] 图9a?图9c是一些具有代表性的单克隆细胞的junction PCR鉴定结果图，其中 图 9a 是 3' -junction 结果图，图 9b 是 5' -junction 结果图，图 9c 是 long range PCR 结 果图。
[0040] 图IOa?图IOb是对经PCR验证为发生了 SPllO基因定点整合的9个单克隆细胞 进行Southern bloting验证的结果图。
[0041] 图11是利用基因打靶的阳性克隆细胞制备的转基因克隆胚胎。
[0042] 图12是利用基因打靶的阳性克隆细胞制备的转基因克隆牛。
【具体实施方式】
[0043] 本发明首先构建了含有3?110基因的巨噬细胞特异性打靶载体？1^-5?110-他〇， 然后用电穿孔法将打靶载体pLR-SPlIO-Neo和对应的TALEN位点特异性核酸切割酶表达 载体共转染到牛胎儿成纤维细胞，经G418筛选获得阳性克隆细胞，并进行PCR和Southern Blotting鉴定证实目的基因 SPllO定点整合到牛胎儿成纤维细胞基因组M-S位点（牛28 号染色体MATlA和SFTPAl基因间序列）。最后，将确认整合的阳性克隆细胞做为核供体细 胞移入牛去核卵母细胞，获得抗结核病的转基因克隆牛。
[0044] 具体所涉及的试剂和材料如下：胎牛血清、G418、DMEM、DMEM/F12、Opti-MEM培养 基购自美国Invitrogen公司，EDTA和Trypsin购自美国Sigma公司，细胞培养板和培养皿 购自美国Corning公司，质粒提取试剂盒和细胞基因组提取试剂盒均购自美国Omega公司， PrimeSTAR DNA聚合酶和Solution I DNA连接酶购自Takara公司，电转染仪（ECM2001)购 自美国BTX公司，限制性内切酶购自NEB公司。
[0045] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明解释 的而不是限定。
[0046] I、TALEN真核表达载体的构建
[0047] I. ITALEN靶点设计及组装
[0048] 为提高基因打靶效率，本发明通过TALEN(类转录激活因子效应物核酸酶）进行介 导。TALEN靶点位于牛基因组28号染色体SFTPAl和MATlA基因的基因间序列。该位点附 近的SFTPD，MBL1和SFTPAl均属于胶原样凝集素家族的成员，且在巨噬细胞表面存在受体， 可以识别结合并介导结核杆菌进入巨噬细胞，促进巨噬细胞的吞噬和杀伤能力。在TALEN 识别、切割后产生双链断裂，启动DNA双链断裂修复，同时引入同源臂载体，利用DNA双链断 裂引发的DNA重组修复过程，使组装的目的DNA序列特异的插入该区域。在SPllO插入到 该区域后，使其有可能协同作用于巨噬细胞，进一步提高巨噬细胞抗结核感染的能力。
[0049] 另外，由于该位点附近基因簇的功能对于巨噬细胞非常重要，因此可以确定该段 染色质在巨噬细胞中处于活化状态。将SPllO插入到该区域，可以避免插入的外源基因由 于异染色质化而失活。
[0050] 利用在线TALEN革巴点设计工具（https://tale_nt· cac. Cornell, edu/)进行革巴 点设计，TALEN识别的靶DNA序列如下（其中下划线部分分别为TALEN上游和下游识别位 点）：
[0051] 5' -t GACCCTTAGGTTCCT cacgaatccttatgg AACACACATACCATCCA a_3'
[0052] 3, -a CTGGGAATCCAAGGA gtgcttaggaatacc TTGTGTGTATGGTAGGT t_5，
[0053] 针对所识别的上游位点和下游位点，按照通过酶切连接的方法（Huang et.al，2011.参见图1-1)把TALEN模块组装（TALEN模块购自北京康为世纪生物技术有限 公司）起来。其中模块顺序为：
[0054] 上游识别 TALEN (左臂）：NN HI HD HD HD NG NG NI NN NN NG NG HD HD NG ;
[0055] 下游识别 TALEN (右臂）：NN HI HD HD HD NG NG NI NN NN NG NG HD HD NG。
[0056] 组装后TALEN左臂的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示、TALEN右臂的核苷酸序列 如 SEQ. ID. NO. 2 所示。
[0057] 在TALEN左臂、右臂组装完成之后，分别对其进行载体构建：将其分别用Spel、 Nhel双酶切之后，与用Nhel酶切的pCS2-Fok I载体连接，构建pCS2-TALEN载体（参见图 1-2)；
[0058] 为了便于TALEN载体的筛选，进一步在TALEN的下游连接荧光标签GFP和 mCherry，并用T2A间隔，得到如图2所示的TALEN表达载体pCS2-TALEN-t2a-G/m ;可以在 TALEN表达载体转染细胞3d后通过流式细胞术收集表达红色和绿色荧光的细胞进行转染 阳性的筛选和富集，能够克服转染效率低下的问题。
[0059] I. 2TALEN切割活性检测
[0060] 利用Surveyor nuclease assay的方法对TALEN切割活性进行检测。
[0061] 将TALEN位点特异性核酸切割酶表达载体转染牛胎儿成纤维细胞。具体采用电 穿孔法：当细胞生长到90 %汇合时，胰酶消化细胞后IOOOrpm低速离心5min，用无血清的 Opti-MEM培养液洗涤细胞2次。将10 μ g的TALEN位点特异性核酸切割酶表达载体（左 臂表达载体、右臂表达载体各5μ g)加入到600μ L电转液（Kcl:120mM ;Cacl2:0. 15mM ; K2HP04:10mM;Mgcl2:50mM;调PH至7.6)中，混匀，静置lOmin。电转染参数设置如下：电 压：510V ;脉冲时间：3ms ;电击次数1次。
[0062] 转染完成后，静置lOmin，然后将细胞悬液全部转移到60_培养皿中，将培养液置 于37°、5%的0) 2培养箱中，待细胞贴壁后，更换新鲜培养液。3d后消化细胞并提取细胞 基因组。
[0063] 以提取的细胞基因组为模板，PCR扩增一段包含TALEN识别靶DNA的序列并进行 Surveyor nuclease酶切。引物如下：
[0064] Cel-I-F :5'-CCTTCCGCCTCTGTAGGTACAGA-3'
[0065] Cel-I-R :5,-GTAGGACACAGTGCCGCAAACCC-3'
[0066] Surveyor nuclease 酶切使用 Transgenomic 公司的 Nucleic Acid Fragment Analysis System试剂盒，具体操作详见试剂盒说明书。酶切产物进行电泳检测。检测结果 见图3。
[0067] 如果TALEN在识别靶位点进行了 DNA切割，细胞通过非同源末端修复切割的DNA， 这个过程会产生插入或者缺失突变。这种插入缺失的突变只在产生了 TALEN切割的细胞 里面才有，没有发生切割的细胞DNA仍为野生型。通过PCR扩增的变性，退火过程，突变的 DNA单链和野生型的单链会随机配对成双链DNA。这样PCR产物里面会有一部分DNA双链 在TALEN识别祀位点不完全匹配。而Surveyor nuclease酶可以特异性的识别不匹配的位 点并进行切割。图3中扩增产物长度为383bp。TALEN识别靶位点位于距离两端147bp和 236bp处。如泳道2所示TALEN切割产物为5. 85%。切割条带的比率由Image J软件分析 得到。
[0068] 2、SpllO巨噬细胞特异性打靶载体pLR-SPlIO-Neo的构建
[0069] 2.1目的基因的克隆
[0070] 根据小鼠 SPllO序列（GenBank登陆号：NM_175397. 4)，设计引物如下：
[0071] SPlIO-EcoRI-F:5' -TCAGAATTCGAACCCCTTAACTAATCCAG-3;；
[0072] SPl10-BamHI-R:5; -CTAGGATCCGCTGGGACACTCAGAGGCTC-3;
[0073] 50μ L 的 PCR 反应体系为：10XPCR Buffer :5μ L，dNTPs(2. 5mmol/L) :4μ L， SP110-EcoRI-F(10ymol/L) :lyL，SP110-BamHI-R(10ymol/L) :lyL，PrimeSTAR DNA 聚 合酶（5U/ μ L) :0· 5 μ L，牛cDNA模板3 μ L，加超纯水至50 μ L。
[0074] PCR 反应条件为：95°C预变性 5min，95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min， 32个PCR循环，72°C再延伸5min ;PCR胶回收产物经EcoRI和BamHI双酶切，经Solution I 连接至PEGFP-Cl载体，暂命名为pSPlIO-Cl。其中，SPl 10基因的核酸序列如SEQ. ID. NO. 3 所示。
[0075] 2. 2MSR1启动子的克隆
[0076] 根据牛的MSRl序列（GenBank登陆号：NC_007328)，设计引物序列如下：
[0077] pMSR-Bglll-F:5，-TGAAGATCTACCATCTCTTGATAGAAAGT-3'
[0078] pMSR-HindllI-R:5，-TACAAGCTTGACACACAAAAATACAGAG-3'
[0079] 50μ L 的 PCR 反应体系为：10XPCR Buffer :5μ L，dNTPs(2. 5mmol/L) :4μ L， pMSR-BglII-F(10ymol/L) :lyL，pMSR-HindIII-R(10ymol/L) :lyL，PrimeSTAR DNA 聚 合酶（5U/ μ L) :0. 5 μ L，牛基因组模板2 μ L，加超纯水至50 μ L。
[0080] PCR 反应条件为：95°C预变性 5min，95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 32个PCR循环，72°C再延伸5min ;PCR胶回收产物经BglII和HindIII双酶切，经Solution I连接至PSP110-C1载体中SPllO的上游，暂命名为pMSRl-SP110。其中，MSRl启动子的核 酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
[0081] 2. 3MSR1-SP1 IO-PloyA表达框插入到打靶骨架载体pCS2_Neo
[0082] 以pMSRl-SP110序列为模板，设计引物把MSR1-SP110和pEGFP-Cl骨架载体上的 PloyA-起扩增下来。引物序列如下：
[0083] MSP-SalI-F ：TGAGTCGACGGACCATCTCTTGATAGAAAG
[0084] MSP-NheI-R ： TATGCTAGCTACGCGTTAAGATACATTGAT
[0085] 50μ L 的 PCR 反应体系为：10XPCR Buffer :5μ L，dNTPs(2. 5mmol/L) :4μ L， MSP-SalI-F(10ymol/L) :lyL，MSP-NheI-R(10ymol/L) :lyL，PrimeSTAR DNA聚合酶 (5U/ μ L) :0· 5 μ L，pMSRl-SPl 10 质粒模板 I μ L，加超纯水至 50 μ L。
[0086] PCR 反应条件为：95°C预变性 5min，95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 3min， 32个PCR循环，72°C再延伸5min ;PCR胶回收产物经Sail和NheI双酶切，经Solution I连 接至pCS2-Neo打靶骨架载体中第二Loxp的下游，命名为pSP110-Neo。
[0087] 2. 4巨噬细胞特异性打靶载体pLR-SPlIO-Neo的构建
[0088] 同源臂以牛基因组为模板扩增，分别为牛28号染色体M-S位点的上游525bp和下 游466bp。设计引物如下：
[0089] LA-NotI-F ：TAAGCGGCCGCGTTGTGAATTCTATTGGAA
[0090] LA-XhoI-R ： TCACTCGAGGTGCATAATCCCTCACCC
[0091] RA-NheI-F:TGAGCTAGCGCACTTTAGAAGGCAAAGGGA
[0092] RA-KpnI-R ： TCTGGTACCGGCAAGAATACTGGAATGG
[0093] 同源左臂的核酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，同源右臂的核酸序列如SEQ. ID. NO. 6 所示。
[0094] 50μ L 的 PCR 反应体系为：10XPCR Buffer :5μ L，dNTPs(2. 5mmol/L) :4μ L， LA-SalI-F(10y mol/L) :1 μ L，RA-NheI-R(10y mol/L) :1 μ L，PrimeSTARDNA 聚合酶（5U/ μ L) :0· 5 μ L，pMSRl-SPllO 质粒模板 I μ L，加超纯水至 50 μ L。
[0095] PCR 反应条件为：95°C预变性 5min，95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 3min， 32个PCR循环，72°C再延伸5min ;
[0096] PCR胶回收产物经Sail和NheI双酶切，经Solution I连接至pCS2_Neo载体，其 中上游同源臂LA连接在第一 Loxp的上游，下游同源臂连接在SPllO的下游，所构建的载体 命名为pLR-SP110-Neo,其图谱如图4所示：
[0097] 其中目的基因 SPllO的上游连接有特异启动子MSR1，其下游连接有终止表达的 PolyA，在巨噬细胞中MSRl启动子特异性的启动SPllO的表达，使得目的基因 SpllO在且仅 在牛的外周血巨噬细胞中正常转录和表达，从而提高转基因动物的安全性；
[0098] 目的基因 SPllO的上游、下游分别设有LA、RA同源臂；在TALEN对SFTPAl和MATlA 基因间的识别位点切割之后，LA、RA之间的序列通过重组整合到细胞基因组中，实现M-S位 点的打靶重组；该位点附近的SFTPD，MBLl和SFTPAl均属于胶原样凝集素家族的成员，且在 巨噬细胞表面存在受体，可以识别结合并介导结核杆菌进入巨噬细胞，促进巨噬细胞的吞 噬和杀伤能力。将SPllO插入到该区域，使其有可能协同作用于巨噬细胞，进一步提高巨噬 细胞抗结核感染的能力。
[0099] 在LA与MSRl启动子之间设有一对同向的Loxp，Loxp之间设有筛选基因 ΝΕ0,在 进行重组之后可以通过Cre酶将Loxp切割掉；发生同源重组后，载体中neo基因部分将定 点整合至基因组中与同源臂同源的区域，使中靶细胞获得新霉素抗性，并且不会整合tk自 杀基因；通过NEO与TK两个筛选基因便于阳性克隆的筛选。
[0100] 图5所示是打靶载体pLR-SPlIO-Neo经NotI酶切线性化的琼脂糖凝胶电泳检测 图。M 为 DNA marker，泳道 1 为 NotI 酶切线性化的 pLR-SPl ΙΟ-Neo,泳道 2 为 pLR-SPl IO-Neo。
[0101] 图6是打靶载体pSPlIO-Neo经Sail和NheI双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳检测 图。M为DNA marker，泳道1为Sail和NheI双酶切的pLR-SP110-Neo。酶切鉴定结果表明 载体构建成功。
[0102] 3、SpllO巨噬细胞特异性打靶载体pLR-SPllO-Neo与TALEN位点特异性核酸切割 酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞构建核供体细胞系
[0103] 3. 1牛胎儿成纤维细胞培养
[0104] 从液氮中取一管第二代荷斯坦奶牛的牛胎儿成纤维细胞于37°C解冻，离心。弃去 废液，加 Iml含10% FBS的DMEM重悬，接种于60_的培养皿中，置于CO2培养箱中37°C条 件下培养。
[0105] 待细胞生长到90%汇合时，胰酶消化，并按1 : 2的比例传代培养，选取3?5代 传代的细胞达到90%汇合的牛胎儿成纤维细胞，作为用于转染的宿主细胞。
[0106] 3. 2阳性细胞克隆的筛选
[0107] pLR-SPl IO-Neo打靶载体与TALEN位点特异性核酸切割酶表达载体电转染牛胎儿 成纤维细胞。
[0108] 具体采用电穿孔法：当细胞生长到90 %汇合时，胰酶消化细胞后IOOOrpm低速离 心5min，用无血清的Opti-MEM培养液洗涤细胞2次。将10 μ g的TALEN位点特异性核酸切割 酶表达载体（左臂表达载体、右臂表达载体各5yg)与打靶载体pLR-SPllO-Neo共同电转， 将其共同加入到 600μ L 电转液（Kcl:120mM ;Cacl2:0. 15mM ;K2HP04:10mM ;Mgcl2:50mM ;调 PH至7. 6)中，混匀，静置lOmin。电转染参数设置如下：电压：510V;脉冲时间：3ms;电击次 数1次。
[0109] 转染完成后，静置lOmin，然后将细胞悬液全部转移到60mm培养皿中，将培养液置 于37°、5%的CO 2培养箱中，待细胞贴壁后，更换新鲜培养液。
[0110] 转染完3d后消化细胞并转移至90mm培养皿中，同时加入600 μ g/mL的G418进行 药物筛选。筛选IOd后，对照组的细胞全部死亡，而转染组的细胞逐渐形成单克隆细胞团， 单克隆细胞微观示意图如图7所示。
[0111] 3. 3PCR鉴定基因打靶的阳性细胞克隆
[0112] 取扩大培养后的稳定转染pLR-pSPlIO-Neo的牛胎儿成纤维细胞，提取细胞基因 组DNA，以基因组DNA为模板，PCR鉴定SPllO基因是否定点整合到M-S位点，阴性对照为未 转染的正常牛胎儿成纤维细胞，junction PCR鉴定所用引物对为：
[0113] 5，-junction :
[0114] 5 j-F (5，-GAAGTCTGGCTGTAGTCCAGGGGGT-3，）
[0115] 5j-R(5,-CTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGA-3,）；
[0116] 3，-junction :
[0117] 3j-F (5，-GAAAAACCACTCCAGTGTCCTCC-3，）
[0118] 3j-R(5,-CACCAGCTATGTCTGCTTCCATA-3,）；
[0119] long-range PCR ：
[0120] lr-F(5, -TGCTGAAGCGGAAACTCCAATAC-3,）
[0121] Ir-R (5，-GACTCAAGACCAGAGGGCACACA-3，）·
[0122] 参见图8所示的junction PCR鉴定示意图，其中，5'-junction的上游引物位于同 源左臂外侧，下游引物位于NEO基因表达框，如果PCR出现I. 49kb条带则判为阳性并进入 3'-junction鉴定。3'-junction的上游引物位于SPllO基因表达框，下游引物位于同源右 臂外侧，如果PCR出现I. 67kb条带则判为阳性并进入long-range PCR鉴定。long-range 的上游引物位于同源左臂外侧，下游引物位于同源右臂外侧，如果PCR出现1.64kb的野生 型条带和一条5. 98kb的重组条带则判为发生了单等位基因位点特异性整合的阳性克隆。
[0123] PCR反应条件为：95 °C预变性5min ;95 °C变性30s，57 °C退火30s，72 °C延伸 211^11(1〇1^-四叩6?0?延伸5111丨11)，35个？0?循环；721：再延伸5111丨11 ;?0?产物进行0.8%琼 脂糖凝胶电泳检测。
[0124] PCR检测结果如图9a?图9c所示，其中，泳道M为DNA Marker，泳道NC为未转染 的牛胎儿成纤维细胞，图9a为5'-junction检测结果可以看到有6个阳性克隆具有I. 49kb 的目标条带，其5'同源臂发生了重组；图9b为3'-junction检测结果，可以看到在6个5' 同源臂发生了重组阳性克隆中只有4个具有I. 67kb的目标条带，其5'、3'同源臂同时发生 了重组；图9c为long-range PCR检测结果，结果表明由3个阳性克隆发生了完整的重组， 扩增出一条I. 64kb的野生型条带和一条5. 98kb的重组条带，表明其发生了单等位基因位 点打靶重组。
[0125] 3. 4Southern blot鉴定基因打祀的细胞克隆
[0126] 取经上述经PCR验证为阳性的打靶的细胞克隆，提取细胞基因组DNA，用限制性内 切酶HindIII将基因组DNA切成小片段有利于杂交。用5'同源臂外侧探针杂交。设计引 物如下：
[0127] Probel-F :5'-ACAGACTTTATTTTGGGGGG-3'
[0128] Probel-R :5'-TGGACTACAGCCAGACTTCC-3' ；
[0129] Probe2-F : 5'-GTATCCTTTCCTACTCTGCTTTGT-3'
[0130] Probe2-R : 5'-CCGATTTATCTACTTCCCTCTTG-3'
[0131] 以牛基因组为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：95°C预变性5min ;95°C变性 308,571：退火308,721：延伸308,35个？〇?循环；721：再延伸51^11屮〇?产物进行1%琼脂 糖凝胶电泳检测。
[0132] DNA 产物使用 Roche 公司的 DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II试剂盒将探针标记上地高辛，即为探针。Southern blot杂交方法按Roche 公司的 DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 试剂盒进行。详 细步骤见试剂盒说明书，杂交之后进行电泳鉴定。
[0133] 若单等位基因位点的M-S位点发生了重组，在杂交时基因打靶敲入外源基因会较 长，其电泳检测会显示两条带：野生型的M-S等位基因杂出5. 9kb的带，发生基因打靶的 M-S等位基因杂出6. 8kb的带，如图IOa所示，泳道Con为未转染的牛胎儿成纤维细胞。探 针位于SPllO基因上，因此发生了打靶的细胞会有一条6. 8kb的带，而没有中靶的细胞则没 有条带。如图10中的Probe2所示，泳道Con为未转染的牛胎儿成纤维细胞，而显示6. 8kb 带的为M-S位点发生了定点重组。
[0134] 这样经过PCR及Southern blot鉴定的筛选，获得了 M-S位点定点整合了 SPllO 的牛胎儿成纤维细胞。
[0135] 4、以上述基因组定点整合了目的基因 SPllO的牛胎儿成纤维细胞为核供体细胞， 构建转基因克隆牛
[0136] 4. 1卵母细胞的成熟培养
[0137] 卵巢采自西安市屠宰场，在37°C无菌生理盐水中4?6小时内运回实验室，抽取 3?8mm直径的卵泡，收集卵丘卵母细胞复合体，实体显微镜下挑选具有完整的三层以上卵 丘细胞，胞质均匀的卵母细胞用于成熟培养。成熟培养20h后用0.2%透明质酸酶去除卵丘 细胞，以第一极体的排放作为卵母细胞成熟的判定标志，挑选成熟卵母细胞用于核移植试 验。
[0138] 4. 2转基因克隆胚的构建
[0139] 采用体细胞核移植技术将供体细胞转移到去除细胞核的成熟卵母细胞中。核移植 具体为：显微操作液为含10%胎牛血清，5 μ g/mL细胞松弛素 B的PBS,用内径20 μ m的去 核管在显微操作仪上吸出第一极体及部分胞质，以IOu g/ml Hoechst 33342染色IOmin, 在荧光显微镜下挑出完全去核的卵母细胞；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于 核移植。
[0140] 卵母细胞的注核与融合，具体过程如下：胰酶消化经筛选验证的阳性单克隆胎儿 成纤维细胞用做供核细胞。用去核管将供体细胞注入去核成功的卵母细胞透明带下。核质 复合体在电融合液中平衡3min，用微电极法进行融合，用与显微操作仪连接的微电极尖部 排列重组体，使膜接触面与两电极的连线垂直，用微电极尖轻轻压住重组体，给予电脉冲进 行电融合。融合电压为28V，融合时间为10 μ m。融合后的重组体放入10%胎牛血清的M199 中，38. 5°C、5% CO2、饱合湿度下培养，2h后观察融合情况。
[0141] 4. 3转基因克隆胚的激活及体外培养
[0142] 融合的重组胚平衡2h后，用含5ymol/L离子霉素（Ionomycin，购自SIGM公 司）的mSOFaa培养液（购自SIGMA公司）处理5min，然后在含2mmol/L二甲基氨基嘌呤 (6-DMAP)的mSOFaa培养液内培养4h，清洗3次后转入矿物油覆盖并预先在C02培养箱中 平衡至少2h的mSOFaa中培养，培养密度为5 μ L每个重组胚，在38. 5°C、5% CO2、饱和湿度 下培养，第7天挑选正常发育的囊胚进行核移植，如图11所示。
[0143] 4. 4转基因克隆牛的制备
[0144] 第7天的囊胚用非手术法移入自然发情后第七天的荷斯坦受体牛子宫内，每个受 体牛移植2-3枚囊胚。受体牛移植后观察其返情情况，对未返情的在移植后60d用B超做 怀孕检查。以后每隔一月检查一次，以观察妊娠维持情况。10个月后，成功产下成活的基 因打靶的转基因克隆牛（图12)。M-S位点定点整合SPllO基因的转基因克隆牛的制备成 功，该克隆牛能够检测到SPllO基因的表达，而且侵染、感染结果表明对牛分支杆菌具有一 定的抗性，为预防牛结核打下了坚实的基础。
【权利要求】
1. 一种基于TALEN介导的Spl 10巨噬细胞特异打靶载体，其特征在于，包括TALEN真核 表达载体和打靶载体； 所述的TALEN真核表达载体包括TALEN左臂表达载体和TALEN右臂臂表达载体，分别 识别TALEN靶点的上游和下游识别位点，TALEN靶点位于牛基因组28号染色体SFTPA1和 ΜΑΤΙΑ基因的基因间序列； 所述的打靶载体上克隆有重组基因 MSRl-SpllO-PolyA，并克隆有作为同源臂的TALEN 靶点上游和下游的同源序列； 所述的重组基因 MSRl-SpllO-PolyA是在SpllO基因的上游连接牛巨噬细胞特异性启 动子MSR1，在下游连接PolyA。
2. 如权利要求1所述的基于TALEN介导的SpllO巨噬细胞特异打靶载体，其特征在于， 所述的TALEN左臂表达载体上克隆有TALEN左臂，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示； 所述的TALEN右臂表达载体上克隆有TALEN右臂，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3. 如权利要求2所述的基于TALEN介导的SpllO巨噬细胞特异打靶载体，其特征在于， 还在TALEN左臂/TALEN右臂的下游连接T2A间隔、荧光标签GFP和mCherry。
4. 如权利要求1所述的基于TALEN介导的SpllO巨噬细胞特异打靶载体，其特征在于， 所述的重组基因 MSRl-SP110-PloyA中，SP110的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，MSR1的 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
5. 如权利要求1所述的基于TALEN介导的SpllO巨噬细胞特异打靶载体，其特征在于， 所述的同源臂包括分别位于重组基因 MSRl-SPllO-PloyA上游、下游的上游同源臂和下游 同源臂，上游同源臂与MSR1-SP110-P1 oyA之间还设有一对同向的Loxp，Loxp之间设有第一 筛选基因，下游同源臂的下游还设有第二筛选基因。
6. 如权利要求5所述的基于TALEN介导的SpllO巨噬细胞特异打靶载体，其特征在于， 上游同源臂的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，下游同源臂的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6 所示。
7. 如权利要求1所述的基于TALEN介导的Spl 10巨噬细胞特异打靶载体，其特征在于， 所述的TALEN真核表达载体为pCS2-TALEN，其TALEN左臂表达载体和TALEN右臂表达载体， 分别通过在pCS2-Fok I载体上连接TALEN左臂、TALEN右臂而构建； 所述的打靶载体为pLR-SPl 10-Neo，是将MSR1-SP1 ΙΟ-PloyA插入到打靶骨架载体 pCS2-Neo的第二Loxp的下游，将上游同源臂连接在第一 Loxp的上游，将下游同源臂连接在 MSRl-SPllO-PloyA的下游而构建。
8. -种基于权利要求1所述的TALEN介导的SpllO巨噬细胞特异打靶载体构建的重 组细胞，其特征在于，以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，通过TALEN真核表达载体和打靶载 体共同转染到宿主细胞中，将目的基因 SpllO整合到宿主细胞的基因组的28号染色体M-S 位点。
9. 如权利要求8所述的TALEN介导的SpllO巨噬细胞特异打靶载体构建的重组细胞， 其特征在于，所述的共同转染是将TALEN真核表达载体和打靶载体共同电转到宿主细胞 中，电转染参数设置如下：电压：510V ;脉冲时间：3ms ;电击次数1次。
10. 权利要求8所述的TALEN介导的SpllO巨噬细胞特异打靶载体构建的重组细胞作 为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。
【文档编号】C12N5/10GK104293833SQ201410528091
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】张涌, 吴海波, 王勇胜, 张艳, 吕佳星 申请人:西北农林科技大学, 杨凌科元克隆股份有限公司