一种埃博拉病毒快速分型鉴别检测试剂盒的制作方法

一种埃博拉病毒快速分型鉴别检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种埃博拉病毒快速分型鉴别检测的试剂盒，特别是涉及一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术鉴别本迪布焦埃博拉病毒(BDBV)、扎伊尔埃博拉病毒(EBOV)、苏丹埃博拉病毒(SUDV)和塔伊森林埃博拉病毒(TAFV)。本试剂盒主要包括RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPC H2O，以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。由于本试剂盒通过多种荧光通道分别检测的方式，应用一步法实时荧光PCR反应模式，能准确快速检测并鉴别出埃博拉病毒的四种型别，可广泛应用于埃博拉病毒病的早期鉴别诊断、疫情防控、检验检疫等多个领域。
【专利说明】一种埃博拉病毒快速分型鉴别检测试剂盒

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种埃博拉病毒型别鉴定检测的试剂盒，特别是涉及一种利用多重实 时荧光聚合酶链式反应技术一管反应即可鉴别出埃博拉病毒四种致病性型别的试剂盒。本 试剂盒主要包括RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPC H2O,以及分隔并 集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。由于本试剂盒能准确区分4种致病性型别的埃博拉病 毒即：扎伊尔型埃博拉病毒、本迪布焦型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、塔伊森林型埃博 拉病毒，可广泛应用于埃博拉病毒病临床早期诊断、重症病例预警、口岸检验检疫、疫情防 控、媒介控制及科学研究等多个领域。

【背景技术】
[0002] 埃博拉病毒病（EVD ;以往称为埃博拉病毒性出血热）是严重的、往往致命的人类 疾病。在1976年首次发生于刚果民主共和国（前扎伊尔）埃博拉河流域，因其引起病人全 身性出血症状，故命名为埃博拉出血热。世界卫生组织（WHO)已经将其列为对人类危害最 严重的传染病之一，并规定有关其活病毒的研究必须在生物安全4级实验室中进行。EVD的 病原体是埃博拉病毒，主要通过体液、血液、分泌物进行传播。埃博拉病毒通过干扰感染者 机体凝血平衡，导致血管壁破坏或功能受损，血小板不能凝血，在2-21天内出现出血性休 克或器官衰竭,死亡率很高。
[0003] 埃博拉病毒隶属于丝状病毒科（Filoviridae)，丝状病毒属（Filovirus)，是非 分节段的单股负链RNA病毒。埃博拉病毒属包括五种不同的型别：本迪布焦埃博拉病毒 (BDBV)、扎伊尔埃博拉病毒（EBOV)、雷斯顿埃博拉病毒（RESTV)、苏丹埃博拉病毒（SUDV)和 塔伊森林埃博拉病毒（TAFV)。除雷斯顿埃博拉病毒对人呈隐形感染外，其余4亚型对人都 有致死性。本迪布焦埃博拉病毒、扎伊尔埃博拉病毒和苏丹埃博拉病毒与非洲埃博拉病毒 病大型疫情相关，而雷斯顿埃博拉病毒和塔伊森林埃博拉病毒则与之无关。
[0004] 埃博拉病毒病病人样本具有极端生物危害风险；只有在最高级别的生物防护条件 下才可进行检测。埃博拉病毒感染可通过若干类型的实验室检测获得明确诊断，如：抗体捕 获酶联免疫吸附试验（ELISA)、抗原检测试验、血清中和试验、常规RT-PCR检测、Real time RT-PCR检测、电子显微镜检查和病毒分离培养。但是，血清学试验、病毒培养具有灵敏度低、 免疫交叉反应以及周期长等缺点；而常规RT-PCR又容易产生污染，造成假阳性的产生。多 重实时荧光PCR技术是将PCR技术和多色荧光标记探针相结合的先进技术，该方法具有快 速、特异、灵敏、自动化程度高等特点，结合防污染技术处理，特别适合于大规模、快速诊断 的需求。该技术采用多色荧光对多条种特异性探针进行标记，配合多重PCR技术，可以在 同一个PCR反应管中对多个病毒同时进行扩增，各色荧光的增长信号与相应PCR产物的增 长量成等比关系，并被自动化荧光检测仪收集，最后可通过分析荧光增长曲线达到检测病 原体类型的目的。由于，荧光PCR技术具有扩增片段短，引物、探针具有双重特异等优点，因 此，将多重实时荧光PCR技术应用于埃博拉病毒分型的快速检测，能够节约时间、减少取材 数量、提高检测鉴别效率，能在短时间内判断疑似病例或可疑媒介是否感染致病性埃博拉 病毒及同时确诊所感染的型别，便于临床及时采取必要的防控和治疗措施，防止这些病毒 继续传播，并提高诊疗效率，为快速诊断、有效监测和针对性治疗提供支持和依据。
[0005] 本发明采用实时荧光PCR技术中的多重实时荧光PCR方法，对埃博拉病毒的四种 致病性型别（本迪布焦型、扎伊尔型、苏丹型和塔伊森林型）核酸进行扩增，根据标记的四 色荧光的扩增情况，来鉴别埃博拉病毒的致病性型别。本发明的试剂盒可广泛地运用于由 埃博拉病毒引发的埃博拉出血热或疑似埃博拉出血热患者的样本检测和实验室诊断。


【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术进行对四种 致病性埃博拉病毒型别的鉴别试剂盒，利用本试剂盒可以准确区分本迪布焦埃博拉病毒、 扎伊尔埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒和塔伊森林埃博拉病毒。
[0007] 在对GENBANK上所有已知的埃博拉病毒各致病性型别的核酸序列进行比对的基 础上，分别寻找各型别核酸序列的特异性保守区，并针对保守区设计靶核苷酸引物和探针。 这些引物探针在含有耐热DNA聚合酶，逆转录酶、高质量脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs)的 RT-PCR反应酶系以及含有Mg2+等成份的RT-PCR反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸 的循环扩增。
[0008] 本发明所涉及的试剂盒主要包括：DRT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反 应酶系、DEPC H2O，阴性质控品、阳性质控品和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装 盒。
[0009] 本发明的一个优选实施方案是引物探针混合液由四种致病性埃博拉病毒特异性 的正、反向引物，特异性的探针组成，其特征在于本迪布焦埃博拉病毒特异性的正向和反 向引物的序列分别是5'-TTGGAAAGTAATGCGGTAAAATA-3'（SEQIDN0 :l)和5'-GCAGCCA ATGTTCTCTTGATGT-3'（SEQIDN0:2) ;本迪布焦埃博拉病毒特异性的探针的序列是5'-C TACTCCCTGCTGCCTCGAGTGGAAA-3'（SEQ ID N0:3)，探针的两端分别结合有荧光发生基团 FAM和荧光淬灭基团BHQl ;扎伊尔埃博拉病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是 5' -GATGCCAACGAYGCTGTGAT-3'（SEQ ID N0:4)和 5' -TGCAAGAGGATGGAGACGAA-3'（SEQ ID NO :5)，扎伊尔埃博拉病毒特异性的探针的序列是5' -TCAGTGGCTCAAGCTCGTTTTTCAGGT-3'（ SEQID NO :6)，探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQl ;苏丹埃博拉 病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是5' -TGGTGTTGTTGACCCGTATG-3'（SEQID NO: 7)和5'-CGTCGTCCAAATTGAAGAGAT-3'（SEQID NO :8)，苏丹埃博拉病毒特异性的探针的序列 是5'-CCTGACTACGAGGATTCGGCTGAAG-3'（SEQIDN0:9)，探针的两端分别结合有荧光发生 基团Texas Red和荧光淬灭基团BHQ2 ;塔伊森林埃博拉病毒特异性的正向和反向引物的序 列分别是 5' -CAACAACAAACACAGTCTTACAGG-3'（SEQID NO :10)和 5' -TTATCCCTGGCGTATTCTT GA-3'（SEQID NO :11)，塔伊森林埃博拉病毒特异性的探针的序列是5'-CTCCACACAAAACAATG ACAATCCTGC-3'（SEQ ID勵：12)，探针的两端分别结合有荧光发生基团075和荧光淬灭基团 BHQ2〇
[0010] 本发明的另一个优选实施方案是引物探针混合液中引物浓度均为〇. 2mmol/L，探 针浓度均为0. lmmol/L。
[0011] 本发明的另一个优选实施方案是RT-PCR反应液由TriS-HCl (50mmol/L，pH8. 0)、 MgCl2 (8mmol/L)、KCl (250mmol/L)组成。
[0012] 本发明的另一个优选实施方案是RT-PCR反应酶系由热启动Taq酶、逆转录酶、 dNTPs组成。逆转录酶可选择mMLV等常用逆转录酶。热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs均可 采用市售产品，如Qiagen公司的产品，其中每人份RT-PCR反应酶系中热启动Taq酶的用量 为8U，逆转录酶用量为3U，dNTPs用量为IOmmol。
[0013] 本发明的另一个优选实施方案是PCR扩增的条件为：50°C 15分钟，95°C 15分钟； 95 °C 10秒，58 °C 35秒，40个循环（58 °C时收集荧光信号）。
[0014] 本发明的一个优选实施方案是试剂盒提供了质控品，分别为阴性质控品和阳性质 控品。阴性质控品为健康人血浆，阳性质控品为人工合成的含有四种致病性埃博拉病毒目 的基因的全长RNA，选择浓度为4. OX 105copies/mL的RNA，并以等体积比混合均勻制备成 阳性质控品。试剂盒中进行待检标本检测可同时进行两种质控品的检测，仅当阳性质控品 检测时FAM、HEX、Texas Red及CY5通道荧光信号均呈阳性，阴性质控品检测四个通道荧光 信号均呈阴性时，待检标本的检测结果才有效。
[0015] 本发明的试剂盒扩增待检标本由市售的荧光定量PCR仪自动完成，操作简单，耗 时少，且最大限度地减少了污染的发生。检测结果可用于埃博拉病毒分型、辅助临床诊断及 常规监测等多个领域研究。
[0016] 本发明与现有技术相比优点为：①对埃博拉病毒四种型别核酸扩增水平进行检 测，可反映出样本中埃博拉病毒感染的状态及确认是何种型别埃博拉病毒感染，可用于埃 博拉病毒病的监测和防控及临床诊断，有助于埃博拉病毒病的早期诊断和治疗；②分别针 对埃博拉病毒病4种致病性型别病毒核酸特异性序列设计专用引物、探针，保证检测的特 异性和准确性，也具有较高通量，操作简便、相对降低成本的优点，更适用于多数患者检测； ③一份样本一次检测即可鉴别四种型别的感染情况，检测过程只需I. 5h，相比一个样本进 行4次检测或只进行埃博拉病毒通用型荧光法检测，大大减少了工作量，提高了检测效率； 相对于已有的核酸杂交法检测技术，检测所需时间缩短了一半以上；④试剂采用人工体外 合成的RNA作为阳性质控品，即可以对试剂进行质控，比质粒作为质控更具有效性和科学 性；⑤试剂采用RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系的大包装设置，适合多种 荧光检测设备，具有适用性更加广泛的特点。

【专利附图】

【附图说明】
[0017] 图1显示PCR扩增的反应条件。
[0018] 图2显示试剂盒阴性质控品的扩增曲线。图中没有S型扩增曲线，说明FAM、HEX、 Texas Red及CY5通道荧光信号均呈阴性。
[0019] 图3显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明 该通道的荧光信号呈阳性。
[0020] 图4显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中HEX通道的扩增曲线为S型，说明 该通道的荧光信号呈阳性。
[0021] 图5显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中Texas Red通道的扩增曲线为S型， 说明该通道的荧光信号呈阳性。
[0022] 图6显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中CY5通道的扩增曲线为S型，说明 该通道的荧光信号呈阳性。
[0023] 图7显示本迪布焦埃博拉病毒标准品的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S 型，说明试剂盒能够检测出本迪布焦埃博拉病毒RNA。
[0024] 图8显示扎伊尔埃博拉病毒标准品的扩增曲线。图中HEX通道的扩增曲线为S型， 说明试剂盒能够检测出扎伊尔埃博拉病毒RNA。
[0025] 图9显示苏丹埃博拉病毒标准品的扩增曲线。图中Texas Red通道扩增曲线均为 S型，说明试剂盒能够检测出苏丹埃博拉病毒RNA。
[0026] 图10显示塔伊森林埃博拉病毒标准品的扩增曲线。图中Cy5通道扩增曲线均为 S型，说明试剂盒能够检测出塔伊森林埃博拉病毒RNA。
[0027] 图11显示登革病毒I型、登革病毒II型、登革病毒III型、登革病毒IV型、乙型 脑炎病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、汉滩病毒、汉城病毒样本的扩增曲线。图 中无扩增曲线，说明该样本中不含有致病性埃博拉病毒核酸。

【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0029] 实施例1埃博拉病毒分型鉴别检测试剂盒及其使用
[0030] 1制备包括下列组成成分的试剂盒：引物探针混合液（25 μ 1/管）1管，RT-PCR反 应液（250 μ 1/管），RT-PCR反应酶系（75 μ 1/管）1管，阳性质控品（200 μ 1/管）1管，阴 性质控品（200 μ 1/ 管）1 管，DEPC H2O(2000 μ 1/ 管）1 管。
[0031] 2目的基因全长RNA的制备
[0032] 由委托公司合成并纯化4种型别全长目的基因 RNA，通过紫外分光光度仪测得浓 度，然后计算其RNA拷贝数，并将4种RNA用DEPC H2O分别稀释至I. OX 105C〇pieS/mL? I. OX 102copies/mL 的标准品。
[0033] 3实时荧光定量PCR扩增及检测
[0034] 3. 1试剂准备：按比例取相应量的引物探针混合液1 μ 1、RT-PCR反应液5 μ 1、 RT-PCR反应酶系3 μ I、DEPC H2Ol 1 μ 1，充分混匀后备用。
[0035] 3. 2加样：向PCR反应管中，分别加入阴、阳性质控品、目的基因全长RNA溶液 5 μ 1，盖紧管盖，放入仪器样品槽。
[0036] 3. 3 编辑：（ΑΒΙ Prism 7500 荧光定量 PCR 仪）
[0037] 打开Setup窗口，按对应顺序设直阴、阳性质控品和待测标本，并在Name栏中设 置样品名称。选中所有设置样品孔，双击，选择Add Detector,选择Reporter为FAM和 Quencher 为 none，再选择 Reporter 为 HEX 和 Quencher 为 none ;再选择 Reporter 为 Texas Red和Quencher为none ;然后选择Reporter为Cy5和Quencher为none后关闭窗口。在 Passive Reference中选择（none)。打开instrument窗口设置循环条件：50°C 15分钟， 95°C 15分钟；94°C 10秒，58°C 35秒，40个循环（见附图1)。所有设置完成后保存文件，运 行。
[0038] 3. 4结果分析：
[0039] 反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Ampplot窗口。选择分析的目 的样品所在位置。将Baseline数值改为start :3，stop :10，并打开manual设定Threshold : 1.5±100000。双击 Rn 坐标上数值打开 Graph settings 窗口，将 Post Run Settings 中 Log 改为 Linear，OK 后打开 Analysis preferences 窗口，在 Analysis 菜单下选择 Analyze 自动分析结果。
[0040] 实施例2应用埃博拉病毒分型鉴别检测试剂盒检测特异性样品
[0041] 选取经过病毒培养方法分别鉴定为登革病毒I型、登革病毒II型、登革病毒III 型、登革病毒IV型、基孔肯雅病毒、乙型脑炎病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、 汉滩病毒、汉城病毒阳性的血清样本各1例作为特异性样本，对所有样本进行核酸提取， PCR扩增及结果分析步骤参照实施例1进行，同时进行阴，阳性质控品的检测。
[0042] 检测结果：阴性质控品的扩增曲线不呈S型（见附图2)，阳性质控品的扩增曲线 为明显S型曲线（见附图3,4, 5,6)，阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求，因此待检标 本的检测结果是有效的。由待检标本的检测结果可知本试剂盒对登革病毒I型、登革病毒 II型、登革病毒III型、登革病毒IV型、基孔肯雅病毒、乙型脑炎病毒、发热伴血小板减少综 合征布尼亚病毒、汉滩病毒、汉城病毒无非特异扩增（见附图11)。
[0043] 本次试验中9例标本的检测结果与病毒培养鉴定结果完全吻合，说明利用本试剂 盒检测及鉴别埃博拉病毒型别是可行的。本试剂盒操作简便，检测时间短，可实现高通量检 测，加之其价格低廉，有望应用于埃博拉病毒病的临床检测、检验检疫以及疫情监测。
【权利要求】
1. 一种埃博拉病毒分型鉴别检测试剂盒，包括：1)RT_PCR反应液、引物探针混合液、 RT-PCR反应酶系、DEPC H20，阴性质控品、阳性质控品和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管 的包装盒，其中引物探针混合液由埃博拉病毒四种型特异性的正、反向引物，埃博拉病毒四 种型特异性的探针组成，其特征在于： 1) 本迪布焦埃博拉病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是 5' -TTGGAAAGTAATGCGGTAAAATA-3' 和 5' -GCAGCCAATGTTCTCTTGATGT-3'，本迪布焦埃博拉病 毒特异性探针的序列是5'-CTACTCCCTGCTGCCTCGAGTGGAAA-3'，探针的两端分别结合有荧光 发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1 ;该对引物探针可特异性地检测本迪布焦埃博拉病毒， 对其他型别埃博拉病毒无交叉反应； 2) 扎伊尔埃博拉病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是 5' -GATGCCAACGAYGCTGTGAT-3' 和 5' -TGCAAGAGGATGGAGACGAA-3'，扎伊尔埃博拉病毒特异 性探针的序列是5' -TCAGTGGCTCAAGCTCGTTTTTCAGGT-3'，探针的两端分别结合有荧光发生 基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1 ;该对引物探针可特异性地检测扎伊尔埃博拉病毒，对其他 型别埃博拉病毒无交叉反应； 3) 苏丹埃博拉病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是 5' -TGGTGITGTTGACCCGTATG-3' 和 5' -CGTCGTCCAAAITGAAGAGAT-3'，苏丹埃博拉病毒特异性 探针的序列是5' -CCTGACTACGAGGATTCGGCTGAAG-3'，探针的两端分别结合有荧光发生基团 Texas Red和荧光淬灭基团Eclipse ;该对引物探针可特异性地检测苏丹埃博拉病毒，对其 他型别埃博拉病毒无交叉反应； 4) 塔伊森林埃博拉病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是 5' -CAACAACAAACACAGTCTTACAGG-3' 和 5' -TTATCCCTGGCGTAITCTTGA-3'，塔伊森林埃博拉病 毒特异性探针的序列是5' -CTCCACACAAAACAATGACAATCCTGC-3'，探针的两端分别结合有荧 光发生基团Cy5和荧光淬灭基团Eclipse ;该对引物探针可特异性地检测塔伊森林埃博拉 病毒，对其他型别埃博拉病毒无交叉反应。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于所用探针3 '端可采用TAMRA、BHQ1、 BHQ2、Eclipse、Dabcy 1中任一荧光淬灭基团标记，所述2)中所用探针5 '端可采用VIC、 HEX、YELLOW中任一荧光基团标记，所述3)中所用探针5 '端可采用ROX、Texas Red中任一 突光基团标记，所述4)中所用探针5 '端可米用CY5、CY5. 5中任一突光基团标记。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于引物探针混合液中引物浓度均为 0. 2mmol/L，探针浓度均为 0. lmmol/L。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于RT-PCR反应液由pH值为8. 0?8. 8 的 50mmol/L Tris_HCl、3 ?8mmol/L MgCl2、150 ?350mmol/L KC1 组成。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中RT-PCR反应酶系由热启动Taq酶、逆转录酶、 dNTPs组成，特征在于每人份RT-PCR反应酶系中热启动Taq酶的用量为5?10U ;逆转录酶 用量为 1. 5 ?5U ;dNTPs 为 6 ?12mmol。
6. 根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增的条件为：50°C 15分钟，95°C 15 分钟；94°C 15秒，58°C 35秒，45个循环。
7. 根据权利要求1的试剂盒，还提供了阴性质控品和阳性质控品，其特征在于阴性质 控品为健康人血浆，阳性质控品为含有埃博拉病毒四种型别的目的基因RNA。
8.根据权利要求7的试剂盒，阳性质控品为基因合成方式制备的含四种型别埃博拉病 毒目的全长的RNA。
【文档编号】C12Q1/70GK104328216SQ201410530911
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月10日 优先权日:2014年10月10日
【发明者】周其伟, 杨海星, 李丽梅, 周阿涛, 高秀洁 申请人:中山大学达安基因股份有限公司