一种类芽孢杆菌的胞外多糖、制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种类芽孢杆菌的胞外多糖、制备方法及其应用。所述的胞外多糖的结构式如式(1)所示，其中，n＝15～30。所述的胞外多糖的平均分子量分布为2500～5000Da，聚合度为15～30，单糖组分为果糖。所述的胞外多糖的单糖组分单一，可以由保藏号为CGMCC NO.8333的类芽孢杆菌BD3526发酵后获得。所述的制备方法中的发酵操作简单易行。本发明还公开了所述的胞外多糖的提纯方法以及所述的胞外多糖体在外促进婴儿双歧杆菌增殖、体外调节成人肠道菌群的应用。
【专利说明】-种类芽孢杆菌的胞外多糖、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一种类芽孢杆菌的胞外多糖、制备方法及其应 用。
【背景技术】
[0002] 某些微生物（如乳酸菌、类芽孢杆菌、根瘤菌等）在生长代谢过程中，会分泌一类 糖类化合物到细胞壁外。其中，依附于微生物细胞壁外的多糖被称为荚膜多糖，以渗透于生 长环境中形式存在的为粘液多糖。
[0003] 微生物胞外多糖（简称EPS)不但可以拥有特殊的风味，还具有一定的降血脂、免 疫调节、抗肿瘤等功能，因此可以作为食品添加剂。而且，随着食品安全问题越来越受到消 费者的重视，如何获得来源明确、产量稳定、功能多样的新型食品添加剂（如增稠剂、乳化 齐U、稳定剂等），越来越引起研究者的重视。
[0004] 果聚糖（Levan)，由大量的果糖单元以β (2 - 6)果糖苷键连接构成聚糖主链并含 有少量β (2 - 1)果糖苷键连接的支链组成。聚合度（简称DP)较低（DP = 2?9)的果 聚糖通常称为低聚果糖，聚合度10?30的果聚糖通常称为多聚果糖，聚合度高于40的果 聚糖通常称为高聚果糖。部分微生物来源的Levan具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、免 疫增强等重要的生物活性，在医药和功能性食品方面具有巨大的应用潜能。
[0005] 目前大量获得Levan有三种方法：化学合成法、微生物发酵液提取和酶法合成。但 是，目前化学合成方法合成的Levan仅仅是β-糖苷键连接而成的三糖结构。虽然植物和 微生物都能合成Levan，但目前微生物发酵产生的Levan都是高分子量、高聚合度的，通常 为2X10 6?100X 106Da(DP远高于40)。而且，目前从微生物发酵液提取Levan产量和蔗 糖转化率一般较低，且发酵液中同时存在的其他高聚物和葡萄糖、果糖、低聚果糖等其他产 物，因而不利于Levan的规模化纯化。此外，Levan的酶法合成，需要在一定的pH、温度等条 件下进行反应，反应条件复杂，难以控制。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是克服微生物发酵产生的Levan高分子量、高聚合度 且发酵产物不利于纯化的缺陷，提供一种类芽孢杆菌的胞外多糖、制备方法及其应用。所述 的胞外多糖聚合度适中，单糖成分单一；所述的制备方法简单易行，利于对所述的胞外多糖 进行纯化。
[0007] 本发明提供一种类芽孢杆菌的胞外多糖，所述胞外多糖的结构式如式（1)所示：
[0008]
【权利要求】
1. 一种类芽孢杆菌的胞外多糖，其特征在于，所述胞外多糖的结构式如式（1)所示，
其中，η = 15?30。
2. 如权利要求1所述的胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖的平均分子量分布为 2500?5000Da ;和/或具有如下的外观：纯白色丝状物或粉末。
3. 如权利要求1所述的胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖由保藏号为CGMCC NO. 8333 的类芽抱杆菌（Paenibacillus damxungensis sp.nov.)BD3526 产生。
4. 一种制备如权利要求1?3任意一项所述的类芽孢杆菌的胞外多糖的制备方法，其 包括以下的步骤： (1) 将类芽孢杆菌CGMCC NO. 8333发酵得发酵液； (2) 将步骤（1)所得的发酵液在95?KKTC加热10?30分钟，冷却至15?25°C后， 调节pH值至4. 4?4. 8,静置3?5小时，离心取上清液，加入所述上清液体积2?4倍的 80?100 %乙醇溶液，静置过夜，离心收集沉淀物，所述的百分比为乙醇占乙醇溶液的质量 百分比； (3) 用50?80°C蒸馏水将步骤（2)所得的沉淀物溶解，获得浓度为0. 5?1. 0%的沉淀 物溶液，所述百分比为占所述沉淀物溶液的质量体积百分比，待所述溶液冷却至20?25°C 时加入三氯乙酸，使三氯乙酸最终为4%?10%，所述百分比为占所述溶液的质量体积百 分比，再静置离心获得上清液，将所述上清液经过截留分子量为IOOODa的膜透析后得到含 胞外多糖的水溶液； (4) 将步骤（3)所得的含胞外多糖的水溶液干燥后即得胞外多糖粗品。
5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述的发酵为30°C发酵72小 时；所述的发酵在液体产糖培养基中进行，所述的液体产糖培养基由10%蔗糖、1 %胰酪蛋 白胨、0. 5%酵母膏、0. 5% Κ2ΗΡ04、0. 034% CaCl2与蒸馏水组成，所述的百分比为占所述液 体产糖培养基的质量百分比； 步骤（2)所述的离心为HOOOg离心10分钟；所述的调节pH值为调节至4. 6 ;所述的 乙醇溶液为95%乙醇溶液，所述的百分比为占乙醇溶液的质量百分比；所述乙醇溶液的加 入量为所述上清液体积的3倍； 步骤（3)所述溶解为用60°C蒸馏水将步骤（2)所得的沉淀物溶解，获得浓度为0. 8% 的沉淀物溶液，所述百分比为占所述沉淀物溶液的质量体积百分比，待所述溶液冷却至 25°C时加入三氯乙酸，使三氯乙酸最终为4%，所述百分比为占所述溶液的质量体积百分 比；或者， 步骤（4)所述的干燥为真空冷冻干燥；较佳地，为0. 160mBar，-30°C条件下真空冷冻干 燥72小时。
6. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括以下的步骤： (5) 将步骤（4)制得的胞外多糖粗品溶于0. 05mol/L，pH7. 60的Tris-HCl缓冲液中，配 成溶液，经DEAE-Sepharose FF柱子层析；依次用所述Tris-HCl缓冲液和含0. 2?I. 2mol/ L NaCl的所述Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱，流速为2?6mL/min，于490nm波长处测吸 光度，以吸光度对应的管号作图，得洗脱曲线A ; (6) 将步骤（5)得到的洗脱曲线A中单峰所对应的透析过的水溶液收集，用水透析，干 燥，得到胞外多糖组份B ; ⑵将步骤（6)得到的胞外多糖组份B，溶于所述的Tris-HCl缓冲液中，配成溶液，上 DEAE-Sepharose CL-4B离子交换柱进行层析；用含0. 2?I. 2mol/L NaCl的所述Tris-HCl 缓冲液洗脱，流速为2?6mL/min，于490nm波长处测吸光度，以吸光度对应的管号作图，得 洗脱曲线B ; (8)将步骤（7)获得的洗脱曲线B中单峰所对应的透析过的水溶液收集，用水透析，干 燥，即可。
7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（5)中，将制得的胞外多糖粗 品50?200mg溶于0· 05mol/L，ρΗ7· 60的Tris-HCl缓冲液中，配成5?20mg/mL的溶 液；步骤（5)中所述的流速为3mL/min;步骤（5)中所述的DEAE-Sepharose FF柱子为 DL 6 X IOOcm ;步骤（7)中，将制得的胞外多糖粗品50?200mg溶于所述的Tris-HCl缓冲 液中，配成5?20mg/mL的溶液；步骤（7)中所述的流速为3mL/min ;或者，步骤（7)中所述 的 DEAE-Sepharose FF 柱子为 DL 6 X 100cm。
8. 如权利要求1?3任一项所述的胞外多糖在促进双歧杆菌增殖中的应用。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的双歧杆菌为短双歧杆菌（B. breve)。
10. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的双歧杆菌是人体肠道菌群中的双歧 杆菌。
【文档编号】C12R1/01GK104231106SQ201410535126
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年10月11日 优先权日:2014年10月11日
【发明者】吴正钧, 郭本恒, 高彩霞, 刘振民, 徐晓芬, 韩瑨 申请人:光明乳业股份有限公司