一种高热稳定性的内切木聚糖酶及其应用的制作方法【专利摘要】本发明公开了一种高热稳定性的内切木聚糖酶。本发明通过对来源于嗜热微生物的木聚糖酶DtX进行改造，去除了信号肽，实现了木聚糖酶基因在异源宿主细胞如大肠杆菌内的高效表达。本发明进一步对该木聚糖酶进行改造，截去了C端的碳水化合物结合结构域，并在C末端引入二硫键，构建的木聚糖酶蛋白突变体的分子量更小，热稳定性提高，比活力也大大提高。通过以上方式，使该木聚糖酶及其突变体更有潜力应用于工业生产。【专利说明】一种高热稳定性的内切木聚糖酶及其应用【
技术领域：
】[0001]本发明属于酶的基因工程领域，涉及一种木聚糖酶，尤其涉及一种高热稳定性的内切木聚糖酶以及生产该高热稳定性内切木聚糖酶的基因工程菌。【
背景技术：
】[0002]木聚糖酶（Xylanase，EC.3.2.1.8)是木聚糖降解酶系中最关键的酶，常被用于饲料、食品、饮料、制药、造纸工业和生物能源等方面（Beg,Q.K.Kapoor,M.Mahajan,L.Hoondal,G.S(2001)Microbialxylanasesandtheirindustrialapplications:areview.ApplMicrobiolBiotechnol.56(3-4):326-338)。尤其在造纸工业，木聚糖酶在纸浆的预漂白、二次纤维的脱墨等过程中，水解凝结于纤维表面的半纤维素，提高漂白剂在纸浆中的扩散速度，提高漂白效率，减少氯的使用量，从而减少漂白过程对环境的污染(LiisaViikari,AnneKantelinen,JormaSundquist,MattiLinko(1994)Xylanasesinbleaching:Fromanideatotheindustry.FEMSMicrobiologyReviews.13(2-3):335-350)。[0003]目前，研究报道的大多数木聚糖酶的最适温度都在45_55°C，其稳定性都比较差(Haki,G.(2003)Developmentsinindustriallyimportantthermostableenzymes:areview.BioresourTechnol.89(I):17-34)。随着木聚糖酶的不断开发和利用，对酶的稳定性要求越来越高，而现有的商品化木聚糖酶大多数是从中温微生物中获得的，热稳定性差，在60°C以上很容易丧失催化活性，不能满足工业应用的需要。[0004]DictyoglomusturgidumDSM6724(以下简称D.turgidumDSM6724)是一株于1990年在俄国堪察加半岛的乌宗火山分离的菌株，是一种嗜高温、厌氧的新型化能自养型微生物，最适生长温度高达80°C(Svetlichnii，V.A.，Svetlichnii，T.P.(1988)Dictyoglomusturgidussp.nov.,anewextremelythermophiliceubacteriumisolatedfromhotspringsoftheUzonvolcanocaldera.Mikrobiologiya,57:435-441)〇其基因组测序已在2008年完成（GenBankaccessionno.NC_011661).D.turgidumDSM6724能够高效利用多种糖类作为碳源，利用糖基水解酶基因搜索，其基因组中包含54个糖类水解基因（Brumm,P.Hermanson,S.Hochstein,B.Boyum,J.Hermersmann,N.Gowda,K.Mead,D.(2011)MiningDictyoglomusturgidumforenzymaticallyactivecarbohydrases.163(2):205-14)。其中，包含三个木聚糖基因。目前，这些木聚糖酶还没有被研究和利用。本发明涉及其中一个木聚糖酶（GeneID:217966449)基因，即DtXynllA(以下简称DtX)。由于原始菌株的最适生长温度高达80°C，预测该基因编码的木聚糖酶可能具有良好的热稳定性。[0005]但是利用野生型菌产酶所要求的培养条件苛刻。另外，野生型菌株产酶水平非常低，是细菌的千分之一以下。此外，野生型菌株所产的酶系复杂，无法直接应用，而且目的酶的纯化困难。应用蛋白质工程技术对天然基因进行改造，可以突破自然进化的限制，获得针对工业用途特定设计的、具有优良性质的人工酶基因。【
发明内容】[0006]有鉴于现有技术的上述缺陷，且又由于在实验中发现重组菌中天然的木聚糖酶DtX表达量很低，而且很难纯化，本发明所要解决的技术问题是改造高热稳定性的木聚糖酶基因，使其在表达系统内高效表达，同时简化目的酶的纯化步骤，并对目的酶进行改造，进一步提高其催化效率与热稳定性，以满足工业应用的需求。[0007]为实现上述目的，本发明提供了一种基因工程木聚糖酶的制备方法，包括以下步骤：[0008]1)构建目的蛋白基因；[0009]2)构建基因工程菌并表达目的蛋白；[0010]3)纯化目的蛋白。[0011]对于步骤1)，所述目的蛋白基因可以为木聚糖酶DtX的全基因，其序列见序列表SEQIDNO:1，其蛋白序列见序列表SEQIDNO:2。本发明利用SignalP3.0软件对目的蛋白的氨基酸序列进行分析，木聚糖酶DtX的N末端存在一段含28个氨基酸的信号肽。信号肽的存在可能影响目的蛋白的表达。为此，应用分子生物学工具在DtX上去除了信号肽基因，重新构建了不含信号肽的目的蛋白基因，其基因序列为SEQIDNO:3,蛋白序列为SEQIDN0:4。[0012]进一步地，通过NCBIBlastp对DtX基因全长序列进行分析，得出该蛋白由两个结构域构成，包括N端的催化结构域（CatalyzeDomain,⑶）和C端的碳水化合物结合结构域(CarbohydrateBindingModule,CBM)，两个结构域由一段柔性的连接肽（Linker)相连。其中，其催化结构域属于糖苷水解酶11家族（GHll)，碳水化合物结合结构域属于CBM第36家族（CBM36)。但是，仅仅根据NCBIBlastp的结果，很难界定⑶的C-末端和CBM的N-末端，即Linker区域的起始和终止。为此，我们分别搜集收集了大量关于GHll和CBM36家族的蛋白质序列和结构。通过MEGA软件进行序列比对，利用Pymol软件进行结构比对分析，最终确定1-201位的区域为催化结构域CD(编号是从去除信号肽的蛋白的第一个氨基酸开始），202-211的区域为Linker，212-328的区域为CBM。通过DiscoveryStudio3.0软件进行同源建模，得到DtX的结构模型（如图1所示）。[0013]我们预测CBM仅影响木聚糖酶与纤维素的结合能力，对底物特异性、酶活性中心、米氏常数和可溶性木聚糖的水解能力无明显影响。而linker的功能还不清楚，但小分子量的酶蛋白分子在反应体系中更易于扩散，应该具有更强的应用优势。为此，根据对DtX的基因序列分析结果构建了截去CBM结构域的突变体基因，我们设计了的两个截短突变体，分别是DtX-CDL(基因序列为SEQIDN0:5,蛋白序列为SEQIDN0:6)和DtX-CD(基因序列为SEQIDN0:7,蛋白序列为SEQIDN0:8)。[0014]为了进一步提高木聚糖酶的热稳定性，可以在木聚糖酶C末端引入相互作用，如氢键、离子键、二硫键等。本发明在Dtx-CD的基础上，利用Disulfidebydesign软件，对DtX-CD的结构模型进行计算分析，筛选出两处可以引入二硫键的合理位置分别在DtX-CD中引入二硫键，构建了突变体DtX-⑶Sl(基因序列为SEQIDN0:9,蛋白序列为SEQIDNO:10)和DtX-CDS2(基因序列为SEQIDNO:11，蛋白序列为SEQIDNO:12)。[0015]对于步骤2)，重组基因的载体优选为质粒pET28a，构建的重组质粒pET28a-DtXynllA的结构如图2所示，除此以外也可以将木聚糖酶基因整合在宿主细胞基因组上进行表达。[0016]以上述各天然或重组基因构建基因工程菌，使各基因可以在宿主菌中高效表达，所述宿主菌可以为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、丝状真菌等，优选为大肠杆菌。在此基础上，通过在重组目的蛋白（包括去除信号肽的DtX及其截短突变体和含二硫键的截短突变体）的N端引入His-tag，不仅可以保护目的蛋白的N-末端，使得目的蛋白的表达量提高2倍，而且还有利于后续纯化。[0017]对于步骤3)，具体方法为将发酵后收获的大肠杆菌菌体悬液超声破碎后，放置于55-65°C热处理20-30分钟，沉淀大量杂蛋白，此时DtX的纯度已达到80%以上，再经过一步Ni-NTA亲和层析处理后就能得到95%以上纯度的目的蛋白。[0018]在本发明的实施例中，将DtX及其两个截短突变体DtX-⑶L和DtX-⑶以及含二硫键的截短突变体DtX-⑶Sl和DtX-⑶S2的热稳定性进行比较（结果如表1所示）。包括T_(最适反应温度）、t1/2(-定温度下，蛋白质活性损失一半时所需要的时间）、T5(I(-定时间内，蛋白质活性损失一半时所需要的温度）等动力学稳定性参数以及通过差示热量扫描仪（differentialscanningcalorimetry,DSC)测定的蛋白质解折叠50%时的温度（Tm)这一热动力学稳定性参数。[0019]最适温度比较：DtX为78?82°C;DtX-CDL为85?87°C;DtX-CDSl和DtX-CDS2为83?85°C;DtX-CD为80?82°C。与DtX比较，DtX-CD的最适温度有一定的提高，DtX-CDL，DtX-CDSl和DtX-CDS2的最适温度明显提高。[0020]从图7的85°C时的热稳定性可以看出，DtX-CDL和DtX-CD的热稳定性明显高于DtX。从表1的具体数据可见，DtX的半衰期t1/2为8.54h;DtX-CD的t1/2为62.45h，为DtX的7.3倍；DtX-CDL的稳定性最好，t1/2为77.63h;DtX-CDSl和DtX-CDS2的热稳定性相对于DtX-CD有一定的提高，t1/2分别为68.14h和70.02h。[0021]T5Q(3C0的比较结果显示，DtX为82.51°C;DtX-CDL为91.2°C;DtX-CD为89.7°C;DtX-CDSl和DtX-CDS2的T5Q(XI)均为91°C左右，都高于DtX大约8.5°C。[0022]该结果与DSC所检测的Tm结果一致（图8)，DtX有两个结构域，故Tml=92.86°C，Tni2=75.46°C;DtX-CDL为94.58°C;DtX-CD为94.18°C;DtX-CDSl和DtX-CDS2的T111相对于DtX-CD提高了约0.6°C。[0023]由于DtX、DtX-CDL、DtX-CD、DtX-CDSl和DtX-CDS2分子量存在差异，我们将比活力定义为每Umol木聚糖酶所含的酶活力（U/ymol)。表1的数据显示，DtX-⑶L的比活力最高，高于DtX-CD，说明linker的存在有助于提高酶的活力，推测因为DtX-CDL的最适温度和热稳定性的提高。DtX比活力反而最低，可能CBM的存在不利于酶的催化水解。DtX-CDSl和DtX-⑶S2相对于DtX-⑶活力略有提高，二硫键的引入并没有破坏DtX-⑶原有的催化活性。从DtX、DtX-CDL、DtX-CD、DtX-CDSl和DtX-CDS2的比较可以看出，C末端对酶的热稳定性有较大影响，稳定该区域可能提高酶的热稳定性。[0024]通过以上技术方案的实现，本发明具有以下优点：[0025](1)在极端嗜热菌中获得新型内切木聚糖酶，比常规的中温菌中获得的内切木聚糖酶具有更强的热稳定性与高温催化活性。[0026](2)通过对编码木聚糖酶的基因片段去除信号肽和引入N末端组氨酸尾，可以在异源宿主细胞如大肠杆菌内进行木聚糖酶基因的高效表达。[0027](3)目的蛋白木聚糖酶的表达水平高，且纯化方便。[0028](4)构建的木聚糖酶蛋白突变体的分子量更小，热稳定性提高，比活力也大大提商。[0029]以上优点使得木聚糖酶及其截短突变体更有潜力应用于食品、造纸、饲料等行业的工业生产中。[0030]以下将结合附图对本发明的构思、【具体实施方式】及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。【专利附图】【附图说明】[0031]图1是DtX的结构模型；[0032]图2是重组质粒pET28a_DtXynllA的构建图；[0033]图3是DtX的酶学性质表征：最适温度曲线；[0034]图4是DtX的酶学性质表征：热稳定性曲线；[0035]图5是DtX的酶学性质表征：最适pH曲线；[0036]图6是DtX的酶学性质表征：pH稳定性曲线；[0037]图7是DtX及其截短突变体和含二硫键的截短突变体的85°C热稳定性比较图；[0038]图8是DtX及其截短突变体和含二硫键的截短突变体的DSC曲线图。【具体实施方式】[0039]以下结合具体实施例，对本发明进行进一步阐述。[0040]实施例1、D.turgidumDSM6724菌株的培养和保存[0041]按照DSMZ的配方，配置厌氧培养基（anaerocellummedium)，分装于厌氧试管中，每管5ml，培养基封闭后用真空泵将试管中的空气抽干，并充入一定量的氮气和二氧化碳的混合气体（80%N2和20%CO2)，在厌氧箱中用培养基Iml溶解购买于DSMZ的D.turgidumDSM6724,按照1%的接菌量接种于5ml试管中，混匀，80°C静置培养数天，直至细菌开始生长起来。然后转移至装有IOOml培养基的锥形瓶中80°C培养数天，-80°C保存菌体。[0042]实施例2、基因组DNA的提取[0043]取5ml小试管培养的D.turgidumDSM6724,用北京普博欣生物技术有限责任公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒（BacteriaGenomicMiniPreparationKit)提取细菌的基因组，所得基因组DNA溶液放4°C冰箱备用。[0044]实施例3、目的基因的克隆[0045]以GenBank报道的D.turgidumDSM6724DtX(GeneID:217966449)基因序列（即SEQIDNO:1)为模板，用01ig〇7.0设计两条特异性引物，通过PCR技术获得目的基因。引物如下：[0046]Pl:5'-TCAGCCATGGGCATGTTTAAAGTGTA-3'(下划线标注的为NcoI的酶切位点）[0047]P2:5'-GTGCCAAGCTTCTATTGTATTTCTAA-3'(下划线标注的为HindIII的酶切位点）[0048]将目的基因与载体进行NcoI和HindIII双酶切处理，体系如下，[0049]【权利要求】1.一种基因工程木聚糖酶，其特征在于，其基因序列为SEQIDN0:3,蛋白序列为SEQIDN0:4。2.-种基因工程木聚糖酶，其特征在于，其是DtX酶截去了C端的碳水化合物结合结构域之后的突变体。3.如权利要求2所述的基因工程木聚糖酶，其特征在于，其基因序列为SEQIDNO:5，蛋白序列为SEQIDN0:6;或基因序列为SEQIDN0:7,蛋白序列为SEQIDN0:8。4.一种基因工程木聚糖酶，其特征在于，其是DtX酶截去了C端的碳水化合物结合结构域之后，又在C末端引入相互作用的突变体。5.如权利要求4所述的基因工程木聚糖酶，其特征在于，所述引入的相互作用为二硫键。6.如权利要求5所述的基因工程木聚糖酶，其特征在于，其基因序列为SEQIDN0:9，蛋白序列为SEQIDNO:10;或基因序列为SEQIDNO:11，蛋白序列为SEQIDNO:12。7.-种制备基因工程木聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建目的蛋白基因；2)构建基因工程菌并表达目的蛋白；3)纯化目的蛋白；其中，步骤1)中目的蛋白基因为SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9或SEQIDN0:11。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)在构建基因工程菌时，在重组目的蛋白的N端引入His-tag。9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3)的具体方法为将发酵后收获的宿主菌菌体悬液超声破碎后，放置于55-65°C热处理20-30分钟，沉淀大量杂蛋白，再经过一步Ni-NTA亲和层析处理后得到目的蛋白。10.如权利要求1-6所述的基因工程木聚糖酶在工业生产中的应用。【文档编号】C12N9/42GK104293748SQ201410535145【公开日】2015年1月21日申请日期:2014年10月11日优先权日:2014年10月11日【发明者】冯雁,杨广宇,吴秀娟,安娇,于瑶,王慧楠,张少博申请人:上海交通大学