CemGPDH基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种CemGPDH基因及其在提高细胞脂肪酸含量方面的用途，所述CemGPDH基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。该基因来源于椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，编码甘油-3-磷酸脱氢酶。甘油-3-磷酸脱氢酶(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPDH)催化合成的甘油-3-磷酸(Glycerol-3-phosphate，G3P)是合成三酰甘油(TAG)的重要原料，该酶参与了线粒体G3P穿梭，为呼吸链提供电子，是G3P合成的关键酶，也是连接糖代谢和脂代谢的关键酶之一，对植物体内油脂合成和能量代谢有重要作用。利用本发明的基因转化酵母细胞、植物细胞和微藻细胞能显著提高细胞的总脂肪酸含量。
【专利说明】CemGPDH基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种甘油-3-磯酸脱氨酶基因GPDH及其应用。具体地，涉及该基因序 列的获得和酵母表达载体的构建，W及其显著提高酵母脂肪酸含量方面的用途。
【背景技术】
[0002] 目前，随着传统能源的过度消耗和日益增长的能源需求，能源问题日益严峻，可替 代能源的研究和开发成为全球学者关注的热点。生物柴油主要W大豆、麻疯树等油料作物、 废弃的厨余油脂、动物性脂肪W及基因工程改造过的微藻作为原材料加工成液体燃料，是 可W替代传统石油燃料的优质新型可再生能源。而微藻由于含油量高，易于培养，单位±地 油脂产量远高于其他油料作物，被认为是最有潜力的能源资源之一。
[0003] 微藻繁殖能力强，对生长环境要求低，易于培养，光合作用效率高，含油量高，但目 前微藻油脂代谢途径中关键酶基因的研究还相对较少小球藻（化Iorella)是微藻中 的一类，属于绿藻口小球藻属，是光合自养型球形单细胞绿藻，直径大约3-8微米。小球藻 繁殖能力很强，含有丰富的营养元素，例如蛋白质、油脂、多不饱和脂肪酸、维生素、矿物质、 食物纤维、核酸及叶绿素等，还含有多种生物活性物质，例如糖蛋白、多糖。小球藻是少数几 个可用于大规模培养的微藻。
[0004] 真核生物（例如小球藻）中，油脂的主要储存形式是H醜甘油（TAG),由甘 油-3-磯酸（G3巧和脂醜辅酶A为前体合成。甘油-3-磯酸脱氨酶（Glycero^3-phosphate dehy化Ogenase，GPD巧催化糖酵解过程中产生的磯酸二轻丙丽（Dihy^oxyacetone phosphate, DHAP)与G3P之间的相互转变，产物G3P是合成TAG的重要原料，因此，GPDH是 连接糖代谢和脂代谢的关键酶。
[0005] G3P是由甘油磯酸化而来，在植物中，淀粉通常作为光合作用的终产物被储存起 来，甘油的主要来源是通过将淀粉分解的葡萄糖送入糖酵解过程，将糖酵解中间产物转化 为甘油。而在微藻中，有些种类的微藻在积累淀粉的同时会产生大量的甘油，作为光合作 用的终产物储存起来W。因此，在微藻中，主要有两条不同的甘油合成途径，其一是利用光 合作用直接合成甘油，另一条是通过分解储藏物质，将淀粉及藏糖分解成为6-磯酸果糖， 后转变为DHAP，再由甘油-3-磯酸脱氨酶催化，生成G3P，最后通过去磯酸化作用生成甘油 。从微藻GPDH在油脂合成代谢中的位置上来看，GPDH所催化的由DHAP转变为G3P的 反应是甘油合成途径的关键步骤，GPDH参与了线粒体G3P穿梭，为呼吸链提供电子，是G3P 合成的关键酶之一，而G3P是TAG和磯脂合成的重要原料，并且GPDH连接了糖代谢和脂代 谢，对植物体内油脂合成和能量代谢有重要作用。
[0006] 根据GPDH在细胞内位置不同，将其分为S种类型同工酶一细胞质型 GPDH(CtGPDH)，叶绿体型GPDH (cpGPDH)和线粒体型GPDH (mGPDH)。每种同工酶在细胞内偏 好催化DHAP与G3P之间相互转变的正反应或逆反应，辅酶类型不同（W FAD或NADH/NADPH 作为辅酶），受不同条件诱导表达（渗透胁迫、热激、油酸胁迫等），并且在不同物种中目前 已发现的GPDH同工酶数量不同?。
【发明内容】
[0007] 本发明发现将来源于楠圆小球藻的CemGP畑基因转入酿酒酵母INVSCl后，可显著 提高其主要脂肪酸组分的含量。在INVScI主要的四种脂肪酸组分中，踪搁酸（C16:0)和 硬脂酸佑18:0)含量变化不显著，踪搁油酸（(：16:1)提高了15.57%，油酸（(：18:1)提高了 13. 53%。酵母细胞总脂肪酸的含量也提高了约10.07%。已有物种GPDH基因的研究基本 都选择了酵母GPDH突变体来对其进行互补功能验证，甚少有用野生型酵母的。本发明选择 野生型酵母在对楠圆小球藻GPDH基因进行功能验证的同时还发现了其对油脂合成的显著 作用。在酵母中研究表明，CemGPDH基因转酵母株与对照组（转空载）相比，总脂肪酸含量 提高了约10. 07%，且其部分主要脂肪酸组分的含量也有明显提高，其中踪搁酸（C16:0)和 硬脂酸佑18:0)含量变化不显著，踪搁油酸（(：16:1)提高了15.57%，油酸（(：18:1)提高了 13. 53%。酵母细胞总脂肪酸的含量也提高了约10. 07%。单个基因使得总脂肪酸及各不同 脂肪酸的含量达到该种程度的实属少见。
[0008] 本发明提供了一个GPDH基因，其CDNA核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示，该个基因 来源于楠圆小球藻，该基因CDNA全长为1857bp。
[0009] 本发明还提供了含本发明所述基因（CemGPDH)的酵母表达载体。
[0010] 本发明在一个方面提供了包含本发明所述基因的酵母、植物或藻类，其选自酵 母，藻类，拟南芥、烟草、油菜、向日葵、大豆、當麻、棉花、橄揽、和红花等。优选地，所述藻 类选自小球藻。更具体地，所述酵母选自酿酒酵母，小球藻选自楠圆小球藻（化Iorella ellipsoidea)。
[0011] 本发明提供的楠圆小球藻GPDH基因，可应用于利用基因工程方法提高酵母、植物 或藻类油脂等方面。
[0012] 更具体地，本发明提供W下各项：
[001引 1. CemGPDH蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0014] 2.编码根据1所述的CemGPDH蛋白的基因。
[0015] 3.根据2所述的基因，其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0016] 4.载体，其包含根据2或3所述的基因，所述载体可W通过将根据2或3所述的基 因转入到 PYES2. 0(可购自 Invitrogen 公司），pBIN19、地I121、pBI221(可购自 Clontech), pCambial300(可购自 Gambia 公司）或 pGreen(可购自 the John Innes Centre)中来制 备。
[0017] 5.宿主细胞，其包含根据1所述的CemGPDH蛋白、根据2或3所述的基因或根据4 所述的载体。
[0018] 6. -种制备具有高踪搁油酸和/或油酸含量，或具有高总脂肪酸含量的酵母、植 物或藻类的细胞的方法，所述方法包括将根据2或3所述的基因或根据4所述的载体转入 所述酵母、植物或藻类的细胞中，所述酵母优选是酿酒酵母，更优选是尿嚼巧缺陷型酿酒酵 母INVSCl ;所述藻类优选是小球藻，更优选是楠圆小球藻烟ilorella ellipsoidea);所述 植物优选选自拟南芥、烟草、油菜、向日葵、大豆、番茄、當麻、棉花、芝麻或花生。
[0019] 7.根据1所述的CemGPDH蛋白、根据2或3所述的基因或根据4所述的载体在 制备具有高总脂肪酸含量的酵母、植物或藻类的细胞中的用途，所述酵母优选是酿酒酵母， 更优选是尿嚼巧缺陷型酿酒酵母INVSCl ;所述藻类优选是小球藻，更优选是楠圆小球藻 烟ilorella ellipsoidea);所述植物优选选自拟南芥、烟草、油菜、向日葵、大豆、番茄、當 麻、棉花、芝麻或花生，所述具有高总脂肪酸含量的酵母、植物或藻类的细胞优选是具有高 踪搁油酸和/或油酸含量的酵母、植物或藻类的细胞。
[0020] 8.根据1所述的CemGPDH蛋白、根据2或3所述的基因或根据4所述的载体在提 高酵母、植物或藻类的细胞中踪搁油酸和/或油酸含量，或总脂肪酸含量中的用途，所述酵 母优选是酿酒酵母，更优选是尿嚼巧缺陷型酿酒酵母INVSCl ;所述藻类优选是小球藻，更 优选是楠圆小球藻烟ilorella ellipsoidea);所述植物优选选自拟南芥、烟草、油菜、向日 葵、大豆、番茄、當麻、棉花、芝麻或花生。
[0021] 9.利用根据6所述的方法制备的具有高踪搁油酸和/或油酸含量，或具有高总脂 肪酸含量的酵母、植物或藻类的细胞。
[0022] 10.根据9所述的酵母、植物或藻类的细胞在生产生物柴油中的用途。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1.含楠圆小球藻CemGPDH基因的酵母表达载体的构建。
[0024] 图2. GC-MS法测定的酵母各脂肪酸组分含量W及总脂肪酸含量（CK为对照， pYES-GPDH为转CemGPDH基因的酵母脂肪酸测定）。
【具体实施方式】
[0025] 下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可W理解的是， 下述实施例是举例说明的目的，其不应W任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护 范围由后附的所限定。
[0026] 实施例1.楠圆小球藻CemGPDH基因CDNA全长的获得
[0027] 取培养3-4天的对数生长期楠圆小球藻（来自于中国科学院水生生物研究所）藻 液，离也收集藻体后置于液氮中充分研磨。参照艾德莱EASYspin RNA提取试剂盒说明书及 Takara面ase I说明书进行总RNA提取和纯化。W带POlyT的引物进行逆转录获得cDNA， 并进行RT-PCR (具体操作见TOYOBO ReverTra Ace- a试剂盒）。
[002引 cDNA的合成反应条件如下：
[0029]
【权利要求】
1. CemGPDH蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2. 编码根据权利要求1所述的CemGPDH蛋白的基因。
3. 根据权利要求2所述的基因，其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
4. 载体，其包含根据权利要求2或3所述的基因。
5. 宿主细胞，其包含根据权利要求1所述的CemGPDH蛋白、根据权利要求2或3所述的 基因或根据权利要求4所述的载体。
6. -种制备具有高棕榈油酸和/或油酸含量，或具有高总脂肪酸含量的酵母、植物 或藻类的细胞的方法，所述方法包括将根据权利要求2或3所述的基因或根据权利要求4 所述的载体转入所述酵母、植物或藻类的细胞中，所述酵母优选是酿酒酵母，更优选是尿 嘧啶缺陷型酿酒酵母INVSC1 ;所述藻类优选是小球藻，更优选是椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea);所述植物优选选自拟南芥、烟草、油菜、向日葵、大豆、番爺、菌麻、棉花、芝麻 或花生。
7. 根据权利要求1所述的CemGPDH蛋白、根据权利要求2或3所述的基因或根据权利 要求4所述的载体在制备具有高总脂肪酸含量的酵母、植物或藻类的细胞中的用途，所述 酵母优选是酿酒酵母，更优选是尿嘧啶缺陷型酿酒酵母INVSC1 ;所述藻类优选是小球藻， 更优选是椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea);所述植物优选选自拟南芥、烟草、油菜、向 日葵、大豆、番茄、蓖麻、棉花、芝麻或花生，所述具有高总脂肪酸含量的酵母、植物或藻类的 细胞优选是具有高棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和/或油酸含量的酵母、植物或藻类的细胞。
8. 根据权利要求1所述的CemGPDH蛋白、根据权利要求2或3所述的基因或根据权利 要求4所述的载体在提高酵母、植物或藻类的细胞中棕榈油酸和/或油酸含量，或总脂肪酸 含量中的用途，所述酵母优选是酿酒酵母，更优选是尿嘧啶缺陷型酿酒酵母INVSC1 ;所述 藻类优选是小球藻，更优选是椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea);所述植物优选选自拟 南芥、烟草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、棉花、芝麻或花生。
9. 利用根据权利要求6所述的方法制备的具有高棕榈油酸和/或油酸含量，或具有高 总脂肪酸含量的酵母、植物或藻类的细胞。
10. 根据权利要求9所述的酵母、植物或藻类的细胞在生产生物柴油中的用途。
【文档编号】C12N1/13GK104357415SQ201410547380
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】胡赞民, 张丹, 李帅, 范成明, 陈宇红 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所