一种快速高通量筛选采油微生物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速高通量筛选采油微生物的方法，属于微生物采油【技术领域】。方案一：(1)将采集的油样或水样稀释涂布在LB固体培养基上，在温度35～40℃下培养10～14小时；(2)挑取微生物单菌落并接种到无机盐培养基中，再加入含有染料的液体石蜡，在温度35～40℃下培养4～48小时，观察若有石蜡降解现象或排油圈产生，则微生物为石蜡降解菌或生物表面活性剂产生菌；方案二：(1)同方案一；(2)挑取微生物单菌落并接种到LB液体培养基中，发酵培养后去除菌体得清液，在清液中加入染料；(3)在植物油中间加入含有染料的清液，静置，观察若植物油扩散，则微生物为生物表面活性剂产生菌。
【专利说明】一种快速高通量筛选采油微生物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种快速高通量筛选采油微生物的方法，属于微生物采油【技术领域】。
【背景技术】
[0002]微生物采油是当今国内外石油工程领域中研究较多、技术含量较高的一种提高采收率技术，其主要机理就是通过采油微生物在油层中的生长、繁殖和代谢等生物化学过程，还包括微生物菌体、微生物营养液、微生物代谢产物在油层中的运移，与油藏中的岩石、油、气、水的相互作用而引起的岩石、油、气、水物性的改变。微生物采油施工简单、成本低，是一种廉价有效的采油技术，有望成为未来油田开发后期稳油控水、提高采收率的主要技术之一。近年来，在国家高科技项目计划的支撑下，微生物采油技术取得一系列的进展，包括微生物功能菌群采油机理、新型培养技术、营养源的筛选、注采配套工艺技术、现场监测和效果评价技术等方面。并针对高含水、水驱稠油等油藏，展开了大量的矿场试验，大部分试验区已经见到了明显的降水增油效果。实施微生物采油的某区块为水驱稠油油藏，综合含水92%，驱油效果差。开展微生物驱油试验后对应油井生产动态得到明显改善，其中某对应生产井产量由试验前的每天3吨上升至15吨，含水由94%下降至79%，已经累计增油达
12.5X 14吨，取得了较大的经济效益。
[0003]对油藏微生物的筛选是取得微生物采油技术成功的第一步，也是能否筛选到功能高效的采油菌种最重要的一步。传统的人工纯培养方法通常为:利用常规的培养条件和富集培养基将微生物从油水样品中分享出来，通过对分离菌株进行种类鉴别、计数和功能测试来了解油藏微生物的理化性质。但是这种方法效率低下，一个周期一般耗时I?3周，仅能培养极少数的微生物(0.01?1% )，而且由于人工培养条件的选择性，检测到的微生物也是选择和富集后的结果，并不能完全准确地筛选出高效率的采油功能菌，也无法高效地提高原油采收率。
[0004]现代分子生物学的微生物筛选分析方法，突破了纯培养的瓶颈，能从分子水平上较客观的提示环境微生物的多样性，尤其是近年来在油藏微生物群落研究中的应用发展迅速，促进了对油藏微生物多样性的认识，成为分析油藏微生物群落结构的新工具。目前，测定分析油藏微生物群落结构的方法主要包括:16SrDNA基因序列分析、变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis/Temperature Gradient GelElectrophoresis,DGGE/TGGE)和末端限制性片段长度多态性技术(Terminal Restrict1nFragment Length Polymorphism, T-RFLP)等。测定群落功能的方法主要有:实时定量PCR 技术(Real-time Quantitative PCR)、突光原位杂交技术(Fluorescence in situHybridizat1n, FISH)、基因芯片技术(Geochip)和放射性同位素标记(Rad1graphy)等。
[0005]常用的快速筛选微生物技术主要包括:螺旋平板计数法、滤膜法、纸片法，以及ATP法、电化学法、颜色变化、流式细胞技术、激光扫描技术、热量法和放射测量法，还有在基因芯片基础上的微流控技术，但是这些快速检测微生物的技术绝大部分应用于食品、药品及化妆品检验领域中，在样品成分含量较复杂的油藏微生物检测中，应用还具有相当的局限性。虽然现代分子生物学的应用，极大的丰富了对油藏微生物遗传信息的认识，但是其最大的缺陷是无法快速筛选可培养的功能采油菌并可满足矿场试验的要求，而且所需要的仪器和试剂相对精细且昂贵，操作人员需要经过专业的培训并具有扎实的生物学基础知识，对于油田一般的下属单位难以满足硬件和软件的匹配条件。
[0006]因此，开发出一种快速实用、可以高通量检测采油微生物的方法，使用更简便的仪器、不需要太多的试剂、成本低廉、再生性强、功能定性，易于大面积推广的方法是目前迫切需要解决的技术关键。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种快速高通量筛选采油微生物的方法。
[0008]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是:
[0009]一种快速高通量筛选采油微生物的方法，采用方案一或方案二:
[0010]方案一:
[0011](I)将采集的油样或水样稀释涂布在LB固体培养基上，在温度35?40°C下培养10?14小时；
[0012](2)挑取微生物单菌落并接种到无机盐培养基中，再加入含有染料的液体石蜡，在温度35?40°C下培养4?48小时，观察若有石蜡降解现象或排油圈产生，则微生物为石蜡降解菌或生物表面活性剂产生菌；
[0013]方案二:
[0014](I)将采集的油样或水样稀释涂布在LB固体培养基上，在温度35?40°C下培养10?14小时；
[0015](2)挑取微生物单菌落并接种到LB液体培养基中，发酵培养后去除菌体得清液，在清液中加入染料；
[0016](3)在植物油中间加入含有染料的清液，静置，观察若植物油扩散，则微生物为生物表面活性剂产生菌。
[0017]所述方案一中LB固体培养基的组成为:胰蛋白胨5?15g/L、酵母提取物3?1g/L、NaC15?15g/L、琼脂15?20g/L，余量为水，pH7.0?7.5。优选组成为:胰蛋白胨1g/L、酵母提取物5g/L、NaC110g/L，琼脂18g/L，余量为水，pH7.0?7.2。
[0018]所述方案一中无机盐培养基的组成为:葡萄糖5?15g/L、NH4NO30.5?2g/L、NaCl0.5 ?2g/L、CaCl20.1 ?1.0g/L、K2HPO4.12Η200.I ?1.5g/L、KH2PO40.1 ?-0.5g/L、FeCl20.01 ?0.05g/L、MgS04.7Η200.01 ?0.05g/L，余量为水，ρΗ7.0 ?7.5。优选组成为:葡萄糖 10g/L、NH4NO31g/L, NaCllg/L、CaCl20.5g/L、K2HPO4.12Η200.5g/L、KH2PO40.5g/L、FeCl20.02g/L、MgSO4.7H200.02g/L，余量为水，ρΗ7.0 ?7.2。
[0019]所述方案一中染料为油溶性染料，如苏丹红系列(苏丹红III)、油溶黄(即苏丹黄)中任一种。
[0020]所述方案一中含有染料的液体石蜡的制备方法为:将0.1?Ig苏丹红III加入80?10mL液体石蜡中，搅拌均匀后过滤除去杂质，灭菌(如115°C下高压灭菌20min)备用。
[0021]所述方案一中步骤(2)的具体操作为:向24孔细胞培养板中加入无机盐培养基I?2mL，挑取微生物单菌落并接种到24孔细胞培养板中；接种完毕后，向每个孔中加入20 μ L含有染料的液体石蜡，盖上平板盖子，在温度35?40°C下培养4?48小时。
[0022]所述方案二中LB液体培养基的组成为:胰蛋白胨5?15g/L、酵母提取物3?1g/L、NaC15?15g/L，余量为水，pH7.0?7.5。优选组成为:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaC110g/L，余量为水，ρΗ7.0 ?7.2。
[0023]所述方案二中染料为水溶性染料，如孔雀绿、次甲基蓝、胭脂红、柠檬黄、靓蓝等中任一种。
[0024]所述方案二中在清液中加入染料的具体操作为:取清液0.5?lmL，加入30?50 μ L浓度为I?3g/L的次甲基蓝水溶液。
[0025]所述方案二中步骤(3)的具体操作为:在24孔细胞培养板中滴加5?10 μ L植物油，静置12?20min，然后在植物油中间滴加10?15 μ L含有染料的清液，静置。
[0026]所述方案二中植物油为橄榄油、豆油、玉米油、花生油等中任一种。
[0027]本发明的有益效果:
[0028]本发明提供了一种快速实用、可以高通量筛选采油微生物的方法，解决了现有采油微生物筛选过程繁琐、耗时长久、仪器昂贵、操作人员需要专业培训等问题，有相对广谱效应、易于推广。采用本发明方法筛选得到的采油微生物可应用于单井吞吐、稠油降粘、水井驱油、井筒举升、清蜡防蜡、石油污染修复、油田污水处理等工艺措施中。
[0029]微生物提高采收率技术与其他的三次采油技术相比具有成本低、适应性强、储层低伤害和无环境污染等优势。但是到目前为止，微生物采油技术的潜力远没有发挥出来，主要原因是对油藏微生物的生态结构、功能、系统调控等缺乏足够的认识。按照代谢类型划分，油藏微生物主要包括烃氧化菌、好氧腐生菌、厌氧发酵菌、硝酸盐还原菌、硫酸盐还原菌和产甲烷菌等，而这些微生物中最具有益于提高采收率的菌类别，并且矿场应用最多的是烃氧化菌。烃氧化菌(Hydrocarbon Oxidizing Bacteria, HOB)是在好氧条件下可以利用石油烃作为生长底物的微生物，通过自身的代谢作用产生烃氧化酶，裂解烷烃的末端或次末端，打开芳香环，同时其可在代谢过程中产生生物表面活性剂、小分子有机酸和醇类等生物活性物质(一般的理解是烃氧化菌包括单纯降解菌和表面活性剂产生菌)。因此开发一种从油田样品(水样、油样)中快速高通量的筛选功能性可培养的烃氧化菌，尤其是可产生物表面活性剂的烃氧化菌技术，且具有操作简便和易于重复的特点，具有重大的实际应用意义和社会效益。
[0030]本发明通过在油田生产井采集获得的油样或水样中，筛选产生物表面活性剂的微生物菌株为目的，同时获得降解原油和降解石蜡的辅助功能，解决了现有采油微生物筛选过程中处理繁琐、耗时长久、仪器昂贵、专业培训等问题，有相对广谱效应、高效筛选可培养的功能采油菌，且易于推广的优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为本发明实施例1中LB固体培养基上产生的单菌落；
[0032]图2为实施例1中菌株在24孔细胞培养板上产生的石蜡降解和排油圈情况；
[0033]图3为实施例2中LB固体培养基上产生的单菌落；
[0034]图4为实施例2中24孔细胞培养板上菌株发酵清液的扩散情况。
【具体实施方式】
[0035]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0036]实施例1
[0037]本实施例中快速高通量筛选采油微生物的方法，包括以下步骤:
[0038](I)将采样口打开释放掉近端的油样或水样，(一段时间之后)将事先经过杀菌的采样容器靠近采样口，接取足够量的油样或水样；
[0039](2)所有样品采集完毕后直接密封贴标签，用塑料袋进行外封(确保最小限度的外界污染)；
[0040](3)运输前，作好运送记录，写明运送条件、日期、到达地点及其他需要说明的情况，并由运送人签字(同时确保样品在接近原有贮存温度的条件下尽快送往实验室检验)；
[0041](4)配制LB固体培养基:配方为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaC110g/L，琼月旨18g/L，余量为水，pH7.0，115°C条件下灭菌20min，当培养基温度为65°C (60?65°C均可)时将培养基倒入到事先灭菌的玻璃平板上，每个平板倒入20mL固体培养基；
[0042](5)待固体培养基彻底凝固后，采用稀释涂布法进行微生物的培养，具体为:取7支经过灭菌的ImL eppednrof管,分别向其中加入900 μ L无菌水,并按KT1到10〃的顺序进行编号，用移液枪吸取100 μ L油样或水样，加入到KT1倍稀释的eppednrof管中，再从KT1倍稀释的eppednrof管中吸取100μ L稀释液，加入到10_2倍稀释的管中，重复第二步的混匀操作，以此类推，直到完成最后一支eppednrof管的稀释；取50 μ L菌液(原则上不超过100 μ L)滴加到培养基表面，用涂布器将稀释液均匀地涂布在培养基表面，涂布时转动培养皿，使菌液分布均匀(需要注意的是涂布器事先浸在盛有酒精的烧杯中，需要时将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却后使用，如8?10s)；
[0043](6)涂布完成后，将平板倒置于37°C的生化培养箱中培养过夜，如图1所示；
[0044](7)配制无机盐培养基:配方为葡萄糖 10g/L、NH4NO31g/L> NaCllg/L、CaCl20.5g/UK2HPO4.12Η200.5g/L,KH2PO40.5g/L、FeCl20.02g/L、MgS04 *7H200.02g/L，余量为水，pH7.0，灭菌后备用；
[0045](8)用量筒量取10mL液体石蜡，向其中加入0.5g苏丹红III，搅拌均匀后过夜放置,过滤除去杂质；
[0046](9)移液器吸取2mL无机盐培养基加入到24孔细胞培养板的每个孔中，然后挑取平板上培养过夜的单菌落，接种到24孔细胞培养板的培养基中，每个单菌落分别接种到两个上下平行的孔中；
[0047](10)接种完毕后，再向每个孔中加入20 μ L液体石蜡，盖上平板盖子，置于37°C生化培养箱中培养48h后观察是否有石蜡降解现象或排油圈产生，若有石蜡降解现象出现，则微生物为石蜡降解菌，若有排油圈产生，则微生物为生物表面活性剂产生菌。如图2所示，其中A与B、C与D分别为平行样，Al、BI为空白对照，Cl、Dl为阴性对照，其余为试验组。结果显示，A6与B6出现石蜡降解现象，说明该菌株具有石蜡降解能力，为石蜡降解菌；A5与B5、C4与D4、C5与D6均出现排油圈，说明对应菌株能产生生物表面活性剂。
[0048]实施例2
[0049]本实施例中快速高通量筛选采油微生物的方法，包括以下步骤:
[0050](I)将采样口打开释放掉近端的油样或水样，(一段时间之后)将事先经过杀菌的采样容器靠近采样口，接取足够量的油样或水样；
[0051](2)所有样品采集完毕后直接密封贴标签，用塑料袋进行外封(确保最小限度的外界污染)；
[0052](3)运输前，作好运送记录，写明运送条件、日期、到达地点及其他需要说明的情况，并由运送人签字(同时确保样品在接近原有贮存温度的条件下尽快送往实验室检验)；
[0053](4)配制LB固体培养基:配方为胰蛋白胨12g/L、酵母提取物6g/L、NaC112g/L，琼脂17g/L，余量为水，pH7.0,115°C条件下灭菌20min，当培养基温度为60°C时将培养基倒入到事先灭菌的玻璃平板上，每个平板倒入20mL固体培养基；
[0054](5)待固体培养基彻底凝固后，采用稀释涂布法进行微生物的培养，具体为:取7支经过灭菌的ImL eppednrof管,分别向其中加入900 μ L无菌水,并按KT1到10〃的顺序进行编号，用移液枪吸取100 μ L油样或水样，加入到KT1倍稀释的eppednrof管中，再从KT1倍稀释的eppednrof管中吸取100μ L稀释液，加入到10_2倍稀释的管中，重复第二步的混匀操作，以此类推，直到完成最后一支eppednrof管的稀释；取50 μ L菌液滴加到培养基表面，用涂布器将稀释液均匀地涂布在培养基表面，涂布时转动培养皿，使菌液分布均匀；
[0055](6)涂布完成后，将平板倒置于37°C的生化培养箱中培养过夜，如图3所示；
[0056](7)配制LB液体培养基:配方为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaC110g/L，余量为水，pH7.0,115°C条件下灭菌20min备用；
[0057](8)挑取平板上培养过夜的单菌落接种到LB液体培养基中，置于37°C的生化培养箱中发酵培养过夜，取菌株发酵培养液1.0mL,装入到1.5mL的eppednrof管中，利用掌式离心机，2000rmp离心30s,取上清液500 μ L,加入50 μ L浓度为3g/L的次甲基蓝水溶液；
[0058](9)在一个新的24孔细胞培养板中间位置滴加5μ L橄榄油，静置15min，然后在橄榄油中间滴加15 μ L经过染色的发酵上清液；
[0059](10) 24孔细胞培养板静置，观察所述液滴是否扩散，若出现扩散现象，则清液中含有表面活性剂,微生物产生物表面活性剂,若不产生扩散,则清液中不含有或含有极微量的表面活性剂。如图4所示，其中A与B、C与D分别为平行样，Α1、Β1为阴性对照，CUDl为阳性对照，其余为试验组。结果显示，A2与B2出现较为明显的橄榄油扩散现象，说明该菌株能产生生物表面活性剂。
[0060]上述实施例中液体石蜡、苏丹红II1、次甲基蓝均购于大连辽东化学试剂厂，榄橄油为olivoild!初榨橄榄油，购于大连新玛特超市，24孔细胞培养板购于杭州生友生物技术有限公司。
【权利要求】
1.一种快速高通量筛选采油微生物的方法，其特征在于:采用方案一或方案二: 方案一: (1)将采集的油样或水样稀释涂布在LB固体培养基上，在温度35?40°C下培养10?14小时； (2)挑取微生物单菌落并接种到无机盐培养基中，再加入含有染料的液体石蜡，在温度35?40°C下培养4?48小时，观察若有石蜡降解现象或排油圈产生，则微生物为石蜡降解菌或生物表面活性剂产生菌； 方案二: (1)将采集的油样或水样稀释涂布在LB固体培养基上，在温度35?40°C下培养10?14小时； (2)挑取微生物单菌落并接种到LB液体培养基中，发酵培养后去除菌体得清液，在清液中加入染料； (3)在植物油中间加入含有染料的清液，静置，观察若植物油扩散，则微生物为生物表面活性剂产生菌。
2.根据权利要求1所述的快速高通量筛选采油微生物的方法，其特征在于:所述方案一中LB固体培养基的组成为:胰蛋白胨5?15g/L、酵母提取物3?10g/L、NaCl 5?15g/L、琼脂15?20g/L，余量为水，ρΗ7.0?7.5。
3.根据权利要求1所述的快速高通量筛选采油微生物的方法，其特征在于:所述方案一中无机盐培养基的组成为:葡萄糖5?15g/L、ΝΗ4Ν030.5?2g/L、NaCl 0.5?2g/L、CaCl20.1 ?1.0g/L、K2HP04.12Η20 0.1 ?1.5g/L、KH2P040.1 ?_0.5g/L、FeCl20.01 ?0.05g/L、MgS04.7H20 0.01 ?0.05g/L，余量为水，ρΗ7.0 ?7.5。
4.根据权利要求1所述的快速高通量筛选采油微生物的方法，其特征在于:所述方案一中染料为苏丹红、油溶黄中任一种。
5.根据权利要求4所述的快速高通量筛选采油微生物的方法，其特征在于:所述方案一中含有染料的液体石蜡的制备方法为:将0.1?lg苏丹红III加入80?100mL液体石蜡中，搅拌均匀后过滤除去杂质，灭菌备用。
6.根据权利要求1或5所述的快速高通量筛选采油微生物的方法，其特征在于:所述方案一中步骤(2)的具体操作为:向24孔细胞培养板中加入无机盐培养基1?2mL，挑取微生物单菌落并接种到24孔细胞培养板中；接种完毕后，向每个孔中加入20 μ L含有染料的液体石蜡，盖上平板盖子，在温度35?40°C下培养4?48小时。
7.根据权利要求1所述的快速高通量筛选采油微生物的方法，其特征在于:所述方案二中染料为孔雀绿、次甲基蓝、胭脂红、柠檬黄、靓蓝中任一种。
8.根据权利要求7所述的快速高通量筛选采油微生物的方法，其特征在于:所述方案二中在清液中加入染料的具体操作为:取清液0.5?lmL，加入30?50 μ L浓度为1?3g/L的次甲基蓝水溶液。
9.根据权利要求1所述的快速高通量筛选采油微生物的方法，其特征在于:所述方案二中步骤(3)的具体操作为:在24孔细胞培养板中滴加5?10 μ L植物油，静置12?20min，然后在植物油中间滴加10?15 μ L含有染料的清液，静置。
10.根据权利要求1或9所述的快速高通量筛选采油微生物的方法，其特征在于:所述方案二中植物油为橄榄油、豆油、玉米油、花生油中任一种。
【文档编号】C12Q1/04GK104372064SQ201410563671
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】周志成, 张宇, 赵静, 付娜, 李晓晨, 王娟娟, 韩雨曦 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司华北分公司