用于制备β-苦味酸的基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于制备β-苦味酸的基因及其应用。本发明所提供的用于制备β-苦味酸的基因及其应用中，用于制备β-苦味酸的基因为基因组合物，所述组合物由苦味酸合成相关基因1和苦味酸合成相关基因2组成；所述苦味酸合成相关基因1是核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的DNA分子或核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第301-1245位核苷酸所示的DNA分子；所述苦味酸合成相关基因2是核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2的DNA分子或核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2的第301-1227位核苷酸所示的DNA分子。
【专利说明】用于制备β-苦味酸的基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】中用于制备β_苦味酸的基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 啤酒花（Humulus lupulus L.)，也称作忽布、蛇麻花等，是二倍体（2η = 20)，属 于蔷薇目大麻科薄草属蛇麻种，是多年生攀缘草本植物，雌雄异株，雌花是由苞片复瓦状 排列形成球果状花序，长3-4厘米，内层苞片下面生有大量黄色腺体腺毛。啤酒花雌花主 要用于酿造啤酒，是啤酒特有香味和苦味的主要来源，通常被认为是啤酒酿造的"绿色黄 金"。2010年全球的啤酒销售额是5850亿美元，预计2015销售总额会达到6300亿美元 (https://uk. finance, yahoo, com/news/global-beer-industry-000000008. html),无论是 国内国外，啤酒销售市场仍在不断的扩大。啤酒爽口不爽口，很大程度上取决于啤酒花风味 品质（其它因素还包括大麦芽和酵母菌株等）。啤酒花作为重要的经济作物而在我国中西 部地区（新疆、甘肃、内蒙等地）有大面积种植，是当地农民的主要经济来源。我国啤酒花 当前存在的主要生产问题是酒花品种单一，风味品质较差，高档啤酒制造所需酒花仍需要 进口，仅在2008年我国就进口了总价值5千万美元的啤酒花。
[0003] 啤酒花风味品质主要是由一些酒花特有的次生代谢物（萜类，苦味酸，黄腐醇） 的含量及比例决定的，这些化合物生物合成和积累主要是在啤酒花腺体腺毛中完成。啤 酒花香味主要来源于其精油成分，主要包括单廠（月桂烯Myrcene)和倍半廠（石竹烯 Caryophyllene和啤酒花烯Humulene)等。啤酒花苦味主要来源于苦味酸（分为α-苦 味酸、β_苦味酸两类），其中α-苦味酸是含有两个异戊烯基团的芳香类化合物的总称 (α -苦味酸在啤酒酿造过程中异构化产生苦味物质），β -苦味酸的成分则是含有三个异 戊烯基团芳香类化合物。苦味酸也表现出很好的药用前景，如防止肝脏星形细胞纤维化，诱 导肿瘤细胞凋亡，调控人体脂类代谢平衡等功效。黄腐醇和苦味酸的这一系列功效也是当 下比较认同"适量饮用啤酒有益健康"的理论基础，从某种意义上啤酒中黄腐醇和苦味酸有 些像红葡萄酒中白藜芦醇（Resveratrol)的功效。但是，啤酒中的苦味酸含量很低，而为达 到保健功效成人需每天至少摄入150毫克左右，如何在不增加生产成本（加大啤酒花的使 用量理论上可行，但很不经济）的情况下增加啤酒中苦味酸含量是一个比较棘手的实际生 产问题。因此提高啤酒花中苦味酸含量也是啤酒花育种行业不断追求的目标之一。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何制备苦味酸。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于制备β_苦味酸的基因组合物（成 套基因）。
[0006] 本发明所提供的用于制备β -苦味酸的基因组合物，所述组合物为组合物X或组 合物Y ;所述组合物X由苦味酸合成相关基因1和苦味酸合成相关基因2组成；所述组合物 Y由所述苦味酸合成相关基因1、所述苦味酸合成相关基因2和Z组成；所述Z为短侧链酯 酰辅酶A连接酶CCL2基因、短侧链酯酰辅酶A连接酶CCL4基因和苯戊酮合成酶基因中的 三种、两种或一种；
[0007] 所述苦味酸合成相关基因 1编码苦味酸合成相关蛋白1 ;所述苦味酸合成相关蛋 白1为下述Xla)或Xlb)的蛋白质：
[0008] Xla) C端至少含有序列表中SEQ ID No. 11的第141-414位氨基酸序列，并且从SEQ ID No. 11的第141位开始、按照SEQ ID No. 11的氨基酸序列向SEQ ID No. 11的N端延 长，得到长度为274-414个氨基酸的任意一个蛋白质；
[0009] Xlb)在Xla)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几 个氨基酸残基得到的具有相同功能的由Xla)衍生的蛋白质；
[0010] 所述苦味酸合成相关基因2编码苦味酸合成相关蛋白2 ;所述苦味酸合成相关蛋 白2为下述Yla)或Ylb)的蛋白质：
[0011] Yla) C端至少含有序列表中SEQ ID No. 12的第101-408位氨基酸序列，并且从SEQ ID No. 12的第101位开始、按照SEQ ID No. 12的氨基酸序列向SEQ ID No. 12的N端延长， 得到长度为308-408个氨基酸的任意一个蛋白质；
[0012] Ylb)在Yla)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几 个氨基酸残基得到的具有相同功能的由Yla)衍生的蛋白质；
[0013] 所述短侧链酯酰辅酶A连接酶CCL2为下述Hl)或H2)的蛋白质：
[0014] Hl)氨基酸序列为SEQ ID No. 3的蛋白质；
[0015] H2)在SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有短侧链酯酰辅酶A连接酶功能的由Hl)衍生的蛋白质；
[0016] 所述短侧链酯酰辅酶A连接酶CCL4为下述Kl)或K2)的蛋白质：
[0017] Kl)氨基酸序列为SEQ ID No. 13的蛋白质；
[0018] K2)在SEQ ID No. 13所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有短侧链酯酰辅酶A连接酶功能的由Kl)衍生的蛋白质；
[0019] 所述苯戊酮合成酶为下述II)或12)的蛋白质：
[0020] II)氨基酸序列为SEQ ID No. 4的蛋白质；
[0021] 12)在SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有苯戊酮合成酶功能的由Hl)衍生的蛋白质。
[0022] 上述基因组合物中，所述基因组合物中各组分可独立包装，也可包装在一起。
[0023] 上述基因组合物具体可为权利要求2-6的用于制备β -苦味酸的基因组合物。
[0024] 上述基因组合物中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定 向进化和点突变的方法，对本发明的苦味酸合成相关基因1或苦味酸合成相关基因2的核 苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的苦味酸合成相关基因 1或苦味酸合成相关基因2的核苷酸序列75%或者更高同一性、且编码所述苦味酸合成相 关蛋白1或所述苦味酸合成相关蛋白2,均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发 明的序列。
[0025] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或 95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机 软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用来评价相关序列之 间的同一'I"生。
[0026] 上述基因组合物中，所述严格条件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂 交并洗膜2次，每次5min，又于0. 5XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次， 每次15min。
[0027] 上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0028] 上述基因组合物中，序列表中SEQ ID No. 1所示的DNA分子（苦味酸合成相关基 因1)编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 11的蛋白质（苦味酸合成相关蛋白1)，序列 表中SEQ ID No. 2所示的DNA分子（苦味酸合成相关基因2)编码氨基酸序列为序列表中 SEQ ID No. 12的蛋白质（苦味酸合成相关蛋白2)，序列表中SEQ ID No. 5所示的DNA分子 (短侧链酯酰辅酶A连接酶CCL2基因）编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 3的蛋白质 (短侧链酯酰辅酶A连接酶CCL2)，序列表中SEQ ID No. 6所示的DNA分子（苯戊酮合成酶 基因）编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 4的蛋白质（苯戊酮合成酶），序列表中SEQ ID No. 14所示的DNA分子（短侧链酯酰辅酶A连接酶CCL4基因）编码氨基酸序列为序列 表中SEQ ID No. 13的蛋白质（短侧链酯酰辅酶A连接酶CCL4)。
[0029] 为解决上述技术问题，本发明还提供了与用于制备β_苦味酸的基因组合物相关 的遗传材料。
[0030] 本发明所提供的与用于制备β -苦味酸的基因组合物相关的遗传材料为下述El) 至Ε8)中的任一种：
[0031] El)含有所述苦味酸合成相关基因1和所述苦味酸合成相关基因2的表达盒；
[0032] Ε2)表达盒组合物，由E2a)的表达盒和E2b)的表达盒组成：
[0033] E2a)含有所述苦味酸合成相关基因1但不含有所述苦味酸合成相关基因2的表达 盒；
[0034] E2b)含有所述苦味酸合成相关基因2但不含有所述苦味酸合成相关基因1的表达 盒；
[0035] E3)含有所述苦味酸合成相关基因1和所述苦味酸合成相关基因2的重组载体；
[0036] E4)重组载体组合物，由E4a)的重组载体和E4b)的重组载体组成：
[0037] E4a)含有所述苦味酸合成相关基因1但不含有所述苦味酸合成相关基因2的重组 载体；
[0038] E4b)含有所述苦味酸合成相关基因2但不含有所述苦味酸合成相关基因1的重组 载体；
[0039] E5)含有所述苦味酸合成相关基因1和所述苦味酸合成相关基因2的重组微生 物；
[0040] E6)含有所述苦味酸合成相关基因1和所述苦味酸合成相关基因2的转基因植物 细胞系；
[0041] E7)含有所述苦味酸合成相关基因1和所述苦味酸合成相关基因2的转基因植物 组织；
[0042] E8)含有所述苦味酸合成相关基因1和所述苦味酸合成相关基因2的转基因植物 器官。
[0043] 上述与用于制备β -苦味酸的基因组合物相关的遗传材料中，El)所述的含有所 述苦味酸合成相关基因1和所述苦味酸合成相关基因2的表达盒，是指能够在宿主细胞中 表达所述苦味酸合成相关蛋白1和所述苦味酸合成相关蛋白2的DNA，该DNA不但可包括启 动所述苦味酸合成相关基因1和所述苦味酸合成相关基因2转录的启动子，还可包括终止 所述苦味酸合成相关基因1和所述苦味酸合成相关基因2转录的终止子。进一步，所述表 达盒还可包括增强子序列。
[0044] 可用现有的表达载体构建含有所述苦味酸合成相关基因1和所述苦味酸合成相 关基因2表达盒的重组载体。
[0045] 上述与用于制备苦味酸的基因组合物相关的遗传材料中，所述载体可为质 粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0046] 上述与用于制备β -苦味酸的基因组合物相关的遗传材料中，所述微生物可为酵 母、细菌、藻或真菌。在本发明的一个实施例中，所述微生物具体为酵母DD104(erg20-2)，所 述 DD104 的基因型为 MATa erg9-l erg20-2 ura3 his3 leu2 ade2。
[0047] 上述与用于制备β -苦味酸的基因组合物相关的遗传材料中，所述遗传材料不包 括繁殖材料。
[0048] 为解决上述技术问题，本发明还提供了苦味酸合成相关蛋白1。
[0049] 本发明所提供的苦味酸合成相关蛋白1，为上述基因组合物中所述苦味酸合成相 关蛋白1，且所述苦味酸合成相关蛋白1的氨基酸序列不为SEQ ID No. 11。
[0050] 为解决上述技术问题，本发明还提供了编码苦味酸合成相关蛋白1的的核酸分 子。
[0051] 本发明所提供的编码苦味酸合成相关蛋白1的核酸分子中，所述苦味酸合成相关 蛋白1为上述基因组合物中所述苦味酸合成相关蛋白1。
[0052] 上述编码苦味酸合成相关蛋白1的核酸分子中，所述编码苦味酸合成相关蛋白1 的核酸分子可为上述基因组合物中所述苦味酸合成相关蛋白1的编码基因。
[0053] 为解决上述技术问题，本发明还提供了与苦味酸合成相关蛋白1相关的遗传材 料。
[0054] 本发明所提供的与苦味酸合成相关蛋白1相关的遗传材料中，所述苦味酸合成相 关蛋白1为上述基因组合物中所述苦味酸合成相关蛋白1，所述与苦味酸合成相关蛋白1相 关的遗传材料为下述Gl)至G20)中的任一种：
[0055] Gl)编码所述苦味酸合成相关蛋白1的基因；
[0056] G2)含有Gl)所述基因的表达盒；
[0057] G3)含有Gl)所述基因的重组载体；
[0058] G4)含有G2)所述表达盒的重组载体；
[0059] G5)含有Gl)所述基因的重组微生物；
[0060] G6)含有G2)所述表达盒的重组微生物；
[0061] G7)含有G3)所述重组载体的重组微生物；
[0062] G8)含有G4)所述重组载体的重组微生物；
[0063] G9)含有Gl)所述基因的转基因植物细胞系；
[0064] G10)含有G2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0065] Gl 1)含有G3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0066] G12)含有G4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0067] G13)含有Gl)所述基因的转基因植物组织；
[0068] G14)含有G2)所述表达盒的转基因植物组织；
[0069] G15)含有G3)所述重组载体的转基因植物组织；
[0070] G16)含有G4)所述重组载体的转基因植物组织；
[0071] G17)含有Gl)所述基因的转基因植物器官；
[0072] G18)含有G2)所述表达盒的转基因植物器官；
[0073] G19)含有G3)所述重组载体的转基因植物器官；
[0074] G20)含有G4)所述重组载体的转基因植物器官。
[0075] 上述与苦味酸合成相关蛋白1相关的遗传材料中，本领域普通技术人员可以很容 易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的苦味酸合成相关蛋白1 的基因的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的苦味酸合 成相关蛋白1的基因的核苷酸序列75%或者更高同一性、且编码所述苦味酸合成相关蛋白 1的核苷酸序列，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0076] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的SEQ ID No. 1具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一 性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多 个序列之间的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0077] 上述与苦味酸合成相关蛋白1相关的遗传材料中，G2)所述的含有编码所述苦味 酸合成相关蛋白1的基因的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述苦味酸合成相关蛋 白1的DNA,该DNA不但可包括启动所述苦味酸合成相关蛋白1的基因转录的启动子,还可 包括终止所述苦味酸合成相关蛋白1的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括 增强子序列。
[0078] 可用现有的表达载体构建含有所述苦味酸合成相关蛋白1的基因的表达盒的重 组载体。
[0079] 上述与苦味酸合成相关蛋白1相关的遗传材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌 体或病毒载体。
[0080] 上述与苦味酸合成相关蛋白1相关的遗传材料中，G5)-G8)所述的微生物可为酵 母、细菌、藻或真菌。在本发明的一个实施例中，所述微生物具体为酵母DD104,所述DD104 的基因型为 MAT a erg9_l erg20_2 ura3 his3 leu2 ade2。
[0081] 上述与苦味酸合成相关蛋白I相关的遗传材料中，所述遗传材料不包括繁殖材 料。
[0082] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述I -VI中任一应用：
[0083] I、所述基因组合物在制备β -苦味酸中的应用；
[0084] II、所述与用于制备β -苦味酸的基因组合物相关的遗传材料在制备β -苦味酸 中的应用；
[0085] III、所述编码苦味酸合成相关蛋白1的核酸分子在制备苦味酸合成相关蛋白1中 的应用；
[0086] IV、所述编码苦味酸合成相关蛋白1的核酸分子或所述苦味酸合成相关蛋白1在 制备苦味酸中的应用；
[0087] V、所述与苦味酸合成相关蛋白1相关的遗传材料在制备苦味酸合成相关蛋白1 中的应用；
[0088] VI、所述与苦味酸合成相关蛋白1相关的遗传材料在制备β -苦味酸中的应用。
[0089] 上述应用中，所述β-苦味酸可为合蛇麻酮（Colupulone，如式1所示）、蛇麻酮 (Lupulone，如式2所示）、聚蛇麻酮（Adlupulone，如式3所示）中的至少一种。
[0090]
【权利要求】
1. 用于制备￠-苦味酸的基因组合物，所述组合物为组合物X或组合物Y;所述组合物 X由苦味酸合成相关基因1和苦味酸合成相关基因2组成；所述组合物Y由所述苦味酸合成 相关基因1、所述苦味酸合成相关基因2和Z组成；所述Z为短侧链酯酰辅酶A连接酶CCL2 基因、短侧链酯酰辅酶A连接酶CCL4基因和苯戊酮合成酶基因中的三种、两种或一种； 所述苦味酸合成相关基因1编码苦味酸合成相关蛋白1;所述苦味酸合成相关蛋白1 为下述Xla)或Xlb)的蛋白质： Xla)C端至少含有序列表中SEQ ID No. 11的第141-414位氨基酸序列，并且从SEQ ID No. 11的第141位开始、按照SEQ ID No. 11的氨基酸序列向SEQ ID No. 11的N端延长，得 到长度为274-414个氨基酸的任意一个蛋白质； Xlb)在Xla)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由Xla)衍生的蛋白质； 所述苦味酸合成相关基因2编码苦味酸合成相关蛋白2 ;所述苦味酸合成相关蛋白2 为下述Yla)或Ylb)的蛋白质： Yla)C端至少含有序列表中SEQ ID No. 12的第101-408位氨基酸序列，并且从SEQ ID No. 12的第101位开始、按照SEQ ID No. 12的氨基酸序列向SEQ ID No. 12的N端延长，得 到长度为308-408个氨基酸的任意一个蛋白质； Ylb)在Yla)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由Yla)衍生的蛋白质； 所述短侧链酯酰辅酶A连接酶CCL2为下述H1)或H2)的蛋白质： H1)氨基酸序列为SEQ ID No. 3的蛋白质； H2)在SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个 氨基酸残基得到的具有短侧链酯酰辅酶A连接酶功能的由H1)衍生的蛋白质； 所述短侧链酯酰辅酶A连接酶CCL4为下述K1)或K2)的蛋白质： K1)氨基酸序列为SEQ ID No. 13的蛋白质； K2)在SEQ ID No. 13所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个 氨基酸残基得到的具有短侧链酯酰辅酶A连接酶功能的由K1)衍生的蛋白质； 所述苯戊酮合成酶为下述II)或12)的蛋白质： 11) 氨基酸序列为SEQ ID No. 4的蛋白质； 12) 在SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个 氨基酸残基得到的具有苯戊酮合成酶功能的由H1)衍生的蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的基因组合物，其特征在于：所述苦味酸合成相关基因1编码 苦味酸合成相关蛋白1 ;所述苦味酸合成相关蛋白1为下述X2a)-X6b)的蛋白质中的任一 种： X2a)C端至少含有序列表中SEQ ID No. 11的第121-414位氨基酸序列，并且从SEQ IDNo. 11的第121位开始、按照SEQ ID No. 11的氨基酸序列向SEQ ID No. 11的N端延长， 得到长度为294-414个氨基酸的任意一个蛋白质； X2b)在X2a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由X2a)衍生的蛋白质； X3a)C端至少含有序列表中SEQ ID No. 11的第101-414位氨基酸序列，并且从SEQ IDNo. 11的第101位开始、按照SEQ ID No. 11的氨基酸序列向SEQ ID No. 11的N端延长， 得到长度为314-414个氨基酸的任意一个蛋白质； X3b)在X3a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由X3a)衍生的蛋白质； X4a)C端至少含有序列表中SEQ ID No. 11的第81-414位氨基酸序列，并且从SEQ ID No. 11的第81位开始、按照SEQ ID No. 11的氨基酸序列向SEQ ID No. 11的N端延长，得到 长度为334-414个氨基酸的任意一个蛋白质； X4b)在X4a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由X4a)衍生的蛋白质； X5a)C端至少含有序列表中SEQ ID No. 11的第61-414位氨基酸序列，并且从SEQ ID No. 11的第61位开始、按照SEQ ID No. 11的氨基酸序列向SEQ ID No. 11的N端延长，得到 长度为354-414个氨基酸的任意一个蛋白质； X5b)在X5a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由X5a)衍生的蛋白质； X6a)C端至少含有序列表中SEQ ID No. 11的第41-414位氨基酸序列，并且从SEQ ID No. 11的第41位开始、按照SEQ ID No. 11的氨基酸序列向SEQ ID No. 11的N端延长，得到 长度为374-414个氨基酸的任意一个蛋白质； X6b)在X6a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由X6a)衍生的蛋白质； 所述苦味酸合成相关基因2编码苦味酸合成相关蛋白2 ;所述苦味酸合成相关蛋白2 为下述Y2a)-Y4b)的蛋白质中的任一种： Y2a)C端至少含有序列表中SEQ ID No. 12的第81-408位氨基酸序列，并且从SEQ ID No. 12的第81位开始、按照SEQ ID No. 12的氨基酸序列向SEQ ID No. 12的N端延长，得到 长度为328-408个氨基酸的任意一个蛋白质； Y2b)在Y2a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由Y2a)衍生的蛋白质； Y3a)C端至少含有序列表中SEQ ID No. 12的第61-408位氨基酸序列，并且从SEQ ID No. 12的第61位开始、按照SEQ ID No. 12的氨基酸序列向SEQ ID No. 12的N端延长，得到 长度为348-408个氨基酸的任意一个蛋白质； Y3b)在Y3a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由Y3a)衍生的蛋白质； Y4a)C端至少含有序列表中SEQ ID No. 12的第41-408位氨基酸序列，并且从SEQ ID No. 12的第41位开始、按照SEQ ID No. 12的氨基酸序列向SEQ ID No. 12的N端延长，得到 长度为368-408个氨基酸的任意一个蛋白质； Y4b)在Y4a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由Y4a)衍生的蛋白质； 所述短侧链酯酰辅酶A连接酶CCL2基因编码短侧链酯酰辅酶A连接酶CCL2,为如下 L1)或L2)或L3)所示的核酸分子： L1)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 5的核酸分子； L2)与L1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述短侧链酯酰辅 酶A连接酶CCL2的cDNA分子或基因组DNA分子； L3)在严格条件下与L1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述短侧链酯酰辅酶A连接酶 CCL2的cDNA分子或基因组DNA分子； 所述苯戊酮合成酶基因为如下Ml)或M2)或M3)所示的核酸分子： Ml)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 6的核酸分子； M2)与Ml)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述苯戊酮合成酶 的cDNA分子或基因组DNA分子； M3)在严格条件下与Ml)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述苯戊酮合成酶的cDNA分 子或基因组DNA分子； 所述短侧链酯酰辅酶A连接酶CCL4基因编码短侧链酯酰辅酶A连接酶CCL4,为如下 N1)或N2)或N3)所示的核酸分子： N1)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 14的核酸分子； N2)与N1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述短侧链酯酰辅 酶A连接酶CCL4的cDNA分子或基因组DNA分子； N3)在严格条件下与N1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述短侧链酯酰辅酶A连接酶 CCL4的cDNA分子或基因组DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的基因组合物，其特征在于：所述苦味酸合成相关基因1编 码苦味酸合成相关蛋白1 ;所述苦味酸合成相关蛋白1为下述Cla)-C7b)的蛋白质中的任 意一种： Cla)氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 11的蛋白质； Clb)在Cla)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由Cla)衍生的蛋白质； C2a)氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 11的第101-414位氨基酸的蛋白质； C2b)在C2a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由C2a)衍生的蛋白质； C3a)氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 11的第41-414位氨基酸的蛋白质； C3b)在C3a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由C3a)衍生的蛋白质； C4a)氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 11的第121-414位氨基酸的蛋白质； C4b)在C4a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由C4a)衍生的蛋白质； C5a)氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 11的第81-414位氨基酸的蛋白质； C5b)在C5a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由C5a)衍生的蛋白质； C6a)氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 11的第61-414位氨基酸的蛋白质； C6b)在C6a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由C6a)衍生的蛋白质； C7a)氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 11的第141-414位氨基酸的蛋白质； C7b)在C7a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由C7a)衍生的蛋白质； 所述苦味酸合成相关基因2编码苦味酸合成相关蛋白2 ;所述苦味酸合成相关蛋白2 为下述Dla)_D5b)的蛋白质中的任意一种： Dla)氣基酸序列为序列表中SEQ ID No. 12的蛋白质； Dlb)在Dla)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由Dla)衍生的蛋白质； D2a)氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 12的第101-408位氨基酸的蛋白质； D2b)在D2a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由D2a)衍生的蛋白质； D3a)氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 12的第81-408位氨基酸的蛋白质； D3b)在D3a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由D3a)衍生的蛋白质； D4a)氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 12的第41-408位氨基酸的蛋白质； D4b)在D4a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由D4a)衍生的蛋白质； D5a)氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 12的第61-408位氨基酸的蛋白质； D5b)在D5a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有相同功能的由D5a)衍生的蛋白质。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的基因组合物，其特征在于： 所述苦味酸合成相关基因1编码苦味酸合成相关蛋白1 ;所述苦味酸合成相关蛋白1 的编码基因为如下Ala)或Alb)或Ale)所示的核酸分子： Ala) 3'端至少含有序列表中SEQ ID No. 1的第421-1245位核苷酸序列，并且从SEQ IDNo. 1的第421位开始、按照SEQ ID No. 1的核苷酸序列向SEQ ID No. 1的5'端延长，得 到长度为825至1245bp的任意一个DNA分子； Alb)与Ala)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述苦味酸合成 相关蛋白1的eDNA分子或基因组DNA分子； Ale)在严格条件下与Ala)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述苦味酸合成相关蛋白1 的eDNA分子或基因组DNA分子； 所述苦味酸合成相关基因2编码苦味酸合成相关蛋白2 ;所述苦味酸合成相关蛋白2 的编码基因为如下Bla)或Bib)或Blc)所示的核酸分子： Bla) 3'端至少含有序列表中SEQ ID No. 2的第301-1227位核苷酸序列，并且从SEQ IDNo. 2的第301位开始、按照SEQ ID No. 2的核苷酸序列向SEQ ID No. 2的5'端延长，得 到长度为927至1227bp的任意一个DNA分子； Bib)与Bla)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述苦味酸合成 相关蛋白2的eDNA分子或基因组DNA分子； Blc)在严格条件下与Bla)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述苦味酸合成相关蛋白2 的eDNA分子或基因组DNA分子。
5. 根据权利要求1-4中任一所述的基因组合物，其特征在于： 所述苦味酸合成相关基因1编码苦味酸合成相关蛋白1;所述苦味酸合成相关蛋白1 的编码基因为下述A2) -A6)中的任一种DNA分子： A2)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中SEQ ID No. 1的第361-1245位核苷酸序列， 并且从SEQ ID No. 1的第361位开始、按照SEQ ID No. 1的核苷酸序列向SEQ ID No. 1的 5'端延长，得到长度为885至1245bp的任意一个DNA分子； A3)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中SEQ ID No. 1的第301-1245位核苷酸序列， 并且从SEQ ID No. 1的第301位开始、按照SEQ ID No. 1的核苷酸序列向SEQ ID No. 1的 5'端延长，得到长度为945至1245bp的任意一个DNA分子； A4)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中SEQ ID No. 1的第241-1245位核苷酸序列， 并且从SEQ ID No. 1的第241位开始、按照SEQ ID No. 1的核苷酸序列向SEQ ID No. 1的 5'端延长，得到长度为1005至1245bp的任意一个DNA分子； A5)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中SEQ ID No. 1的第181-1245位核苷酸序列， 并且从SEQ ID No?列1的第181位开始、按照SEQ ID No. 1的核苷酸序列向SEQ ID No. 1 的5'端延长，得到长度为1065至1245bp的任意一个DNA分子； A6)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中SEQ ID No. 1的第121-1245位核苷酸序列， 并且从SEQ ID No. 1的第121位开始、按照SEQ ID No. 1的核苷酸序列向SEQ ID No. 1的 5'端延长，得到长度为1125至1245bp的任意一个DNA分子； 所述苦味酸合成相关基因2编码苦味酸合成相关蛋白2 ;所述苦味酸合成相关蛋白2 的编码基因为下述B2)-B4)中的任一种DNA分子： B2) 3'端至少含有序列表中SEQ ID No. 2的第241-1227位核苷酸序列，并且从SEQ IDNo. 2的第241位开始、按照SEQ ID No. 2的核苷酸序列向SEQ ID No. 2的5'端延长，得 到长度为987至1227bp的任意一个DNA分子； B3) 3'端至少含有序列表中SEQ ID No. 2的第181-1227位核苷酸序列，并且从SEQ IDNo. 2的第181位开始、按照SEQ ID No. 2的核苷酸序列向SEQ ID No. 2的5'端延长，得 到长度为1047至1227bp的任意一个DNA分子； B4) 3'端至少含有序列表中SEQ ID No. 2的第121-1227位核苷酸序列，并且从SEQ IDNo. 2的第121位开始、按照SEQ ID No. 2的核苷酸序列向SEQ ID No. 2的5'端延长，得 到长度为1107至1227bp的任意一个DNA分子。
6.根据权利要求1-5中任一所述的基因组合物，其特征在于： 所述苦味酸合成相关基因1编码苦味酸合成相关蛋白1 ;所述苦味酸合成相关蛋白1 的编码基因为下述Cll)-C77)中的任一种DNA分子： C11)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 1的DNA分子； C22)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 1的第301-1245位核苷酸所示的DNA分子； C33)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 1的第121-1245位核苷酸所示的DNA分子； C44)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 1的第361-1245位核苷酸所示的DNA分子； C55)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 1的第241-1245位核苷酸所示的DNA分子； C66)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 1的第181-1245位核苷酸所示的DNA分子； C77)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 1的第421-1245位核苷酸所示的DNA分子； 所述苦味酸合成相关基因2编码苦味酸合成相关蛋白2 ;所述苦味酸合成相关蛋白2 的编码基因为下述Dll)-D55)中的任一种DNA分子： D11)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 2的DNA分子； D22)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 2的第301-1227位核苷酸所示的DNA分子； D33)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 2的第241-1227位核苷酸所示的DNA分子； D44)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 2的第121-1227位核苷酸所示的DNA分子； D55)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 2的第181-1227位核苷酸所示的DNA分子。
7. 与权利要求1-6中任一所述用于制备￠-苦味酸的基因组合物相关的遗传材料为下 述E1)至E8)中的任一种： E1)含有权利要求1-6中任一所述苦味酸合成相关基因1和权利要求1-6中任一所述 苦味酸合成相关基因2的表达盒； E2)表达盒组合物，由E2a)的表达盒和E2b)的表达盒组成： E2a)含有权利要求1-6中任一所述苦味酸合成相关基因1但不含有权利要求1-6中任 一所述苦味酸合成相关基因2的表达盒； E2b)含有权利要求1-6中任一所述苦味酸合成相关基因2但不含有权利要求1-6中任 一所述苦味酸合成相关基因1的表达盒； E3)含有权利要求1-6中任一所述苦味酸合成相关基因1和权利要求1-6中任一所述 苦味酸合成相关基因2的重组载体； E4)重组载体组合物，由E4a)的重组载体和E4b)的重组载体组成： E4a)含有权利要求1-6中任一所述苦味酸合成相关基因1但不含有权利要求1-6中任 一所述苦味酸合成相关基因2的重组载体； E4b)含有权利要求1-6中任一所述苦味酸合成相关基因2但不含有权利要求1-6中任 一所述苦味酸合成相关基因1的重组载体； E5)含有权利要求1-6中任一所述苦味酸合成相关基因1和权利要求1-6中任一所述 苦味酸合成相关基因2的重组微生物； E6)含有权利要求1-6中任一所述苦味酸合成相关基因1和权利要求1-6中任一所述 苦味酸合成相关基因2的转基因植物细胞系； E7)含有权利要求1-6中任一所述苦味酸合成相关基因1和权利要求1-6中任一所述 苦味酸合成相关基因2的转基因植物组织； E8)含有权利要求1-6中任一所述苦味酸合成相关基因1和权利要求1-6中任一所述 苦味酸合成相关基因2的转基因植物器官。 8. P1)或 P2): P1)权利要求1-6中任一所述苦味酸合成相关蛋白1，所述苦味酸合成相关蛋白1的氨 基酸序列不为SEQ ID No. 11 ; P2)编码权利要求1-6中任一所述苦味酸合成相关蛋白1的核酸分子。
9. 与权利要求8所述苦味酸合成相关蛋白1相关的遗传材料，为下述G1)至G20)中的 任一种： G1)编码权利要求1-6中任一所述苦味酸合成相关蛋白1的基因； G2)含有G1)所述基因的表达盒； G3)含有G1)所述基因的重组载体； G4)含有G2)所述表达盒的重组载体； G5)含有G1)所述基因的重组微生物； G6)含有G2)所述表达盒的重组微生物； G7)含有G3)所述重组载体的重组微生物； G8)含有G4)所述重组载体的重组微生物； G9)含有G1)所述基因的转基因植物细胞系； G10)含有G2)所述表达盒的转基因植物细胞系； G11)含有G3)所述重组载体的转基因植物细胞系； G12)含有G4)所述重组载体的转基因植物细胞系； G13)含有G1)所述基因的转基因植物组织； G14)含有G2)所述表达盒的转基因植物组织； G15)含有G3)所述重组载体的转基因植物组织； G16)含有G4)所述重组载体的转基因植物组织； G17)含有G1)所述基因的转基因植物器官； G18)含有G2)所述表达盒的转基因植物器官； G19)含有G3)所述重组载体的转基因植物器官； G20)含有G4)所述重组载体的转基因植物器官。
10. 下述I -VI中任一应用： I、权利要求1-6中任一所述的基因组合物在制备￠-苦味酸中的应用； 11、 权利要求7所述的与用于制备0 -苦味酸的基因组合物相关的遗传材料在制备 3-苦味酸中的应用； III、 编码权利要求1-6中任一所述苦味酸合成相关蛋白1的核酸分子在制备苦味酸合 成相关蛋白1中的应用； IV、 编码权利要求1-6中任一所述苦味酸合成相关蛋白1的核酸分子或权利要求1-6 中任一所述苦味酸合成相关蛋白1在制备￠-苦味酸中的应用； V、 权利要求9所述的与苦味酸合成相关蛋白1相关的遗传材料在制备苦味酸合成相 关蛋白1中的应用； VI、 权利要求9所述的与苦味酸合成相关蛋白1相关的遗传材料在制备0 -苦味酸中 的应用。
【文档编号】C12N9/00GK104404059SQ201410618189
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】王国栋, 李好勋, 覃浩, 班兆男 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所