一种含有耐药基因盒的整合子的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种含有耐药基因盒的整合子，其序列如SEQ ID NO.1所示。该整合子是在一株肺炎克雷伯氏耐药菌株的质粒中经过酶切测序鉴定获得的。该整合子中含有多个耐药基因盒，因此本发明的上述整合子的发现为临床用药提供了一定的指导作用，有利于临床上减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。
【专利说明】一种含有耐药基因盒的整合子
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术及耐药细菌监测领域，涉及一种新发现的与肺炎克雷 伯氏菌耐药性密切相关的整合子。
【背景技术】
[0002] 医疗水平的进步，种类繁多的抗生素日益被开发出来并投放市场。大量应用于临 床及兽医方面，甚至在畜牧业中，也常使用其促进生长，正是这些抗生素的广泛应用，尤其 是不合理地使用，造成细菌的耐药以至多重耐药问题日益严重，耐药机制日趋复杂。人们预 料可能由于基因突变会导致耐单种抗生素的菌株的出现，但在同一菌株中同时出现对多种 抗生素的耐药性，很难用基因突变进行解释。研究证明，遗传物质在菌种内以及菌种间的水 平传播，是细菌获得新的耐药性的重要途径。耐药性快速广泛地传播以及在不同菌种间出 现非常相似的耐药方式，说明了上述机制的重要性。近来的研究表明整合子在耐药基因的 水平传播以及多重耐药菌株的出现中起重要作用。
[0003] 整合子（integron)是一个能通过自身编码的整合酶识别、捕获、整合或剪切细胞 外游离基因或基因片段，并使之转化为功能性基因的重组表达系统。被其捕获和整合的细 胞外游离基因或基因片段多为编码耐药性蛋白如内酰胺酶-lactamase)、氨基糖苷 类钝化酶、林可霉素类钝化酶、氯霉素乙酰转移酶、大环内酯类钝化酶、氨基糖甙乙酰转移 酶（AAC)、氨基糖甙磷酸转移酶（ANT)核苷转移酶（APH)等的耐药基因。
[0004] 整合子在某些情况下通过捕获有利的基因盒，如耐药性基因盒，而获得生存优势， 但也有可能捕获某些对宿主产生毒性的基因盒而造成不利的影响，或者过度捕获基因盒而 对宿主菌的繁殖造成一定负担。因此，细菌的整合子在捕获外来基因盒的过程中，推测其一 定有一套完整而又精细的调节机制，但这一机制还仍未明了。对上述有关调节机制的研究， 将有利于揭示细菌的耐药性，尤其是细菌的多重耐药性。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种含有耐药基因盒的整合子，将其命名为Inl059,其序列如SEQ ID NO. 1所示。该整合子含有aacA4基因盒、aadA16基因盒、aadB基因盒、qacE A 1-sull 基因盒、blavim_5基因盒。上述整合子表达多种耐药基因，从而导致含有该整合子的菌种对 多种抗生素药物具有抗性。这些抗生素包括：氨基糖苷类抗生素、磺胺类抗生素、3内酰胺 类抗生素。
[0006] 常见的氨基糖苷类抗生素包括：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡 星。
[0007] 常见的磺胺类抗生素包括：磺胺异恶唑（SIZ)、磺胺二甲嘧啶（SM2)、磺胺嘧啶 (SD)、磺胺甲恶唑（SMZ)、磺胺间甲氧嘧啶（SMM)、柳氮磺吡啶（SASP)、磺胺米隆（SML)、磺胺 嘧啶银、磺胺醋酰（SA)、以及复方新诺明（甲氧苄啶+磺胺甲恶唑）。
[0008] 常见的3内酰胺类抗生素包括：青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类，以及新发展的头 霉素类、硫霉素类、单环内酰胺类等其他非典型内酰胺类抗生素。
[0009] 本发明的整合子是通过以下方法获得的：
[0010] (1)在台州市立医院重症监护室病人血液培养阳性的标本中分离出1株对头孢曲 松、庆大霉素、复方新诺明耐药的细菌。
[0011] (2)然后将分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法 (补充药敏纸片）进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为肺炎克雷伯氏菌，将其命名为 KP3349。同时，试验证实此菌株对多种抗生素有显著抗性。
[0012] (3)将KP3349菌株培养扩增，提取所述耐药菌株的质粒。
[0013] (4)将步骤（3)提取纯化后的质粒使用EcoRI酶切，琼脂糖凝胶电泳分离得到一段 长度为6554bp的DNA片段，将该DNA片段以常规方法与pMD19-T载体连接，然后热激转化 法转入感受态细胞E. coli T0P10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序。
[0014] 本发明提供了一种含有该整合子的菌株。该菌株命名为KP3349。KP3349菌株的 质粒中含有整合子Inl059,其序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0015] 本发明还提供了一种含有整合子Inl059序列的重组质粒。所述质粒包含整合子 Inl059序列。在本发明的具体的实施方案中，所述重组质粒由整合子Inl059序列和pET32a 载体重组而成，整合子插入位点在pET32a载体上EcoRI酶切位点处。所述重组质粒使用的 空载体可以使用任何常见的质粒载体代替。所述重组质粒的方法也为本领域技术人员熟知 的常规方法。
[0016] 本发明还提供了一种含有整合子Inl059的接合菌株。为了研究整合子的耐药性， 本发明利用细菌质粒转导实验来检测鉴定整合子Inl059的功能，将KP3349菌株与E. coli J53AzR(对叠氮化钠耐药）菌株共培养，通过含叠氮化钠（300mg/L)和阿米卡星（0. 06mg/ L)平板筛选接合子，将接合子做药敏试验，受体菌拥有供体菌的抗性。其中，所用阿米卡 星可用下列药物代替：氨曲南、妥布霉素、丁胺卡拉、庆大霉素、头孢替坦、头孢唑林、头孢吡 肟、头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦（舒普深）、复 方新诺明。
[0017] 本发明还提供了一种含有整合子Inl059的重组菌株。为进一步证实上述接合 菌株的抗性来源于KP3349菌株中的整合子，本发明将该整合子Inl059克隆入pET32a载 体中，整合子插入位点在pET32a载体上EcoRI酶切位点处。并将其转化入野生型E. coli JM109中，通过含有Amp的平板选阳性克隆（含有pET32a-整合子的细菌）。将阳性克隆做 药敏试验，结果显示KP3349菌株中的整合子Inl059可以使重组E. coli JM109菌株对以下 药物耐药：氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、丁胺卡拉、庆大霉素、头孢替坦、头孢唑林、头孢吡 肟、头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦（舒普深）、复 方新诺明。
[0018] 本发明的优点和有益效果：
[0019] (1)本发明首次发现了序列为SEQ ID NO. 1的包括多种耐药基因盒的整合子 Inl059,该整合子的核苷酸序列在现有技术中未见报道。
[0020] (2)本发明整合子序列的发现，为临床用药提供了一定的指导作用。有利于临床上 减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆 发性流行。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为本发明的整合子Inl059的结构示意图。
[0022] 具体的实施方式
[0023] 下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明， 并不意味着限制本发明的保护范围。
[0024] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人， 分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所描 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0025] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 实施例1整合子Inl059的鉴定
[0027] UKP3349菌株的分离和鉴定
[0028] 1. 1 材料
[0029] 细菌药敏卡：法国bio Merieux的AST-GN13。AST-GN13药敏种类有：阿米卡星、氨 苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、 环丙沙星、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、妥 布霉素、SMZ。
[0030] 补充药敏纸片（药敏平板琼脂扩散实验）：纸片来源于英国Oxoid公司，有头孢哌 酮/舒巴坦（75 y g/30 y g)、复方新诺明（30 y g)。
[0031] 1.2 方法
[0032] 仪器鉴定：将台州市立医院重症监护室病人血液培养阳性的菌株转种到血平板上 分离培养（在35°C含5% C02孵育箱中培养16-18h)，然后将分离的纯细菌按操作程序在 VITEK 2上机作细菌鉴定与药敏试验。
[0033] 补充药敏试验：将0. 5麦氏单位的菌液涂抹在MH平板上，按操作程序贴上头孢哌 酮/舒巴坦和复方新诺明纸片，在35°C含5% C02孵育箱中培养16-18h后，按CLSI 2012标 准鉴定药敏结果。
[0034] 1. 3 结果
[0035] 1. 3. 1仪器鉴定结果
[0036] 中等大小的革兰氏阴性杆菌，KIA产酸/产酸，葡萄糖与乳糖产酸产气，氧化酶阴 性，VP阳性，吲哚阴性，枸橼酸盐阳性，动力阴性，不产H 2S，符合肺炎克雷伯菌的特性，经 VITEK 2微生物分析仪鉴定为肺炎克雷伯氏菌，鉴定概率为99%，将其命名为KP3349。
[0037] 1. 3. 2药敏实验结果
[0038] 药敏实验结果表明，KP3349菌株对于以下药物产生抗性：阿米卡星、氨苄西林、氨 苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、厄他培南、 庆大霉素、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、SMZ、头孢哌酮/舒巴坦、复方新诺明。
[0039] 2、整合子Inl059的分离和鉴定
[0040] 2. 1 方法
[0041] 2. 1. 1KP3349菌株的质粒提取
[0042] 采用TaKaRa的质粒少量提取试剂盒，按照说明书操作步骤提取细菌质粒DNA，作 为PCR模板，-20°C冰箱保存备用。
[0043] 2. 1. 2整合子的获取
[0044] (1)将清洁干燥并经灭菌的0.5ml印pendorf管编号，用微量移液枪分别加入 KP3349质粒DNA 1 ii g和10X限制性内切酶反应缓冲液2 ill (Fermentas)，再加入重蒸水 使总体积为19 Ul，将管内溶液混匀后加入1 Pi EcoRI酶液（Fermentas)，用微量离心机甩 一下，使溶液集中在管底。
[0045] (2)混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（插在泡沫塑料板 上），37°C水浴保温2-3h，使酶切反应完全。
[0046](3)每管加入 2 ill 0? lmol/L EDTA(pH8. 0)，混匀，以停止反应。
[0047] (4)将酶切后的产物经过琼脂糖凝胶电泳进行分离。
[0048] 2. 1. 3整合子的鉴定
[0049] (1)将经琼脂糖凝胶电泳分离得到的长度为6554bp的DNA片段回收。
[0050] (2)使用常规方法，将步骤⑴回收的DNA片段与pMD19-T载体连接，然后热激转 化法转入感受态细胞E. coli T0P10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序。
[0051] 2. 2 结果
[0052] 测序结果显示，长度为6554bp的DNA片段属于I类整合子，该整合子包括I型整 合子的基本结构和多个基因盒，序列如SEQ ID NO. 1所不，结构不意图如图1所不。
[0053] 实施例2质粒转导实验研究整合子Inl059的功能
[0054] 1、方法
[0055] (1)供体菌为KP3349菌株，受体菌为E. coli J53AzR(对叠氮化钠耐药）。将供体 菌、受体菌分别接种于LB平板上，35°C过夜培养。挑取单个菌落分别接种于4mL的LB肉汤 中，37°C 220r/min摇菌培养至对数生长期。各取0. 5ml供、受体菌于4ml的LB肉汤中，37°C 静止过夜培养。接合子以胰大豆琼脂（TSA)平皿筛选，平板中含叠氮化钠（300mg/L)和阿 米沙星（0. 03mg/L)。置35°C孵育18-24h。提取耐药菌株的质粒（步骤同实施例1)，以PCR 法进行整合子Inl059序列的检测。
[0056] 扩增整合子Inl059序列的引物如下所示：
[0057] 正向引物：5' -AAITCACTAGTGAGGGGCGGC-3' ；
[0058] 反向引物：5 ' -CAGCTCCATCAACAAAAGGGG-3 '。
[0059] PCR 的反应体系（50ii 1) :Mg2+2. 5mmol/L,引物 30pmol/L，dNTP 0? 2mmol/L，2. 5U Tap酶及2 ill DNA模板。
[0060] 扩增条件：
[0061]94°C预变性 3min，然后 94°C变性 lmin，55°C退火 lmin, 72°C延伸 lmin，30 个循环， 最后72°C延长至10min。
[0062] 将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析。将扩增产物的长度为6554bp的DNA模板所 在的菌株称为整合子Inl059接合转移成功的阳性菌株。
[0063] (2)将阳性菌株进行药敏实验，步骤同实施例1。
[0064] 1. 2 结果
[0065] 药敏实验结果显示，整合子Inl059序列表达阳性菌株的药敏反应同KP3349菌株 相同，代表整合子Inl059序列接合转移成功，且该整合子导致了接合细菌产生了下列药物 的抗性：阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、 头孢他定、头孢曲松、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、SMZ、 头孢哌酮/舒巴坦、复方新诺明。
[0066] 实施例3基因重组实验研究整合子Inl059的功能
[0067] 1、方法
[0068] (1)将实施例2中的PCR产物（核苷酸序列为SEQ ID NO. 1)与pMD18T载体连接， 连接产物加入100 y 1 E. coli JM109的感受态中转化，在含有IPTG、x-gal、Amp的平板上培 养，将IPTG、x-gal、Amp抗性菌株提取质粒测序（步骤同实施例1)，检测整合子Inl059是 否插入基因组中。然后将整合子Inl〇59序列克隆到pET32a载体中，整合子的插入位点在 pET32a载体上EcoRI酶切位点处，按照常规方法制备，得到含整合子Inl059序列的pET32a 重组质粒。将重组质粒转化到感受态E. coli JM109细胞中。
[0069] (2)对构建成功的克隆菌进行耐药性检测
[0070] 采用法国bioMerieux的VITEK 2细菌鉴定及药敏分析系统和药敏平板琼脂扩散 方法（补充药敏纸片）对重组菌E. coli JM109(pET32a-整合子Inl059)进行耐药性检测。
[0071] 2、结果
[0072] 药敏实验结果显示，重组菌E. coli JM109(pET32a-整合子Inl059)的药敏反应同 KP3349菌株相同，代表整合子Inl059序列已经成功整合到E. coli JM109的基因组中，且该 整合子导致了重组菌E. coli JM109产生了下列药物的抗性：阿米卡星、氨苄西林、氨苄西 林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢卩比肟、头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、厄他培南、庆大 霉素、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、SMZ、头孢哌酮/舒巴坦、复方新诺明。
[0073] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【权利要求】
1. 一种含有耐药基因盒的整合子，其特征在于，所述整合子序列为SEQ ID NO. 1所示。
2. -种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒中包含权利要求1所述的整合子。
3. 根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的制备过程中使用的 载体质粒为pET32a载体。
4. 一种接合细菌，其特征在于，所述接合细菌中含有权利要求1所述的整合子；所述接 合细菌是由KP3349菌株与E. coli J53 AzR菌株制备。
5. -种重组细菌，其特征在于，所述重组细菌中含有权利要求1所述的整合子；所述重 组细菌是将权利要求2或3所述的重组质粒转入E. coli JM109菌株中制备而成。
6. 权利要求1所述的整合子的获取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 在台州市立医院重症监护室病人血液培养阳性的标本中分离出1株对头孢曲松、 庆大霉素、复方新诺明耐药的细菌； (2) 将步骤（1)分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法， 同时补充药敏纸片进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为肺炎克雷伯氏菌，命名为 KP3349 ； (3) 将KP3349菌株培养扩增，提取所述KP3349菌株的质粒； (4) 将步骤（3)提取的质粒使用EcoRI酶切，琼脂糖凝胶电泳分离得到一段长度为 6554kb的DNA片段，将所述DNA片段以常规方法与pMD19-T载体连接，然后热激转化法转入 感受态细胞E. coli TOP 10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序。
7. -种权利要求4所述的接合细菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体操 作步骤如下：将KP3349菌株与E. coli J53 AzR菌株共培养，通过含有叠氮化钠和KP3349 菌株耐受药物的平板筛选接合子。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述KP3349菌株耐受药物是阿米沙 星。
9. 一种权利要求5所述的重组细菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体操 作步骤如下：将整合子Inl059克隆入pET32a载体中，然后将重组质粒转化入野生型E. coli JM109中，通过含有Amp的平板选阳性克隆。
【文档编号】C12R1/19GK104450764SQ201410639900
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】王冬国, 陈佳玉, 张瑾, 刘双春 申请人:王冬国