向日葵黑茎病菌的检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了向日葵黑茎病菌的检测试剂盒，该检测试剂盒包括2xTaqMan?UniversalPCRMasterMix反应缓冲液、摩尔浓度为10μmol/L的正向引物、反向引物和探针，其中正向引物的核苷酸序列为：CTTGGGAAACTCGCCTCAAA，反向引物的核苷酸序列为：AAGCAAGAGGCGCAAAATGT，探针的核苷酸序列为：TATGAGCCTGGAGCGCA，本发明是一种操作简单、快速、准确鉴别向日葵黑茎病菌的检测试剂盒。
【专利说明】向日葵黑茎病菌的检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及菌种检测试剂盒，具体涉及向日葵黑茎病菌的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]向日葵黑莖病菌lindquistii Frezzi)属于格孢腔菌目(Pleosporales),小球月空菌科((Leptosphaeriaceae) (The Species Fungorum databasewebsite: http://www.speciesfungorum.0rg/Index.htm)，其无性阶段也被称之为 Phomamacdonaldii Boerema。该病菌可造成向日葵黑莖病的发生,影响向日葵果实，导致向日葵籽小、空和瘪，使向日葵种子产量和产油量严重降低，发病早期植株枯死，发病较晚者则植株矮化瘦弱甚至倒伏，重病田发病率达100%，死亡率达50%以上。鉴于其严重危害性，2010年农业部和国家质量监督检验检疫总局联合发布了第1472号公告(关于将向日葵黑茎病列为进境检疫性有害生物的公告)，将该病菌列为进境检疫性有害生物，属于一种检疫性真菌。向日葵黑茎病症状于20世纪50年代首次发现，其病原于1964年在加拿大被首次分离和鉴定，20世纪70到80年代相继扩展到欧洲、美国以及其他国家和地区。目前，该病菌分布于加拿大、前南斯拉夫、法国、阿根廷、匈牙利、罗马尼亚、美国、伊朗、巴基斯坦和澳大利亚等国家和地区，我国新疆等地有局部发生危害报道。对于向日葵黑茎病菌检测，目前主要以形态学方法鉴别，存在鉴定周期长、时效性差等问题。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供操作简单、快速、准确鉴别向日葵黑茎病菌的检测试剂盒。
[0004]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:向日葵黑茎病菌的检测试剂盒，该检测试剂盒包括2x TaqMan? Universal PCR Master Mix反应缓冲液、摩尔浓度为10μ mol/L的正向引物、反向引物和探针，正向引物LLIlF的核苷酸序列为:5’- CTT GGG AAACTC GCC TCA AA -3’，反向引物LLIlR的核苷酸序列为:5，- AAG CAA GAG GCG CAA AAT GT-3’，探针LLI的核苷酸序列为:5’ - TAT GAG CCT GGA GCG CA -3’，探针5’端含有FAM报告荧光染料，3’端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。
[0005]若为20 μ? PCR反应体系，使用时取检测试剂盒中反应缓冲液10 μ?，正向引物和反向引物各0.6 μ?，探针0.3μ?，加入终浓度约为I ng/^L的待检样品DNA提取物即模板DNA溶液I PL，用双蒸水补充到20 μ?，若为10 μ? PCR反应体系，各成份体积就相应减倍。
[0006]2x TaqMan? Universal PCR Master Mix反应缓冲液购自上海ABI有限公司、探针由上海ABI有限公司合成，正反向引物引物由上海英俊合成。
[0007]向日葵黑茎病菌的检测方法如下:DNA提取、实时荧光PCR反应、结果判定:观察实时荧光PCR仪上反应扩增曲线及其Ct值，若有特异性扩增，Ct值超过阈值即为向日葵黑茎病菌。
[0008]与现有技术相比，本发明的优点在于:向日葵黑茎病菌的检测试剂盒，该检测试剂盒包括2x TaqMan? Universal PCR Master Mix反应缓冲液、摩尔浓度为10 μ mol/L的正向引物、反向引物和探针，其中正向引物的核苷酸序列为:CTT GGG AAA CTC GCC TCA AA,反向引物的核苷酸序列为:MG CM GAG GCG CM MT GT，探针的核苷酸序列为:TAT GAGCCT GGA GCG CA，探针5’端含有FAM报告荧光染料，3’端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。该检测试剂盒只需要少量菌丝体或植物样品在数小时内就可以获得准确结果，DNA含量为0.1 pg也能灵敏检测，不仅能检测具有较多鉴定特征的向日葵黑茎病菌成熟菌丝体，还可以对形态特征较少以及其他发育形态向日葵黑茎病菌或植株上进行快速鉴定，该检测试剂盒对操作人员要求不高，因此本发明是一种操作简单、快速、准确鉴别向日葵黑茎病菌的检测试剂盒。
【具体实施方式】
[0009]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0010]实施例1、向日葵黑茎病菌的检测试剂盒
该检测试剂盒包括下述各管:2x TaqMan? Universal PCR Master Mix反应缓冲液10μ?Χ 100、摩尔浓度10 μΜ的探针0.3 PLX 100、摩尔浓度10 μΜ的正向引物和反向引物各0.6 μ?Χ 100 和双蒸水，正向引物 LLIlF 序列:5，- CTT GGG AAA CTC GCC TCA AA _3’，反向引物 LLIlR 序列:5’_ AAG CAA GAG GCG CAA AAT GT -3’，探针 LLI 序列:5’- TAT GAGCCT GGA GCG CA -3’，探针5’端含有FAM报告荧光染料，3’端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。
[0011]实施例2、实时荧光PCR检测向日葵黑茎病菌的特异性试验一、样品来源
向日葵黑莖病HLeptosphaeria lindquistii)纯培养样品8份(P40、P41、P42、P43、P44、P45、P46、P47)、交链格袍^ (Alternariaalternate、kk) I 份、Alternariahelianthiinficiens I 份(AH)、细极链格 3?(AIternariatenuissima 、AT) I份、富克葡萄孢盘菌iBotryotiniafuckeliana、BF) I份、油菜莖基溃瘍病鬼 iLeptosphaeriamaculans、LM) I Peyronellaeaaustral is\ 份(PA)、PeyronellaeacurtisiiI 份(PC)、车前草穗枯病菌iPhomopsissubordinaria'VSiyi 份、核盘菌(SclerotiniascIerot1rum> SS) I 份。
[0012]二、样品DNA的提取
称取0.01?0.1 g的上述各供试菌株菌丝体分别提取DNA，提取方法:菌丝体放入1.5 mL第一离心管中，加200 μ? 65°C水浴预热pH 8.0的十六烷基三甲基溴化铵抽提液，研磨至匀浆，再加入400 μ? 65°C水浴预热的十六烷基三甲基溴化铵抽提液，颠倒混匀后于65 °C水浴I h，冷却至室温，12000 rpm离心10 min，取第一上清液至第二离心管中，加入体积为300 PL的三羟基氨基甲烷饱和酚，体积为300 PL的氯仿和异戊醇混合液，颠倒混匀后静置，12000 rpm离心10 min，取第二上清液至第三离心管中，加入与第二上清液等体积的氯仿和异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀，12000 rpm离心10 min，取第三上清液至第四离心管中，加入与第三上清液等体积的异丙醇，轻轻颠倒混合均匀，于-20 °C下沉淀I h，12000rpm离心10 min，弃去第三上清液，在第四离心管加入质量百分浓度为70%的乙醇500 μ?,至沉淀悬浮，12000 rpm离心5 min,弃去第四上清液,室温干燥,再在第四离心管加入50 ?无菌水溶解沉淀，得到模板DNA溶液，使用分光光度计调整各菌种模板DNA溶液浓度都为Ing />L，于-20 1:贮存备用。上述十六烷基三甲基溴化铵抽提液含有质量百分浓度为2%的十六烷基三甲基溴化铵、摩尔浓度为1.4 M的氯化钠，摩尔浓度为20 mM的乙二铵四乙酸二钠，摩尔浓度为100 mM的三羟基氨基甲烷盐酸，上述氯仿和异戊醇混合液由氯仿与异戊醇按体积比为24:1配制。
[0013]三、特异性检测
用实施例1的向日葵黑茎病菌的检测试剂盒进行检测，P40、P41、P42、P43、P44、P45、P46、P47、AA、AH、AT、BF、LM、PA、PC、PS、SS各模板DNA溶液，水为空白对照，反应体系:反应缓冲液10 μ?、正向引物和反向引物各0.6 μ?、探针0.3μ?，加入WL模板DNA溶液，用灭菌双蒸水定容至20μ?，在实时荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应。反应条件为:50°C 30min ；95°C 15 min ;然后 94°C 15 s，60°C 60 s，共 40 个循环。
[0014]四、结果判定
根据有无特异性扩增曲线来判断，若有特异性扩增超过阈值就为向日葵黑茎病菌，结果显示:8个向日葵黑茎病菌样品都能检测出扩增曲线，而其他样品没有特异性扩增曲线，实时荧光PCR反应为常规技术，在此不作详细说明，本实施例检测结果说明本发明的检测试剂盒对向日葵黑茎病菌特异，灵敏。结果表明所设计的引物和探针有较强的特异性，25种真菌样品中仅能检出向日葵黑茎病菌P40、P41、P42、P43、P44、P45、P46、P47，不能检出其他真菌和水。
[0015]实施例3、PCR反应体系的优化:以实施例2中步骤二获得的P44的DNA为模板，分别对实时荧光PCR检测体系中的引物浓度和探针浓度进行优化。
[0016]一、引物浓度优化
在实施例2中步骤三的体系中其它成分浓度不变，将引物终浓度从0.1 411至1.0 μΜ以0.1 μΜ递增。反应条件按实施例2中步骤三的条件进行。结果表明，当引物终浓度为0.6μΜ时,Λ Rn值达最大、Ct值最小。经过三次重复实验,最后确定0.6 μΜ为引物最佳浓度。
[0017]二、探针浓度优化
在实施例2中步骤三的体系中其它成分浓度不变，固定优化后的引物浓度，将探针终浓度从0.1 μΜ至1.0 μΜ以0.1 μΜ递增。反应条件按实施例2中步骤三的条件进行。结果表明，当探针终浓度为0.3 μΜ时，Λ Rn值最大。经三次重复实验，最好确定0.3 μΜ为最佳探针浓度。
[0018]实施例4
以实施例2中步骤二获得的Ρ44的DNA为模板，用核酸蛋白分析仪测OD26tl及OD28tl，计算DNA的浓度，并将其稀释为20 μ L反应体系中，DNA分别为10 ng、l ngUOO pg、10 pg、lpg、0.1 pg、0.01 pg，以实施例3中步骤三获得的最优体系进行实时荧光PCR反应。反应条件按实施例2中步骤三的条件进行。结果表明，实时荧光PCR检测，其检测低限是0.1 pg。
[0019]本发明的向日葵黑茎病菌的检测试剂盒具有如下优点:1、快速简单:只需少量样品DNA，用荧光PCR仪仅需I小时就可完成PCR步骤，即可得到检测结果，且避免了普通分子检测技术中的探针制备、电泳等处理过程；2、特异性强:采用一对向日葵黑茎病菌的特有引物进行目标基因片段的扩增及一条可与模板互补配对的荧光探针进行检测，提高了特异性，有效地避免假阳性和假阴性；3、灵敏度高:由荧光PCR仪自动收集荧光信号，避免普通PCR反应后电泳分析中人为因素干扰，进一步提高灵敏度，在20 μ L反应体系中，DNA检测低限是0.1 pg。4、交叉污染低:整个检测过程完全闭管，不需PCR后处理，消除了 PCR产物的污染。
【权利要求】
1.向日葵黑茎病菌的检测试剂盒，该检测试剂盒包括2x TaqMan? Universal PCRMaster Mix反应缓冲液、摩尔浓度都为10 μ mol/L的正向引物、反向引物和探针，其特征在于所述正向引物的核苷酸序列为:CTT GGG AAA CTC GCC TCA AA，反向引物的核苷酸序列为:AAG CAA GAG GCG CAA AAT GT，探针的核苷酸序列为:TAT GAG CCT GGA GCG CA，探针5’端含有FAM报告荧光染料，3’端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。
【文档编号】C12Q1/04GK104404151SQ201410715199
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月2日 优先权日:2014年12月2日
【发明者】段维军, 蔡磊, 郭立新, 段丽君, 陈先锋 申请人:宁波检验检疫科学技术研究院, 中国科学院微生物研究所