西葫芦zymv显性抗病基因zymv-2的连锁分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了与西葫芦小西葫芦黄化花叶病毒病（ZYMV）显性抗病基因 ZYMV-2 连锁的SSR分子标记（ZY-126），属于蔬菜分子抗病育种【技术领域】，涉及ZYMV显性抗病基因连锁的SSR分子标记及其应用。所述的分子标记ZY-126与抗病基因的遗传连锁距离为0.7 cM。利用分子标记ZY-126可快速准确地检测抗病性状转育后代植株是否携带 ZYMV-2 抗病基因，从而显著提高抗病育种效率，缩短育种周期，为ZYMV抗病品种的选育奠定坚实的基础。本发明获得的ZY-126分子标记具有稳定可靠、操作简单、重复性好等优点，在鉴别抗、感品种和抗病转育后代单株时具有非常高的利用价值。
【专利说明】西葫芦ZYMV显性抗病基因 ZYMV-2的连锁分子标记及其应 用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种与西葫芦（Ci/carAiL )小西葫芦黄化花叶病毒病（ZYMV) 显性抗病基因连锁的SSR分子标记，以及该标记在检测抗病植株中的应用。
【背景技术】
[0002] 西葫芦是全球范围内普遍栽植的重要蔬菜之一，在我国的栽培面积逐年增加，特 别是近年来保护地设施栽培发展迅速，已成为继黄瓜之后的第二大栽培作物。对农民增收、 农业结构调整以及丰富人民的菜篮子有着重要意义。
[0003] 小西葫芦黄化花叶病毒病（zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)是目前危害 西葫芦等葫芦科作物生产的主要病害之一。世界范围内ZYMV传播蔓延迅速，近年来在我国 西葫芦生产和制种中的危害日趋严重和广泛(刘卫荣等，2008)。植株感染ZYMV后会产生花 叶、植株矮化畸形，果实表面瘤状凸凹不平、果肉僵硬且味苦涩等症状，使果实失去商品价 值，导致产量损失达60%以上，严重者甚至绝产（Zechmann et al.，2003;刘卫荣等，2008)。
[0004] 目前还没有防治该病毒病的有效试剂和措施，培育和推广抗病品种是减少ZYMV 危害的最经济、安全、有效措施。但目前，由于抗病基因主要来源于野生南瓜材料，且存在通 过人工接种病毒进行抗病性状检测繁琐、性状鉴定准确性差等问题，导致抗性性状转育困 难，抗病育种效率低、周期长，生产中抗病品种少，不能满足生产需要。紧密连锁的分子标记 可以加速抗病育种进程及提高选择的准确性，是分子标记辅助选择育种的必要条件。但目 前国内外还没有与西葫芦ZYMV抗病基因紧密连锁分子标记的研究报道。因此，开发与葫芦 ZYMV抗病基因紧密连锁的分子标记，对于提高西葫芦抗病育种效率，拓展抗病基因应用范 围，保障西葫芦产业的健康发展具有重要的实际应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有育种技术的上述不足，提供西葫芦ZYMV病毒病显性抗 基因雄]SSR分子标记及其应用。
[0006] 本发明的目的可通过如下技术方案实现： 西葫芦ZYMV抗病基因的分子标记，所述分子标记ZY-126 ; 所述的分子标记ZY-126 : 左端引物序列为SEQ ID NO. 1， 右端引物序列为SEQ ID NO. 2， 扩增产物为137 bp，此分子标记来自西葫芦自交系BS6染色体，为共显性分子标记，利 用Mapmaker/EXP 3. 0测得与抗病基因的遗传距离为0. 7 cM。
[0007] 本发明的另一目的可通过如下技术方案实现： 所述的与西葫芦ZYMV显性抗病基因紧密连锁的SSR分子标记的获得方法，其 特征在于，包括如下步骤： 所述SSR分子标记是应用SSR-BSA技术采用下述方法得到的：以西葫芦自交系BSll 和BS6分别作为感病和抗病亲本配制F2代分离群体，用584对SSR引物筛选与西葫芦ZYMV 显性抗病基因连锁的分子标记，得到一个共显性分子标记，即ZY126,与抗病基因 的遗传连锁距离为0. 7 cM。
[0008] 本发明的另一目的可通过如下技术方案实现： 所述的分子标记ZY-126在西葫芦种质资源抗ZYMV病毒病基因的鉴定和转移中的应 用。
[0009] 西葫芦ZYMV抗病基因的分子标记方法，用以下一对分子标记引物PCR扩 增待检测西葫芦基因组DNA，并检测扩增产物： 分子标记ZY-126 : 左端引物序列为SEQ ID NO. 1， 右端引物序列为SEQ ID NO. 2， 如果用引物ZY-126能够扩增出137 bp的扩增片段，则标志着待检西葫芦存在抗ZYMV 病毒病基因么
[0010] 本发明的另一目的可通过如下技术方案实现： 一种筛选抗ZYMV病毒病西葫芦的方法，用权利要求1所述的引物对扩增待检西葫芦基 因组DNA，如果用引物ZY-126能够扩增出137 bp的扩增片段，则标志该待检西葫芦为存在 杭病基因的抗ZYMV病毒病西葫芦。
[0011] 本发明的有益效果为： 本发明在西葫芦自交系BS6中发现了一个抗ZYMV病毒病的显性抗病基因么其优 异的抗病表现在西葫芦抗病育种中具有重要的利用价值。获得了与该抗病基因紧密连锁的 分子标记ZY-126。利用获得的分子标记进行辅助选择，成功的将抗病基因通过杂交、回交转 育的方法导入西葫芦优良自交系BSl 1中，使其获得ZYMV病毒病抗性。
[0012] 1、在西葫芦自交系BS6中鉴定了一个ZYMV显性抗病基因 2、 获得与西葫芦ZYMV显性抗病基因紧密连锁的共显性分子标记ZY-126。 ZY-126与抗病基因的遗传距离为0.7 cM。利用该标记能够通过辅助选择鉴定将抗病基因 成功导入其它西葫芦感病优良自交系，使之获得抗病性状； 3、 鉴定方便。分子标记具有扩增稳定、检测方便、快速准确等优点。用标记ZY-126检 测西葫芦显性抗病基因么可以确定抗病基因是否存在以及存在状态，并预测植株对 ZYMV病毒病的抗性，加快该抗病基因的利用； 4、 本发明提出了利用西葫芦ZYMV病毒病抗病种质资源BS6中抗病基因的方法：利用分 子标记筛选，通过杂交与回交转育将抗病基因导入西葫芦优良的感病自交系中，利用该方 法成功将抗病基因导入西葫芦优良自交系BSIi，使其获得了抗病性。
[0013]
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为分子标记ZY-126与西葫芦抗病基因的遗传连锁图，左边为标记间 的图距； 图2为分子标记扩增带型； ZY-126扩增带型，其中P1为感病亲本BS11，P2为抗病亲本BS6，Fi为杂交一代；1-14为 以BSll为轮回亲本的回交单株；M :Trans DNA markerll，箭头所指为137 bp特异扩增条 带。
[0015]
【具体实施方式】
[0016] 实施例1 与西葫芦ZYMV显性抗病基因紧密连锁的SSR分子标记，所述的分子标记为 ZY-126,其具有序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的DNA序列。
[0017] 所述的与西葫芦ZYMV显性抗病基因紧密连锁的SSR分子标记的获得方 法，其特征在于，包括如下步骤： 所述SSR分子标记是应用SSR-BSA技术采用下述方法得到的：以西葫芦自交系BSll 和BS6分别作为感病和抗病亲本配制F2代分离群体，用584对SSR引物筛选与西葫芦ZYMV 显性抗病基因连锁的分子标记，得到一个共显性分子标记，即ZY126,与抗病基因 的遗传连锁距离为0. 7 cM。
[0018] 所述的分子标记在对西葫芦种质资源ZYMV抗病基因的鉴定和转移中的应用。
[0019] 进一步的，西葫芦ZYMV抗病基因的分子标记方法，用以下的一对分子标记 引物进行PCR扩增待检测西葫芦基因组DNA，并检测扩增产物： 分子标记ZY-126 : 左端引物序列为SEQ ID NO. 1， 右端引物序列为SEQ ID NO. 2， 如果用引物ZY-126能够扩增出137 bp的扩增片段，则标志着待检测西葫芦存在抗 ZYMV 的基因
[0020] 一种筛选抗ZYMV病毒病西葫芦的方法，用所述的分子标记对扩增待检西葫芦基 因组DNA，如果用所述的分子标记ZY-126能够扩增出137 bp的扩增片段，则标志该待检西 葫芦为存在杭病基因的抗ZYMV病毒病西葫芦。
[0021] 进一步的，所述的PCR反应体积为15微升，其中IOXbuffer 1.5微升，2. 5mM dNTPs 0. 3微升，Tag酶0. 2微升，10 μ M引物各0. 3微升，模版DNA 30 ng，加 CldH2O至15 微升。
[0022] 所述PCR反应的条件为：DNA 95°C预变性3min后，94°C变性30s，55°C退火30s， 72°C延伸30s，循环35次，最后72°C延伸lOmin。
[0023] 实施例2 本实施例具体描述了所述的与西葫芦ZYMV显性抗病基因紧密连锁的SSR分子 标记的获得方法，包括以下步骤： (一）西葫芦自交系BSll与BS6 F2代的创建与表型鉴定： (1)西葫芦自交系BSll (母本）与BS6 (父本）进行杂交得到杂种F1Jig交产生F2R 群体。
[0024] (2) F2代群体单株种植于温室营养钵内，外罩防虫网，子叶完全展开后接种病毒 病，接种15天后进行抗病性状调查。鉴定结果见表1。
[0025] 表1接种ZYMV病毒病后BSl I X BS6匕代群体遗传分析
【权利要求】
1. 与西葫芦ZYMV显性抗病基因紧密连锁的SSR分子标记，其特征在于，所述的 分子标记为ZY-126,其具有序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的DNA序列。
2. -种如权利要求1所述的与西葫芦ZYMV显性抗病基因紧密连锁的SSR分子 标记的获得方法，其特征在于，包括如下步骤： 所述SSR分子标记是应用SSR-BSA技术采用下述方法得到的：以西葫芦自交系BS11 和BS6分别作为感病和抗病亲本配制F2代分离群体，用584对SSR引物筛选与西葫芦ZYMV 显性抗病基因连锁的分子标记，得到一个共显性分子标记，即ZY126,与抗病基因 的遗传连锁距离为0. 7 cM。
3. 如权利要求1所述的分子标记在对西葫芦种质资源ZYMV抗病基因的鉴定和转移中 的应用。
4. 一种检测西葫芦ZYMV抗病基因的分子标记方法，其特征在于，用以下的一对 分子标记引物进行PCR扩增待检测西葫芦基因组DNA，并检测扩增产物： 分子标记ZY-126 : 左端引物序列为SEQ ID NO. 1， 右端引物序列为SEQ ID NO. 2， 用所述的分子标记ZY-126能够扩增出137 bp的扩增片段，则标志着待检测西葫芦存 在抗zymv的基因 zrar-么
5. 根据权利要求4所述的检测西葫芦ZYMV抗病基因的分子标记方法，其特征 在于，所述的PCR反应体积为15微升，其中10 Xbuffer 1. 5微升，2. 5mM dNTPs 0. 3微升， Tag酶0. 2微升，10 y M引物各0. 3微升，模版DNA 30 ng，加 ddH20至15微升。
6. 根据权利要求4所述的西葫芦ZYMV抗病基因的分子标记方法，其特征在于， 所述PCR反应的条件为：DNA 95°C预变性3min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸 30s，循环35次，最后72°C延伸lOmin。
7. -种筛选抗ZYMV病毒病西葫芦的方法，其特征在于，用权利要求1所述的分子标记 对扩增待检西葫芦基因组DNA，用所述的分子标记ZY-126能够扩增出137 bp的扩增片段， 则标志该待检西葫芦为存在zrar-i杭病基因的抗ZYMV病毒病西葫芦。
8. 根据权利要求7所述的筛选抗ZYMV病毒病西葫芦的方法，其特征在于，所述的PCR 反应体积为15微升，其中10 Xbuffer 1. 5微升，2. 5mM dNTPs 0. 3微升，Tag酶0. 2微升， 10 U M引物各0. 3微升，模版DNA 30 ng，加 ddH20至15微升。
9. 根据权利要求7所述的筛选抗ZYMV病毒病西葫芦的方法，其特征在于，所述PCR反 应的条件为：DNA 95°C预变性3min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循环35 次，最后72°C延伸10min。
【文档编号】C12Q1/68GK104498485SQ201410717961
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】张国裕, 李海真, 张帆, 贾长才, 姜立纲 申请人:北京市农林科学院