禽流感病毒ha基因重组腺病毒的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法，该方法创新性的利用质粒pCAGGS、腺病毒穿梭质粒pShuttle、腺病毒骨架质粒pAdEasy-1等，经一系列中间过程，得到基因表达质粒等中间产物，将最后得到的重组腺病毒质粒转染293细胞；根据腺病毒感染形成的细胞病变及特异细胞免疫组化筛选重组病毒。该方法以CAG为启动子表达目的基因，显著提升了目的基因的表达水平，同时利用该方法构建的分别表达H5N1与H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白重组腺病毒，为H5、H9亚型禽流感病毒双价核酸疫苗的研制提供病毒模型，也为AIV腺病毒活载体疫苗的研制奠定基础。
【专利说明】禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及疫苗【技术领域】，具体涉及禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法。
【背景技术】
[0002] 禽流感（Avian influenza)于1878年首发于意大利，后证实是由A型流感病毒引 起。之后，禽流感不仅给畜牧业带来巨大的经济损失，而且严重威胁到人类的健康和生命。 目前已有多个国家出现H5N1亚型禽流感病毒感染人的情况。在2005年10月，我国安徽省 发生首例确证的人感染H5N1亚型禽流感病毒病例，并分离到我国首株人H5N1亚型禽流感 病毒A/Anhui/1/2005。2011年12月31日，我国深圳一人感染高致病性禽流感病毒并死亡。 虽然深圳市疾控中心宣布此毒株不会人传染人，但是世界卫生组织证实了禽流感病毒在某 些条件下可以以人传染人方式传播。所以，研制新型高效、安全的禽流感疫苗已成为病毒学 工作者的重要任务。
[0003] 目前，主要是通过接种疫苗来预防该病的发生。常规灭活疫苗对该病的免疫效果 不佳，而弱毒疫苗则存在潜在的生物安全问题。因此，开发新型、高效、廉价、安全的疫苗势 在必行。随着分子生物学技术的飞速发展，学者们不断进行着新型基因工程流感疫苗的研 究。
[0004] 现有技术中，无论制备核酸疫苗还是制备其他基因工程疫苗，相关抗原的制备都 是必要技术条件。HA蛋白为AIV的表面糖蛋白，病毒感染后能够诱导机体产生特异性抗HA 蛋白的抗体，该抗体具有病毒中和作用，因此，HA基因在流感病毒基因工程疫苗中被作为重 要的靶抗原。
[0005] 然而仅仅确定HA蛋白或HA蛋白表达基因作为抗原只是从基础角度确定可用的抗 原类别。在此基础上如何开发一种表达稳定、安全性高的HA蛋白（或HA基因）表达系统 成为了成功开发相关疫苗的技术关键。此外，如果该表达系统能够共表达多种AIV病毒亚 型抗原将为制备禽流感病毒多价疫苗奠定了良好的技术基础。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒 的制备方法，以解决现有技术中HA基因表达系统表达效率较低的技术问题。
[0007] 本发明解决的另一技术问题是现有技术中无法以一个表达系统共表达多种病毒 亚型抗原的技术问题。
[0008] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0010] 1)将具有禽流感病毒HA基因的片段连接到腺病毒穿梭质粒上，将连接产物导入 大肠杆菌中扩增，而后提取重组腺病毒穿梭质粒；
[0011] 2)将步骤1)提取得到的重组腺病毒穿梭质粒经单酶切后导入含有腺病毒骨架质 粒的大肠杆菌中进行同源重组，而后提取重组腺病毒质粒；
[0012] 3)将步骤2)提取得到的重组腺病毒质粒线性化后转染293细胞，包装，即得到禽 流感病毒HA基因重组腺病毒；
[0013] 在此基础上，所述具有禽流感病毒HA基因的片段是连接有CAG启动子的禽流感病 毒HA基因片段。
[0014] 优选的，所述连接有CAG启动子的禽流感病毒HA基因片段是通过以下方法制备 的：将禽流感病毒HA基因片段与pCAGGS载体连接，而后将连接产物导入大肠杆菌扩增，而 后提取重组质粒，而后酶切得到CAG-HA基因片段。
[0015] 优选的，所述禽流感病毒HA基因有两种，分别是H5N1型禽流感病毒HA基因和 H9N2型禽流感病毒HA基因，先完成其中一种禽流感病毒HA基因片段与pCAGGS载体的连 接，而后再与另一种禽流感病毒HA基因片段连接。在该优选方案中连接得到的产物结构 为-CAG-HA(H5N1)-CAG-HA(H9N2)_。
[0016] 在以上任一技术方案基础上可以执行以下优选：
[0017] 步骤1)所述腺病毒穿梭质粒是pShuttle质粒；
[0018] 步骤1)所述的大肠杆菌为DH5 α大肠杆菌。
[0019] 步骤2)所述大肠杆菌为BJ5183大肠杆菌。
[0020] 步骤2)所述的腺病毒骨架质粒是腺病毒骨架质粒pAdEasy-Ι。
[0021] 步骤2)所述的单酶切是利用Pme I酶实现的。
[0022] 步骤3)所述的293细胞为AD293细胞。
[0023] 步骤3)所述的线性化是利用Pac I酶实现的。
[0024] CAG启动子是人工构建的组合启动子，由巨细胞病毒早期增强子（early enhancer element)和鸡β-肌动蛋白（chicken beta-actin)启动子组成，本发明以CAG为启动子表 达目的基因，显著提升了目的基因的表达水平。
[0025] 与此同时本发明构建一株分别表达H5N1与H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白重组 腺病毒，为H5、H1亚型禽流感病毒双价核酸疫苗的研制提供病毒模型，也为AIV腺病毒活载 体疫苗的研制奠定基础。本发明方法采用第三代腺病毒载体，由于该载体缺失全部的腺病 毒蛋白编码序列，因此感染后没有病毒蛋白表达，降低了机体的免疫反应和细胞毒性，提高 了安全性。
[0026] 本发明创新性的利用质粒pCAGGS、腺病毒穿梭质粒pShuttle、腺病毒骨架质粒 pAdEasy-Ι等，经一系列中间过程，得到基因表达质粒等中间产物，将最后得到的重组腺病 毒质粒转染293细胞；根据腺病毒感染形成的细胞病变及特异细胞免疫组化筛选重组病 毒，用PCR鉴定该重组腺病毒。该重组腺病毒为H5、H9亚型禽流感病毒双价核酸疫苗的研 制提供病毒模型，也为进一步研究开发基因工程疫苗奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1是本发明重组腺病毒穿梭载体PCR鉴定结果，M:DL8000 ;
[0028] 图2是本发明重组腺病毒质粒酶切（Pac I)鉴定结果，M:DL15000,其中PacI酶切 除特异4. 5kb片段，证明重组成功；
[0029] 图3是本发明重组腺病毒PCR鉴定结果，M:DL2000 ;其中1号代表HA(H5N1)，2号 代表HA (H9N2)，3号为对照试验；
[0030] 图4是本发明重组腺病毒二次接种AD293细胞结果，其中A是阴性对照B细胞病 变；
[0031] 图5是本发明重组腺病毒电镜观察结果。
【具体实施方式】
[0032] 以下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在 以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0033] 以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情 况下可允许数量有一定的变动。因此，用"大约"、"左右"等语言所修正的数值不限于该准 确数值本身。在一些实施例中，"大约"表示允许其修正的数值在正负百分之十（10%)的 范围内变化，比如，"大约1〇〇"表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在"大约第 一数值到第二数值"的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近 似性语言可能与测量仪器的精度有关。
[0034] 除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人 员普遍理解的相同含义。
[0035] 以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果 取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0036] 实施例1
[0037]目的基因引物设计及重组穿梭载体构建根据GenBank数据库提供的H5N1和H9N2 亚型AIV HAl核酸序列设计引物，并在HA基因上、下游分别引入限制性酶切位点。将HA与经 内切酶Sal I和Xho I双酶切后线性化的pShuttle载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5a， 挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定（上海生工公司进行测序分析）。鉴定阳性克隆的引物 序列：
[0038] F:5'-ACGCGTCGACAAAATGAAGGCAATACTAGTGTT-3'
[0039] R:5,-CGCTCGAGGGGCCCTGGGTTGGACTCGACGTCGCCGGCCAACTTGAG-3'
[0040] PCR反应循环条件：95°C预变性Imin ;95°C变性30s，60°C退火40s，72°C延伸 5〇8(30个。5^168);最后72°〇延伸1〇111；[11。
[0041] 将鉴定正确的重组载体经Xho I和Xba I线性化后与H9连接，转化DH5 a感受态， 挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定（上海生工公司进行测序分析）。鉴定阳性克隆的引物 序列：
[0042] F :5'-ACGCGTCGACAAAATGAAGGCAATACTAGTGTT-3'，
[0043] R:5'-GCTCTAGAGCTCAGCCTCTAGTTTGTTTCT-3'
[0044] ?〇?反应循环条件：951：预变性11^11;951：变性308,591：退火408,721：延伸 9〇8(30个。5^168);最后72°〇延伸1〇111；[11。
[0045] 实施例2
[0046] 重组腺病毒质粒的构建及重组腺病毒的获得，将重组腺病毒穿梭质粒用限制性内 切酶Pme I线性化、纯化回收后，转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-Ι的BJ5183感受态 细胞进行同源重组。Kan抗性筛选后提取质粒，对提取后的质粒用Pac I进行酶切鉴定和 PCR鉴定。为了获得大量高质量的重组质粒，将筛选的阳性重组腺病毒质粒转化于宿主菌 DH5a扩增。
[0047] 实施例3
[0048] -种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0049] 1)将具有禽流感病毒HA基因的片段连接到腺病毒穿梭质粒上，将连接产物导入 大肠杆菌中扩增，而后提取重组腺病毒穿梭质粒；
[0050] 2)将步骤1)提取得到的重组腺病毒穿梭质粒经单酶切后导入含有腺病毒骨架质 粒的大肠杆菌中进行同源重组，而后提取重组腺病毒质粒；
[0051] 3)将步骤2)提取得到的重组腺病毒质粒线性化后转染293细胞，包装，即得到禽 流感病毒HA基因重组腺病毒；
[0052] 同时：所述具有禽流感病毒HA基因的片段是连接有CAG启动子的禽流感病毒HA 基因片段。
[0053] 在以上技术方案的基础上，所述连接有CAG启动子的禽流感病毒HA基因片段是通 过以下方法制备的：将禽流感病毒HA基因片段与pCAGGS载体连接，而后将连接产物导入大 肠杆菌扩增，而后提取重组质粒，而后酶切得到CAG-HA基因片段；其中所述禽流感病毒HA 基因有两种，分别是H5N1型禽流感病毒HA基因和H9N2型禽流感病毒HA基因，先完成其中 一种禽流感病毒HA基因片段与pCAGGS载体的连接，而后再与另一种禽流感病毒HA基因片 段连接。
[0054] 在以上技术方案的基础上：步骤1)所述腺病毒穿梭质粒是pShuttle质粒；步骤 1)所述的大肠杆菌为DH5 a大肠杆菌；步骤2)所述大肠杆菌为BJ5183大肠杆菌；步骤2) 所述的腺病毒骨架质粒是腺病毒骨架质粒PAdEasy-I ;步骤2)所述的单酶切是利用Pme I 酶实现的；步骤3)所述的293细胞为AD293细胞；步骤3)所述的线性化是利用Pac I酶实 现的。
[0055] 实施例4
[0056] -种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0057] 1)将具有禽流感病毒HA基因的片段连接到腺病毒穿梭质粒上，将连接产物导入 大肠杆菌中扩增，而后提取重组腺病毒穿梭质粒；
[0058] 2)将步骤1)提取得到的重组腺病毒穿梭质粒经单酶切后导入含有腺病毒骨架质 粒的大肠杆菌中进行同源重组，而后提取重组腺病毒质粒；
[0059] 3)将步骤2)提取得到的重组腺病毒质粒线性化后转染293细胞，包装，即得到禽 流感病毒HA基因重组腺病毒；
[0060] 同时：所述具有禽流感病毒HA基因的片段是连接有CAG启动子的禽流感病毒HA 基因片段。
[0061] 在以上技术方案的基础上，所述连接有CAG启动子的禽流感病毒HA基因片段是通 过以下方法制备的：将禽流感病毒HA基因片段与pCAGGS载体连接，而后将连接产物导入大 肠杆菌扩增，而后提取重组质粒，而后酶切得到CAG-HA基因片段；其中所述禽流感病毒HA 基因有两种，分别是H5N1型禽流感病毒HA基因和H9N2型禽流感病毒HA基因，先完成其中 一种禽流感病毒HA基因片段与pCAGGS载体的连接，而后再与另一种禽流感病毒HA基因片 段连接。
[0062] 在以上技术方案的基础上：步骤1)所述腺病毒穿梭质粒是pShuttle质粒；步骤 2)所述的腺病毒骨架质粒是腺病毒骨架质粒pAdEasy-Ι ;步骤3)所述的293细胞为AD293 细胞。步骤3)所述的线性化是利用Pac I酶实现的。
[0063] 实施例5
[0064] 一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0065] 1)将具有禽流感病毒HA基因的片段连接到腺病毒穿梭质粒上，将连接产物导入 大肠杆菌中扩增，而后提取重组腺病毒穿梭质粒；
[0066] 2)将步骤1)提取得到的重组腺病毒穿梭质粒经单酶切后导入含有腺病毒骨架质 粒的大肠杆菌中进行同源重组，而后提取重组腺病毒质粒；
[0067] 3)将步骤2)提取得到的重组腺病毒质粒线性化后转染293细胞，包装，即得到禽 流感病毒HA基因重组腺病毒；
[0068] 同时：所述具有禽流感病毒HA基因的片段是连接有CAG启动子的禽流感病毒HA 基因片段。
[0069] 在以上技术方案的基础上，所述连接有CAG启动子的禽流感病毒HA基因片段是通 过以下方法制备的：将禽流感病毒HA基因片段与pCAGGS载体连接，而后将连接产物导入大 肠杆菌扩增，而后提取重组质粒，而后酶切得到CAG-HA基因片段。
[0070] 在以上技术方案的基础上：步骤1)所述腺病毒穿梭质粒是pShuttle质粒；步骤 1)所述的大肠杆菌为DH5 α大肠杆菌；步骤2)所述大肠杆菌为BJ5183大肠杆菌；步骤3) 所述的293细胞为AD293细胞。
[0071] 实施例6
[0072] -种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0073] 1)将具有禽流感病毒HA基因的片段连接到腺病毒穿梭质粒上，将连接产物导入 大肠杆菌中扩增，而后提取重组腺病毒穿梭质粒；
[0074] 2)将步骤1)提取得到的重组腺病毒穿梭质粒经单酶切后导入含有腺病毒骨架质 粒的大肠杆菌中进行同源重组，而后提取重组腺病毒质粒；
[0075] 3)将步骤2)提取得到的重组腺病毒质粒线性化后转染293细胞，包装，即得到禽 流感病毒HA基因重组腺病毒；
[0076] 同时：所述具有禽流感病毒HA基因的片段是连接有CAG启动子的禽流感病毒HA 基因片段。
[0077] 在以上技术方案的基础上：步骤1)所述的大肠杆菌为DH5ci大肠杆菌；步骤2)所 述大肠杆菌为BJ5183大肠杆菌；步骤2)所述的单酶切是利用Pme I酶实现的；步骤3)所 述的293细胞为AD293细胞；步骤3)所述的线性化是利用Pac I酶实现的。
[0078] 实施例7
[0079] -种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0080] 1)将具有禽流感病毒HA基因的片段连接到腺病毒穿梭质粒上，将连接产物导入 大肠杆菌中扩增，而后提取重组腺病毒穿梭质粒；
[0081] 2)将步骤1)提取得到的重组腺病毒穿梭质粒经单酶切后导入含有腺病毒骨架质 粒的大肠杆菌中进行同源重组，而后提取重组腺病毒质粒；
[0082] 3)将步骤2)提取得到的重组腺病毒质粒线性化后转染293细胞，包装，即得到禽 流感病毒HA基因重组腺病毒；
[0083] 同时：所述具有禽流感病毒HA基因的片段是连接有CAG启动子的禽流感病毒HA 基因片段。
[0084] 以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法，该方法包括以下步骤： 1) 将具有禽流感病毒HA基因的片段连接到腺病毒穿梭质粒上，将连接产物导入大肠 杆菌中扩增，而后提取重组腺病毒穿梭质粒； 2) 将步骤1)提取得到的重组腺病毒穿梭质粒经单酶切后导入含有腺病毒骨架质粒的 大肠杆菌中进行同源重组，而后提取重组腺病毒质粒； 3) 将步骤2)提取得到的重组腺病毒质粒线性化后转染293细胞，包装，即得到禽流感 病毒HA基因重组腺病毒； 其特征在于：所述具有禽流感病毒HA基因的片段是连接有CAG启动子的禽流感病毒 HA基因片段。
2. 根据权利要求1所述的一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法，其特征在 于所述连接有CAG启动子的禽流感病毒HA基因片段是通过以下方法制备的：将禽流感病毒 HA基因片段与pCAGGS载体连接，而后将连接产物导入大肠杆菌扩增，而后提取重组质粒， 而后酶切得到CAG-HA基因片段。
3. 根据权利要求2所述的一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法，其特征在 于所述禽流感病毒HA基因有两种，分别是H5N1型禽流感病毒HA基因和H9N2型禽流感病 毒HA基因，先完成其中一种禽流感病毒HA基因片段与pCAGGS载体的连接，而后再与另一 种禽流感病毒HA基因片段连接。
4. 根据权利要求1?3任一项所述的一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法， 其特征在于步骤1)所述腺病毒穿梭质粒是pShuttle质粒。
5. 根据权利要求1?3任一项所述的一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法， 其特征在于步骤1)所述的大肠杆菌为DH5 a大肠杆菌。
6. 根据权利要求1?3任一项所述的一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法， 其特征在于步骤2)所述大肠杆菌为BJ5183大肠杆菌。
7. 根据权利要求1?3任一项所述的一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法， 其特征在于步骤2)所述的腺病毒骨架质粒是腺病毒骨架质粒pAdEasy-1。
8. 根据权利要求1?3任一项所述的一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法， 其特征在于步骤2)所述的单酶切是利用Pme I酶实现的。
9. 根据权利要求1?3任一项所述的一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法， 其特征在于步骤3)所述的293细胞为AD293细胞。
10. 根据权利要求1?3任一项所述的一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方 法，其特征在于步骤3)所述的线性化是利用Pac I酶实现的。
【文档编号】C12N15/861GK104404005SQ201410811399
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】王寿山, 李亚杰, 郁宏伟, 杨保收, 梁武 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司