一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及检测方法与检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及检测方法与检测试剂盒，其中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，检测方法为首先提取待测样品的基因组DNA；然后以该基因组DNA为模板，与特异性引物Lm16、PCR缓冲液、MgCl2溶液、脱氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶混合配置PCR反应体系，进行PCR反应；最后检测PCR产物是否为大小为1623bp的单一扩增产物。试剂盒包括特异性引物、PCR缓冲液、MgCl2溶液、脱氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶。本发明提供的试剂盒能够有效地检测出食品中的单核细胞增生李斯特菌氏菌，且细菌的检测灵敏度高，特异性好，抗干扰能力强。
【专利说明】-种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及检 测方法与检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是食源性致病菌检测【技术领域】，是一种用于检测单核细胞增生李斯 特氏菌（Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌）的核苷酸序列及检测方法与检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes, LM)是一种人畜共患病的 病原菌，属于李斯特菌属（Listeria spp.)，在自然界中的广泛存在，当牲畜感染后，通过食 物链最后导致人类的感染。据WHO报道，健康人的粪便中单增李斯特菌携带率为0.6%? 16%，有70%的人可短期带菌。人类受感染后可导致胃肠炎、败血症、脑膜炎、流产等疾 病，其中孕妇、婴儿、老年人及免疫力低下者为易感人群，人类感染单增李斯特菌后有高达 20 %?30 %的致死率。因此，2002年WHO将单增李斯特菌列为仅次于大肠杆菌0157、沙门氏 菌、志贺氏菌后的第四大重要的食源性致病菌。单增李斯特在4°C的环境中仍可生长繁殖， 是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。国际国内食品标准规定食品中致病菌不得检 出，为有效控制原菌的发生和扩散，有效控制和预防食品中单增李斯特菌污染至关重要。
[0003] 目前，单增李斯特菌的检测方法以传统的鉴别培养为基础，通过分离培养、生化反 应、溶血试验、动物试验等进行分离鉴定。实验设备要求不高，可操作性强，但检验周期长， 需6-7d。一些快速单增李斯特菌检测方法除了 ELISA法应用于实际检测外，分子生物学方 法大多数处于科学研究阶段，尚未广泛应用。因此单增李斯特菌急需特异性和敏感度高的 快速诊断方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种用于检测单核细胞 增生李斯特氏菌的核苷酸序列及检测方法与检测试剂盒；检测试剂盒具有特异性好、灵敏 度高、检测时间短的单核细胞增生李斯特氏菌的特点，提高其检测效率和精确度。
[0005] 技术方案
[0006] -种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列，包括1623bp，序列为SEQ ID NO. 1 所示。
[0007] -种检测检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步骤：
[0008] (1)提取待测样品的基因组DNA ;
[0009] (2)以步骤⑴所提取的基因组DNA为模板，与特异性引物Lml6、PCR缓冲液、MgCl2溶液、脱氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶混合配置PCR反应体系，进行PCR反应；
[0010] 其中特异性引物 Lml6 为 Lml6F :5' -CTGITCGTCGGTCCGTGGTA-3'，
[0011] Lml6R :5' -CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3' ；
[0012] (3)检测PCR产物是否为权利要求1所述的大小为1623bp的单一扩增产物。
[0013] 以上检测方法的步骤（1)中，提取基因组DNA的方法为分子生物学领域常用方法， 各种市售细菌基因组DNA提取试剂盒均可实现相同提取目的。
[0014] 在本发明种扩增产物的判定原则为PCR反应之后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，若 步骤（2)所得PCR反应扩增产物在1623bp位置有对应产物，则判定结果为阳性，若所得PCR 产物无扩增条带或在1623bp位置无对应产物，则判定结果为阴性。
[0015] 进一步地，以上所述的检测检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，步骤（2)中PCR 反应体系包括 10XPCR buffer，5.0 ?10. OmM MgCl2,1.0 ?2. OmM dNTP，10 ?20 ii M 引物 Lml6F，10 ?20iiM 引物 Lml6R，1 ?10ng/ii L 基因组 DNA，0. 5 ?IU Taq DNA 聚合酶，双蒸 水补齐至 25 ii L ;PCR 反应过程为：① 94°C，3min ;② 94°C，30s ;③ 60°C，30s ;④ 72°C，75s ; 步骤②至④循环35次；⑤72°C，IOmin ;⑥4°C保存。
[0016] 进一步地，以上所述的检测检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，步骤（3)中PCR 反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。
[0017] 一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒，包括特异性引物Lml6、PCR 缓冲液、MgCl2溶液、脱氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶，所述特异性引物Lml6序列 如下：
[0018] 上游引物 Lml6F :5' -CTGITCGTCGGTCCGTGGTA-3'
[0019] 下游引物 Lml6R :5' -CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3'。
[0020] 进一步地，所述的用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒，所述试剂盒 还包括含有以上所述的核苷酸序列的单增李斯特氏菌标准菌株的DNA标准品。
[0021] 进一步地，所述的用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒，PCR缓冲液为 10XPCR buffer，MgCl2溶液浓度为5. 0?10. OmM，脱氧三磷酸核苷混合物浓度为I. 0? 2. OmM，引物Lml6F浓度为10?20 ii M，引物Lml6R浓度为10?20 ii M，TaqDNA聚合酶活为 0? 5 ?1U。
[0022] 本发明适用于食品样品，尤其是液态乳制品、新鲜禽肉、水产品及冷冻食品。
[0023] 有益效果
[0024] 本发明提供的单核细胞增生李斯特氏菌检测试剂盒及检测方法，具有特异性好、 灵敏度高、抗干扰性强、检测效率高、结果判定简单的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为实施例1中引物对Lml6以李斯特菌属内六个种为模板进行PCR反应 的2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中，M:DS 2000DNA marker。CK:空白对照（CldH2O)。 泳道 1 - 16 依次为：单增李斯特菌（CICC21662, CICC21632, CICC21633, CICC21634， CICC21635, CICC21637, CICC21638, CICC21639, CICC21533 及 CICC21583)，英诺克李斯特菌 (CICC10417, CICC10416)，伊氏李斯特菌（CICC21663)，格氏李斯特菌（CICC21670)，斯氏李 斯特菌（CICC21671)，威氏李斯特菌（CICC21672)。
[0026] 图2为实施例1中测定基因组检测灵敏度和细胞培养物检测灵敏度的PCR产物 2%琼脂糖凝胶电泳结果。图中，M :DNA ladder I marker。CK:空白对照（CldH2O)。图（A) 对应于基因组检测灵敏度，泳道1-10分别对应不同基因组DNA浓度：11. 9ng/ii L，I. 19ng/ U L, 119. Opg/u L,11. 9pg/u L,I. 19pg/u L,119. Ofg/u L,11. 9fg/u L,I.19fg/u L, 119. 0ag/iiL，11.9ag/iiL。图（B)对应于细胞的检测灵敏度，泳道1-10分别对应细胞浓 度 I. 89X 109cfu/mL，I. 89X 108cfu/mL，I. 89X 107cfu/mL，I. 89X 106cfu/mL，I. 89X IO5Cfu/ mL, I. 89 X 104cfu/mL, I. 89 X 103cfu/mL, 189cfu/mL, 18. 9cfu/mL, I. 89cfu/mL。
[0027] 图3为实施例I中测定抗干扰能力的PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳检测结 果。M:DS? 2000 DNA marker。N:阴性对照（CldH2O)。图中：泳道1-5对应单增李斯特菌 CICC21635和大肠杆菌0157 CICC21530的混合物，单增李斯特菌CICC21635和肠炎沙门氏 菌CMCC50041的混合物，单增李斯特菌CICC21635和金黄色葡萄球菌ATCC27217的混合物， 单增李斯特菌CICC21635和英诺克李斯特菌CICC10417的混合物，单增李斯特菌和其它四 种菌的混合物。
【具体实施方式】
[0028] 下面通过实施例和附图的方式来说明和解释本发明，但本发明并不只是限制在所 述的实施例范围。本实例中，所有引物均交付上海生工生物工程技术服务有限公司合成，所 使用的DNA标准分子量DS? 2000DNA marker及DNA ladder I购置广州东盛生物科技有限 公司。
[0029] 实施例1 :对单核细胞增生李斯特菌标准菌株CICC21635的检测
[0030] (1)采用本发明的一对引物Lml6对单核细胞增生李斯特菌标准菌株CICC21635进 行PCR检测。
[0031] 所用引物对Lml6的序列如下：
[0032] Lml6F :5' -CTGTTCGTCGGTCCGTGGTA-3'（SEQ ID NO. 2);
[0033] Lml6R :5, -CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3,（SEQ ID NO. 3)。
[0034] 所对应的PCR扩增产物大小为1623bp。
[0035] 本发明所使用的PCR反应体系如下：
[0036] 所述优化的PCR反应体系包括 10XPCR buffer，5. 0 ?10. OmM MgCl2,1. 0 ?2. OmM dNTP，10 ?20iiM 引物 Lml6F，10 ?20iiM 引物 Lml6R，1 ?10ng/ii L 基因组 DNA，0. 5 ?IU TaqDNA聚合酶，双蒸水补齐至25 ii L ;所述最适的PCR反应程序为：①94°C，3min ;②94°C， 30s ;③60°C，30s ;④72°C，75s ;步骤②至④循环35次；⑤72°C，10min ;⑥4°C保存。
[0037] 在最适的反应条件下，均能够获得单一的，清晰的1623bp大小条带。
[0038] 因此本发明所建立的PCR检测方法如下：
[0039] 在 PCR 反应管中依次加入 10XPCR buffer 2. 5 ii L，20mM MgCl2L 5 ii L，2. OmM dNTP liiL，10iiM3_Lml6F I y L，10 y M 弓丨物 Lml6R I y L，IOng/y L 基因组 DNA I u L, IU/ii L Taq DNA聚合酶Iii L，其余以双蒸水补齐，总体积为25 iiL，并设置空白对照。将 PCR反应管放入离心机离心混匀反应体系后，放入PCR仪，按照如下条件进行反应：①94°C， 3min ;② 94°C，30s ;③ 60°C，30s ;④ 72°C，75s ;步骤②至④共 35 个循环；⑤ 72°C，10min ; ⑥4°C保存。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测。图1即为Lml6的PCR检测结果， 其条带大小为1623bp，清晰可见，经测定，该1623bp大小的条带的序列为SEQ ID NO. 1所 /Jn 〇
[0040] ⑵特异性评价试验
[0041] 将10株单核细胞增生李斯特菌标准菌株和5株单核细胞增生李斯特菌食品分离 株，以及同属于李斯特菌属的其他5个种标准菌株，接种于BHI培养基中，于37°C，180rpm 过夜培养；取ImL菌液于I. 5mL离心管中，按照常规的基因组提取方法提取并纯化基因组 DNA ;基因组DNA放置于-20°C备用。5株单核细胞增生李斯特菌食品分离菌株通过生理生 化鉴定到种。表1中所示的李斯特菌属外的其他细菌的基因组DNA提取和纯化类似。本发 明所涉及的菌株均可以通过公开途径获得。
[0042] 将提取的基因组DNA稀释至IOng/ ii L后各取I ii L作为模板进行PCR反应。反应 完毕之后，2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据是否在1623bp处有单一条带来判断 结果为阴性还是阳性。详细的PCR结果见表1。
[0043] 表1中共涉及41株菌株，李斯特菌属标准菌株共计16株，其中，单核细胞增生李 斯特菌10株，英诺克李斯特菌2株，伊氏李斯特菌、格氏李斯特菌、斯氏李斯特菌和威氏李 斯特菌各1株。单核细胞增生李斯特菌食品分离菌株5株。李斯特菌属外共20株菌株，其 中，沙门氏菌属6株，克诺罗杆菌属6株，大肠杆菌1株，耶尔森氏菌1株，志贺氏菌1株，金 黄色葡萄球菌1株，蜡样芽胞杆菌1株，奇异变形杆菌1株，荧光假单胞菌1株，副溶血弧菌 1株。表1为特异性评价试验的PCR结果，结果表明除单核细胞增生李斯特菌标准菌株外， 其余PCR结果均为阴性，这表明本发明中的检测方法具有较高的特异性。
[0044] 表1引物特异性评价实验采用的菌株及其PCR结果
[0045]
【权利要求】
1. 一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列，其特征在于，包括1623bp， 序列为SEQ ID NO. 1所示。
2. -种检测检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取待测样品的基因组DNA ; (2) 以步骤（1)所提取的基因组DNA为模板，与特异性引物Lml6、PCR缓冲液、1%(：12溶 液、脱氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶混合配置PCR反应体系，进行PCR反应；其中 特异性引物 Lml6 为 Lml6F :5' -CTGITCGTCGGTCCGTGGTA-3'， Lml6R:5' -CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3' ； (3) 检测PCR产物是否为权利要求1所述的大小为1623bp的单一扩增产物。
3. 根据权利要求2所述的检测检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，步 骤（2)中 PCR反应体系包括 10XPCR buffer，5.0~10.0mM MgCl2，1.0~2.0mM dNTP，10~20iiM 引物1^16卩，10~2011]?引物1^161?，1~10叩/111基因组0嫩，0.5~川139 0嫩聚合酶，双蒸 水补齐至 25 ii L ;PCR 反应过程为：① 94°C，3min ;② 94°C，30s ;③ 60°C，30s ;④ 72°C，75s ; 步骤②至④循环35次；⑤72°C，lOmin ;⑥4°C保存。
4. 根据权利要求2所述的检测检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，步 骤（3)中PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。
5. -种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒，其特征在于，包括特异性引 物Lml6、PCR缓冲液、MgCl2溶液、脱氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶，所述特异性引 物Lml6序列如下： 上游引物 Lml6F :5' -CTGITCGTCGGTCCGTGGTA-3' 下游引物 Lml6R :5' -CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3'。
6. 根据权利要求5所述的用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒，其特征 在于，所述试剂盒还包括含有权利要求1所述的核苷酸序列的单增李斯特氏菌标准菌株的 DNA标准品。
7. 根据权利要求5所述的用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒，其特征在 于，PCR缓冲液为10XPCR buffer，MgCl2溶液浓度为5. 0~10. OmM，脱氧三磷酸核苷混合物 浓度为1. 〇~2. OmM，引物Lml6F浓度为10~20iiM，引物Lml6R浓度为10~20iiM，TaqDNA聚合 酶活为〇. 5~1U。
【文档编号】C12R1/01GK104450940SQ201410833123
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月29日 优先权日:2014年12月29日
【发明者】陆兆新, 陶婷婷, 别小妹, 吕凤霞, 张充, 赵海珍 申请人:南京农业大学