本发明涉及兽医生物制品
技术领域：
，具体涉及一种对猪有免疫增强活性的CpGODN的制备方法。
背景技术：
：胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸(CpGoligodeoxymieleotides，CpGODN)，也称为免疫刺激DNA序列，是一类以非甲基化的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸为核心的特定核苷酸序列，可诱发机体产生多种免疫学效应(如活化免疫细胞)，促进其分泌多种细胞因子，提高机体的特异与非特异性免疫反应能力。功能研究发现，CpGODN可活化B细胞、NK细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞、T细胞等免疫细胞，诱导产生IL-12、TNF-d、INF-γ等多种细胞因子，促进MHCII类分子和共刺激因子CD40、CD80、CD86的表达。更重要的是，它能够增强抗原的加工提呈，诱导免疫应答向Th1型转换，产生较强的特异性细胞免疫和体液免疫。因此，CpGODN不仅是一种有效的免疫增强剂，也是理想的Th1型免疫佐剂，对于传统疫苗而言是一种优于铝制剂的佐剂。当前高致病性猪蓝耳病、高致病性禽流感、口蹄疫、猪瘟等重大动物疫病一直威胁着邕宁区畜牧业的健康发展，目前对于CpGODN的研究集中在其作为免疫佐剂增强疫苗毒株的免疫增强作用上，而将CpGODN作为饲料添加剂的应用鲜有报道，本研究将进一步推动新型的免疫增强剂CpGODN在猪病免疫防治中的应用，为猪病防治提供新的方法和思路。技术实现要素：本发明为解决上述技术问题，提供了一种对猪有免疫增强活性的CpGODN的制备方法。具体是通过以下技术方案来实现的：一种对猪有免疫增强活性的CpGODN的制备方法，包括以下步骤：(1)CpGODN量产，包括以下步骤：a、发酵：将CpGODN质粒转入大肠杆菌DH5α菌株中，35～36℃，250～280rpm震荡培养2～2.5h，得大肠杆菌菌液，将其按1∶70～80的体积比接种于发酵培养基中，发酵培养15～20h。b、萃取：将步骤a中发酵后的菌液震荡搅拌，随后按每ml菌液加入50～60μg的溶菌酶标准加入，搅拌均匀，于35.2～35.8℃的恒温水浴下，搅拌8～12min，随后，按每ml菌液加入0.2～0.3ml的LiCl，在10000r/min的转速下离心6～8min，取上清。c、加热：在步骤b中的上清，震荡搅拌15～20min，置于沸水浴中加热20～25min，冷却至20～25℃，加入上清等质量的异丙醇，沉降离心取沉淀。d、灭菌：加入沉淀质量的1～1.5倍的乙醇，静置20～30min，减压蒸馏回收乙醇即可。(2)包膜剂：将20～30份β-环糊精、6～8份乙基纤维素、和35～40份的蒸馏水混合得混合料，在100℃下水浴搅拌至体积浓缩至混合料体积的1/3，冷却至常温后，加入5～7份的薄荷油、2.5～3份的磷酸，70℃下水浴搅拌20～30min。(3)配料：将步骤(2)中的包膜剂按1～1.5μm的厚度涂覆在步骤(1)中的灭菌后的沉淀上，在35～40℃下，在400～500次/min的振动频率下振动3～4min，得到微胶囊，在100份日粮中添加0.05～0.1份的微胶囊，拌匀。进一步，所述的发酵培养基，由以下按重量份计的原料组成：牛肉浸膏4～5、蛋白胨1～2、葡萄糖2.5～4、琼脂1～2、五味子10～15、羊火叶4～7、葫芦巴8～12、杜仲2～4、丙酮若干。进一步，所述的发酵培养基，是将五味子、羊火叶、葫芦巴、杜仲按比例称取后，捣碎20～25min，加入中药总质量的5～6倍的丙酮，浸渍38～42h，减压蒸馏回收丙酮，得残余液，再加入牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖和琼脂，拌匀，加热调节培养基的温度为25℃即可。进一步，所述的LiCl，其浓度为2.5～3.1mol/l。进一步，所述的乙醇，其浓度为15～20％。综上所述，本发明的有益效果在于：CpGODN可诱发机体产生多种免疫学效应，促进其分泌多种细胞因子，提高机体的特异与非特异性免疫反应能力，添加在饲料中能有效的提高猪自身的免疫力，对目前高致病性猪蓝耳病、高致病性禽流感、口蹄疫、猪瘟等重大动物疫病有很好的免疫效果，有效的提高猪的存活率，减少疾病的发生，减少养殖成本。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。实施例1一种对猪有免疫增强活性的CpGODN的制备方法，包括以下步骤：(1)CpGODN量产，包括以下步骤：a、发酵：将CpGODN质粒转入大肠杆菌DH5a菌株中，35℃，250rpm震荡培养2h，得大肠杆菌菌液，将其按1∶70的体积比接种于发酵培养基中，发酵培养15h。b、萃取：将步骤a中发酵后的菌液震荡搅拌，随后按每ml菌液加入50μg的溶菌酶标准加入，搅拌均匀，于35.2℃的恒温水浴下，搅拌8min，随后，按每ml菌液加入0.2ml的LiCl，在10000r/min的转速下离心6min，取上清。c、加热：在步骤b中的上清，震荡搅拌15min，置于沸水浴中加热20min，冷却至20℃，加入上清等质量的异丙醇，沉降离心取沉淀。d、灭菌：加入沉淀质量的1倍的乙醇，静置20min，减压蒸馏回收乙醇即可。(2)包膜剂：将20gβ-环糊精、6g乙基纤维素、和35g的蒸馏水混合得混合料，在100℃下水浴搅拌至体积浓缩至混合料体积的1/3，冷却至常温后，加入5g的薄荷油、2.5g的磷酸，70℃下水浴搅拌20min。(3)配料：将步骤(2)中的包膜剂按1μm的厚度涂覆在步骤(1)中的灭菌后的沉淀上，在35℃下，在400次/min的振动频率下振动3min，得到微胶囊，在100g日粮中添加0.05g的微胶囊，拌匀。所述的发酵培养基，由以下按重量份计的原料组成：牛肉浸膏4g、蛋白胨1g、葡萄糖2.5g、琼脂1g、五味子10g、羊火叶4g、葫芦巴8g、杜仲2g、丙酮若干。所述的发酵培养基，是将五味子、羊火叶、葫芦巴、杜仲按比例称取后，捣碎20min，加入中药总质量的5～6倍的丙酮，浸渍38h，减压蒸馏回收丙酮，得残余液，再加入牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖和琼脂，拌匀，加热调节培养基的温度为25℃即可。所述的LiCl，其浓度为2.5mol/l。所述的乙醇，其浓度为15％。实施例2一种对猪有免疫增强活性的CpGODN的制备方法，包括以下步骤：(1)CpGODN量产，包括以下步骤：a、发酵：将CpSODN质粒转入大肠杆菌DH5α菌株中，36℃，280rpm震荡培养2.5h，得大肠杆菌菌液，将其按1∶80的体积比接种于发酵培养基中，发酵培养20h。b、萃取：将步骤a中发酵后的菌液震荡搅拌，随后按每ml菌液加入60μg的溶菌酶标准加入，搅拌均匀，于35.8℃的恒温水浴下，搅拌12min，随后，按每ml菌液加入0.3ml的LiCl，在10000r/min的转速下离心8min，取上清。c、加热：在步骤b中的上清，震荡搅拌20min，置于沸水浴中加热25min，冷却至25℃，加入上清等质量的异丙醇，沉降离心取沉淀。d、灭菌：加入沉淀质量的1.5倍的乙醇，静置30min，减压蒸馏回收乙醇即可。(2)包膜剂：将30gβ-环糊精、8g乙基纤维素、和40g的蒸馏水混合得混合料，在100℃下水浴搅拌至体积浓缩至混合料体积的1/3，冷却至常温后，加入7g的薄荷油、3g的磷酸，70℃下水浴搅拌30min。(3)配料：将步骤(2)中的包膜剂按1.5μm的厚度涂覆在步骤(1)中的灭菌后的沉淀上，在40℃下，在500次/min的振动频率下振动4min，得到微胶囊，在100g日粮中添加0.1g的微胶囊，拌匀。所述的发酵培养基，由以下按重量份计的原料组成：牛肉浸膏5g、蛋白胨2g、葡萄糖4g、琼脂2g、五味子15g、羊火叶7g、葫芦巴12g、杜仲4g、丙酮若干。所述的发酵培养基，是将五味子、羊火叶、葫芦巴、杜仲按比例称取后，捣碎25min，加入中药总质量的5～6倍的丙酮，浸渍42h，减压蒸馏回收丙酮，得残余液，再加入牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖和琼脂，拌匀，加热调节培养基的温度为25℃即可。所述的LiCl，其浓度为3.1mol/l。所述的乙醇，其浓度为20％。实施例3一种对猪有免疫增强活性的CpGODN的制备方法，包括以下步骤：(1)CpGODN量产，包括以下步骤：a、发酵：将CpGODN质粒转入大肠杆菌DH5α菌株中，35.5℃，270rpm震荡培养2.3h，得大肠杆菌菌液，将其按1∶75的体积比接种于发酵培养基中，发酵培养18h。b、萃取：将步骤a中发酵后的菌液震荡搅拌，随后按每ml菌液加入55μg的溶菌酶标准加入，搅拌均匀，于35.5℃的恒温水浴下，搅拌10min，随后，按每ml菌液加入0.25ml的LiCl，在10000r/min的转速下离心7min，取上清。c、加热：在步骤b中的上清，震荡搅拌18min，置于沸水浴中加热23min，冷却至23℃，加入上清等质量的异丙醇，沉降离心取沉淀。d、灭菌：加入沉淀质量的1.3倍的乙醇，静置25min，减压蒸馏回收乙醇即可。(2)包膜剂：将25gβ-环糊精、7g乙基纤维素、和38g的蒸馏水混合得混合料，在100℃下水浴搅拌至体积浓缩至混合料体积的1/3，冷却至常温后，加入6g的薄荷油、2.8g的磷酸，70℃下水浴搅拌25min。(3)配料：将步骤(2)中的包膜剂按1.3μm的厚度涂覆在步骤(1)中的灭菌后的沉淀上，在38℃下，在450次/min的振动频率下振动3.5min，得到微胶囊，在100g日粮中添加0.08g的微胶囊，拌匀。所述的发酵培养基，由以下按重量份计的原料组成：牛肉浸膏4.5g、蛋白胨1.5g、葡萄糖3g、琼脂1.5g、五味子13g、羊火叶5g、葫芦巴10g、杜仲3g、丙酮若干。所述的发酵培养基，是将五味子、羊火叶、葫芦巴、杜仲按比例称取后，捣碎23min，加入中药总质量的5～6倍的丙酮，浸渍40h，减压蒸馏回收丙酮，得残余液，再加入牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖和琼脂，拌匀，加热调节培养基的温度为25℃即可。所述的LiCl，其浓度为2.8mol/l。所述的乙醇，其浓度为18％。实施例4一种对猪有免疫增强活性的CpGODN的制备方法，包括以下步骤：(1)CpGODN量产，包括以下步骤：a、发酵：将CpGODN质粒转入大肠杆菌DH5α菌株中，36℃，250rpm震荡培养2h，得大肠杆菌菌液，将其按1∶80的体积比接种于发酵培养基中，发酵培养15h。b、萃取：将步骤a中发酵后的菌液震荡搅拌，随后按每ml菌液加入60μg的溶菌酶标准加入，搅拌均匀，于35.2℃的恒温水浴下，搅拌12min，随后，按每ml菌液加入0.2ml的LiCl，在10000r/min的转速下离心6min，取上清。c、加热：在步骤b中的上清，震荡搅拌20min，置于沸水浴中加热20min，冷却至25℃，加入上清等质量的异丙醇，沉降离心取沉淀。d、灭菌：加入沉淀质量的1倍的乙醇，静置30min，减压蒸馏回收乙醇即可。(2)包膜剂：将20gβ-环糊精、6g乙基纤维素、和40g的蒸馏水混合得混合料，在100℃下水浴搅拌至体积浓缩至混合料体积的1/3，冷却至常温后，加入5g的薄荷油、2.5g的磷酸，70℃下水浴搅拌30min。(3)配料：将步骤(2)中的包膜剂按1μm的厚度涂覆在步骤(1)中的灭菌后的沉淀上，在35℃下，在500次/min的振动频率下振动3min，得到微胶囊，在100g日粮中添加0.05g的微胶囊，拌匀。所述的发酵培养基，由以下按重量份计的原料组成：牛肉浸膏5g、蛋白胨1g、葡萄糖2.5g、琼脂2g、五味子15g、羊火叶7g、葫芦巴8g、杜仲2g、丙酮若干。所述的发酵培养基，是将五味子、羊火叶、葫芦巴、杜仲按比例称取后，捣碎20min，加入中药总质量的5～6倍的丙酮，浸渍38h，减压蒸馏回收丙酮，得残余液，再加入牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖和琼脂，拌匀，加热调节培养基的温度为25℃即可。所述的LiCl，其浓度为3.1mol/l。所述的乙醇，其浓度为15％。实施例5一种对猪有免疫增强活性的CpGODN的制备方法，包括以下步骤：(1)CpGODN量产，包括以下步骤：a、发酵：将CpGODN质粒转入大肠杆菌DH5α菌株中，36℃，250rpm震荡培养2h，得大肠杆菌菌液，将其按1∶70的体积比接种于发酵培养基中，发酵培养20h。b、萃取：将步骤a中发酵后的菌液震荡搅拌，随后按每ml菌液加入60μg的溶菌酶标准加入，搅拌均匀，于35.2℃的恒温水浴下，搅拌12min，随后，按每ml菌液加入0.2ml的LiCl，在10000r/min的转速下离心8min，取上清。c、加热：在步骤b中的上清，震荡搅拌15～20min，置于沸水浴中加热25min，冷却至20℃，加入上清等质量的异丙醇，沉降离心取沉淀。d、灭菌：加入沉淀质量的1倍的乙醇，静置20min，减压蒸馏回收乙醇即可。(2)包膜剂：将30gβ-环糊精、6g乙基纤维素、和35g的蒸馏水混合得混合料，在100℃下水浴搅拌至体积浓缩至混合料体积的1/3，冷却至常温后，加入7g的薄荷油、2.5g的磷酸，70℃下水浴搅拌30min。(3)配料：将步骤(2)中的包膜剂按1μm的厚度涂覆在步骤(1)中的灭菌后的沉淀上，在35℃下，在500次/min的振动频率下振动3min，得到微胶囊，在100g日粮中添加0.1g的微胶囊，拌匀。所述的发酵培养基，由以下按重量份计的原料组成：牛肉浸膏5g、蛋白胨1g、葡萄糖2.5g、琼脂2g、五味子15g、羊火叶4g、葫芦巴8g、杜仲4g、丙酮若干。所述的发酵培养基，是将五味子、羊火叶、葫芦巴、杜仲按比例称取后，捣碎20min，加入中药总质量的5～6倍的丙酮，浸渍42h，减压蒸馏回收丙酮，得残余液，再加入牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖和琼脂，拌匀，加热调节培养基的温度为25℃即可。所述的LiCl，其浓度为2.5mol/l。所述的乙醇，其浓度为20％。实验例随机选取生长健康、无病害的、不同年龄的猪若干头，随机分为两组，第一组在日粮中添加本发明进行喂养，第二组不添加，对两个组中的母猪的发情率和产仔数，仔猪的存活率及窝重，育肥猪的日增重及肉料比，进行测评，结果如表1所示，对猪蓝耳病、禽流感、口蹄疫、猪瘟的血清抗体水平进行评测，结果如表2所示：表1项目第一组第二组母猪的发情率75～80％60～65％产仔数12～1410～12仔猪的存活率86～90％75～79％平均每头仔猪的重量2025.3g1350.1g育肥猪的日增重552.3～613.2g431.2～479.8g育肥猪的肉料比2.15～2.37∶11.55～1.75∶1表2当前第1页1 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