黑木耳木酚素提取物及其制备方法与应用与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种可用于制作辅助治疗动脉粥样硬化的保健食品或药品。

背景技术：

黑木耳是我国传统药食同源的食品，作为我国传统中医中药文化中的一颗璀璨明珠，一直为历代医家所推崇，我国很早以前就开始将其应用于中药、药膳来治疗或辅助治疗很多疾病。现代医学研究认为黑木耳具有降压、调脂、保肝和改善肾功能等功效，是中医药食疗心脑血管疾病、高脂血症、便秘的代表性食物。

众所周知，动脉粥样硬化(as)是一组称为动脉硬化的血管病中最常见、最重要的一种，其特点是动脉血管壁平滑肌细胞异常增殖导致管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小，由于在动脉内膜上积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此称为动脉粥样硬化。近年来，动脉粥样硬化的发病率逐年升高，导致以动脉粥样硬化为主要病理基础的多种心血管疾病逐渐成为人类死亡的主要原因之一，因此早期预防和合理治疗动脉粥样硬化将大大降低冠心病等心血管疾病的发病率。目前临床上常用的抗动脉粥样硬化药物主要为他汀类和贝特类调血脂药物，但它们主要用于冠心病的早期治疗，且有一定的副作用，积极开发安全有效辅助治疗动脉粥样硬化的保健食品或药品具有重要意义。

目前国内外专家对黑木耳用于制备辅助治疗动脉粥样硬化的保健食品或药品也已有发明专利，如：(1)一种抗动脉粥样硬化的药物组合物及其应用(专利申请号:201510281712.x)；(2)动脉粥样硬化医学配方食品(专利申请号：201610233650.x)；(3)动脉粥样硬化全营养配方食品(专利申请号：201410405596.3)。与以上专利相比，本专利的不同之处在功效成分是黑木耳木酚素提取物，是一种新型主要功能是抑制平滑肌细胞异常增殖的保健类药物成分，而前面的三个专利都是用黑木耳菌体做为原料进行组方，以达到抗动脉粥样硬化的效果。对木酚素用于保健食品或药品也已有发明专利，如：(1)一种以木酚素为主的防治肿瘤及三高病症的营养强化剂(专利申请号：201310221034.9)；(2)木酚素类化合物的新用途(专利申请号：200680010424.x)；(3)木酚素类化合物用于治疗或预防炎症性疾病的用途(200680001988.7)。与以上专利相比，本专利的不同之处在黑木耳木酚素提取物是抑制平滑肌细胞的异常增殖，而前面的三个专利都是分别用木酚素研究其防治肿瘤、抗氧化、抑制炎症等效果，而没有研究其抑制平滑肌细胞异常增殖的作用，本发明者除考察了其有效性外，发现此黑木耳提取物有较高安全性。故本发明具有经济、可开发的可行性。

技术实现要素：

本发明公开了一种具有抑制平滑肌细胞异常增殖作用的黑木耳木酚素提取物及其在制备抗动脉粥样硬化药物及保健食品中的应用。

该黑木耳木酚素提取物对动脉血管平滑肌细胞异常增殖具有显著抑制效果。

该黑木耳木酚素提取物由以下方法制备得到:黑木耳经机械粉碎，过筛，用15-20倍黑木耳重量的60％乙酸乙酯溶液进行热回流提取，热回流温度为60-80℃，提取2-3次，每次1.5-2.5h，合并提取液，抽滤，取上清液，减压回收溶剂，即得黑木耳木酚素粗提取物浓缩液；用洗脱剂溶解黑木耳木酚素粗提取物浓缩液，离心过滤除去杂质，溶液定容至黑木耳木酚素粗提取物浓缩液的质量浓度为0.1g/ml，然后进行柱色谱分离，以200-300目硅胶为固定相，二氯甲烷-乙酸乙酯为柱层析洗脱剂(体积比97:3)，流速2.0ml/min，进样量6ml(质量浓度0.1g/ml)，得到黑木耳木酚素提取物。其纯度达91.12％，回收率为81.95％。

所述用于溶解黑木耳木酚素粗提取物浓缩液的洗脱剂为二氯甲烷-乙酸乙酯(体积比97:3)。

该黑木耳木酚素提取物含有的有效成分是木酚素，其纯度达91.12％。

本发明所述黑木耳木酚素提取物可按常规工艺制成抗动脉粥样硬化保健食品及药品，包括胶囊、片剂、颗粒剂、酒剂、口服液等常规剂型。

附图说明

图1是在20％浓度的含药血清干预下，培养时间为24h时，丹参酮与黑木耳木酚素提取物对ox-ldl诱导的血管平滑肌细胞异常增殖的影响示意图。a：丹参酮组；b：黑木耳木酚素提取物组；k：空白对照组；m：模型对照组。其中，与model组相比，*p<0.05，#p<0.01。

图2是在20％浓度的含药血清干预下，培养时间为48h时，丹参酮与黑木耳木酚素提取物对ox-ldl诱导的血管平滑肌细胞异常增殖的影响示意图。a：丹参酮组；b：黑木耳木酚素提取物组；k：空白对照组；m：模型对照组。其中，与model组相比，*p<0.05，#p<0.01。

图3是在20％浓度的含药血清干预下，培养时间为24h时，丹参酮与黑木耳木酚素提取物对ox-ldl诱导的血管平滑肌细胞异常增殖的影响示意图。a：丹参酮组；b：黑木耳木酚素提取物组；k：空白对照组；m：模型对照组。其中，与model组相比，*p<0.05，#p<0.01。

具体实施方式

下面详细说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。

本发明公布了作为黑木耳木酚素提取物作为抑制平滑肌细胞异常增殖药物的制备方法和药效试验。制备方法采用了两个实施例；采用血清药理学实验，通过血管平滑肌细胞的体外细胞培养模型，研究了黑木耳木酚素提取物对抑制血管平滑肌细胞异常增生能力证明其药效。

本发明的制备方法如下:

实施例一:

黑木耳经机械粉碎，过筛，用15倍黑木耳重量的60％乙酸乙酯溶液进行热回流提取，热回流温度为：65℃，提取3次，每次1.5h，合并提取液，抽滤，取上清液，减压回收溶剂，即得黑木耳木酚素粗提取物浓缩液。用洗脱剂溶解黑木耳木酚素粗提取物浓缩液，离心过滤除去杂质，溶液定容至黑木耳木酚素粗提取物浓缩液质量浓度为0.1g/ml，然后进行柱色谱分离，以200目硅胶为固定相，二氯甲烷-乙酸乙酯为柱层析洗脱剂(体积比97:3)，流速2.0ml/min，进样量6ml(质量浓度0.1g/ml)，得到黑木耳木酚素提取物。

实施例二:

黑木耳经机械粉碎，过筛，用20倍黑木耳重量的60％乙酸乙酯溶液进行热回流提取，热回流温度为：75℃，提取2次，每次2.5h，合并提取液，抽滤，取上清液，减压回收溶剂，即得黑木耳木酚素粗提取物浓缩液。用洗脱剂溶解黑木耳木酚素粗提取物浓缩液，离心过滤除去杂质，溶液定容至黑木耳木酚素粗提取物浓缩液质量浓度为0.1g/ml，然后进行柱色谱分离，以300目硅胶为固定相，二氯甲烷-乙酸乙酯为柱层析洗脱剂(体积比97:3)，流速2.0ml/min，进样量6ml(质量浓度0.1g/ml)，得到黑木耳木酚素提取物。

抑制平滑肌细胞异常增殖药效试验如下:

实施例三:

含黑木耳木酚素提取物的血清对ox-ldl诱导兔胸主动脉平滑肌细胞异常增殖具有显著抑制作用。

1实验材料与仪器

1.1动物

清洁级雄性sd大鼠，36只，体重190士10g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号scxk(湘)2011-0003。

1.2试剂

普通饲料(江苏南通特洛菲饲料科技有限公司)；兔胸主动脉血管平滑肌细胞(中国协和医科大学细胞中心)，氧化型低密度脂蛋白(ox-ldl)(中国协和医科大学细胞中心)，丹参酮(昆明科翔生物科技有公司)，dmem粉剂(高糖)，胎牛血清，青霉素链霉素溶液，(均购于美国gibco公司)，二甲基亚砜(dmso)，mtt，胰蛋白酶，一氧化氮(no)试剂盒(均购于美国sigma化学公司)。

1.3仪器

xdos-1b倒置生物显微镜(重庆光电有限公司)；sw-cj-2fd双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)；37℃co2培养箱(日本sanyo公司)；multiskanmk3型自动酶标分析仪(美国thermo公司)；wmv-1000微视摄像头系统(北京微视新纪元科技公司)。

2实验方法

2.1含药血清的制备

为了观察丹参酮、黑木耳木酚素提取物抗动脉粥样硬化的药理作用，将sd大鼠共分为3组，每组2只，即：空白对照组(control)、丹参酮(aap)、黑木耳木酚素提取物组(aae)。各组自由进食普通饲料。各组灌胃处理情况如下：丹参酮组灌胃量为300mg/kgb.w.，黑木耳木酚素提取物组(实施例1)灌胃量为200mg/kgb.w.，每日灌胃两次，早晚各一次，空白对照组每日灌胃同体积蒸馏水。灌胃7天，在最后一次灌胃后一小时，立即在无菌条件下进行腹部大动脉采血，血样于37℃水浴15min，3000r/min离心10min，取得血清，然后于56℃水浴30min进行灭活。最后将血清分装，冻存备用，用前经0.22μm滤膜过滤除菌。2.2兔胸主动脉血管平滑肌细胞的复苏与培养

2.2.1细胞复苏

(1)将恒温水浴锅调至37-40℃的温水；

(2)从液氮中取出冻存小管，用镊子夹住冻存管的盖于37-40℃的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解。要在1-2min中完成复温；

(3)将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5ml培养液，轻轻吹匀；

(4)将细胞悬液经800-1000r/min离心5min，弃去上清；

(5)给细胞沉淀物加入含20％胎牛血清的完全培养基，轻轻吹吸均匀。将细胞悬液移入培养瓶内，加足培养液至4ml左右，放入5％co2培养箱进行培养。

2.2.2细胞传代培养

(1)从细胞生长至融合形成致密单层细胞时即可传代培养；

(2)传代时，首先倾去培养液，以pbs溶液轻轻冲洗瓶壁上的细胞2次；

(3)加入0.25％胰蛋白酶溶液约1.5ml，覆盖细胞表面即可。在室温下作用4-5min，并用倒置显微镜观察，可见大部分细胞收缩，边缘清楚，此时立即加入含20％的胎牛血清培养基，终止胰蛋白酶活性，停止消化并弃去悬液；

(4)加入3ml含20％胎牛血清的完全培养基，用弯头吸管吹打分散细胞，制成细胞悬液；

(5)然后将培养液平均分配于3个25ml培养瓶中，即进行“一传三”传代，最后将每个培养瓶中各加3-4ml完全培养培养基，放入5％co2培养箱进行培养。测定指标

弃去培养液，每孔加入20μl0.5mg/ml的mtt溶液，37℃继续培养4h后终止培养，吸弃培养上清液，每孔加150μldmso(二甲基亚枫)，振荡10min；在570nm波长下进行比色，在酶标仪上测定各孔吸光度值。

2.3统计分析

数据均用spss13.0统计软件进行处理，用单因素方差分析anova(one-wayanalysisofvariance)，以duncans多种比较检验(duncansmultiplerangetests)。

分析实验结果以均值±标准偏差(mean±sd)表示，采用组间t检验，p<0.05具有显著性差异，p<0.01具有极显著性差异。

3实验结果

3.1丹参酮及黑木耳木酚素提取物对兔胸主动脉血管平滑肌细胞增生的抑制作用

通过mtt法测定吸光值(od值)，可反映细胞生长及增殖活性，在一定细胞数范围内，mtt结晶物形成的量与活细胞数成正比，即吸光值越高增殖活性越强。实验结果显示：在20％浓度的含药血清干预下，丹参酮组在作用48h及72h后对vsmc增殖才表现出显著抑制作用(p<0.05)，而黑木耳木酚素提取物组，在作用24h后就对vsmc增殖已经具有显著抑制作用(p<0.05)，当作用时间达48h及72h时对vsmc增殖具有极显著抑制作用(p<0.01)。从试验结果中我们可以发现，丹参酮只有在高浓度长时间的作用下才对血管平滑肌细胞异常增殖具有显著抑制效果(p<0.05)，而黑木耳木酚素提取物在中等浓度，较短时间内就对血管平滑肌细胞异常增殖具有显著抑制效果(p<0.05)，当黑木耳木酚素提取物在高浓度下，在短时间内对血管平滑肌细胞异常增殖具有极显著抑制效果(p<0.01)。这说明了黑木耳木酚素提取物具有比丹参酮更强的抑制血管平滑肌细胞异常增殖的功能作用。

综上说明：黑木耳木酚素提取物具有抑制平滑肌细胞异常增殖的作用。在抑制动脉粥样硬化方面有很大的开发空间，可开发为抗动脉粥样硬化的保健品及药品等。