一种包埋活性肽的纳米颗粒及其制备方法与流程

本发明涉及一种纳米颗粒及其制备方法，特别涉及一种包埋活性肽的纳米颗粒及其制备方法。

背景技术：

近年来，食源性活性肽因其安全性高，又能够为人体提供氨基酸，调节某些生理机能，越来越受到人们的关注。

鸡蛋，因其具有非常高的营养价值和蛋白质生物利用率而历来被人们所青睐。我国是蛋品生产和消费大国，蛋品的生产量和消费量已连续多年世界第一，但是蛋品深加工还是以蛋壳为主，蛋品深加工程度仍然较低，尤其在功能性蛋制品方面发展严重不足，不能满足日益扩大的市场需求。

鸡蛋清中蛋白质含量较多，含有8种人体必需氨基酸，是获取生物活性肽的良好蛋白质资源。蛋清蛋白被酶解后得到由氨基酸组成的多个肽段，即蛋清源活性肽，蛋清源活性肽具有独特的体内或体外生物活性，营养价值高，生物活性多样，几乎无毒副作用等优点，但由于其在体内胃肠道消化系统中极易被降解而不能以完整形式被吸收，而蛋清源活性肽要在体内发挥生物活性就必须通过胃肠道复杂的消化酶降解，然后以完整形式透过小肠上皮吸收渗透屏障，被机体完整吸收后，再通过血液循环等输送到作用靶点，且积累到一定的量才有可能最终实现其发挥调节生理功能的作用。因此，开发一种对蛋清源活性肽进行有效保护的技术手段以提高其稳定性和体内吸收利用率迫在眉睫。

壳聚糖(chitosan)，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-b-d葡萄糖，是由甲壳素经脱乙酰作用得到的。是自然界中除纤维素外含量最高的多糖，因其无毒、易降解、生物活性多样、能被生物体完全吸收而在医药、食品、化工等领域内有广泛的应用。利用壳聚糖作为纳米包材对蛋清源活性肽进行包埋保护具有重要意义。

随着研究者对蛋清源活性肽功能活性和结构特性研究的逐渐深入，如何确保其以完整形式被机体吸收也成为了一个亟需解决的难题，但目前国内外对蛋清源活性肽通过纳米包埋的形式提高其稳定性和体内生物利用率的相关专利和论文文献几乎没有。

技术实现要素：

本发明的目的是解决现阶段蛋清源活性肽在体内胃肠道消化系统中极易被降解而不能以完整形式被吸收的问题，提供的一种包埋活性肽的纳米颗粒及其制备方法。

本发明提供的包埋活性肽的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、蛋清源活性肽的制备：取一定量蛋清蛋白粉，按料液质量比为1:10～1:100配制成蛋清蛋白粉原料液，加热至80℃～100℃，持续5min～20min，进行变性处理，然后冷却至30℃～50℃，调节ph值至8～10，加入碱性蛋白酶，持续水解100min～300min后，进行沸水浴灭酶，最后离心处理，取上清液，进行超滤膜过滤、冻干，得到蛋清源活性肽样品；

步骤二、壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒的制备：采用离子凝胶法，即称取一定量壳聚糖，通过降解法将壳聚糖溶解于0.1wt％～10wt％的乙酸溶液中，使其浓度为0.01mg/ml～4mg/ml,按壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为10:1～1:1的比例，加入一定量浓度为0.1mg/ml～1mg/ml的三聚磷酸钠溶液，搅拌，调节ph值至1～7，测量其粒径和电势分布情况，得到粒径＜200nm，电势大于30mv，稳定性良好的壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒溶液；

步骤三、蛋清肽-壳聚糖纳米颗粒的制备：按照蛋清源活性肽：壳聚糖的质量比为20:1～1:10，取一定量的由步骤一制得的蛋清源活性肽，搅拌状态下加入到一定量的由步骤二制得的壳聚糖溶液中，搅拌1min～10min后进行超声波处理1min～20min，加入步骤二中得到的对应体积的三聚磷酸钠溶液，调节ph值至2～7，测量其粒径和电势分布情况，得到粒径＜200nm，电势大于30mv，稳定性良好的蛋清肽-壳聚糖纳米颗粒溶液。

步骤一中用1m氢氧化钠溶液调节ph值至8～10。

步骤一中加入碱性蛋白酶的量是蛋清蛋白粉质量的1％～10％。

步骤一中超滤膜为分子量分别是10k、3k和1k的超滤膜，将上清液依次经过分子量为10k、3k和1k的超滤膜过滤后，得到分子量分别为＜10kda的活性肽、10kda～3kda、3kda～1kda和＜1kda的四种蛋清源活性肽。

步骤二中使用的壳聚糖分子量为150kda。

步骤二中降解法采用声波降解法。

步骤二中壳聚糖的初始浓度为0.01mg/ml～4mg/ml。

步骤二中壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为10:1～1:1。

步骤二中制备蛋清肽-壳聚糖纳米颗粒时，添加顺序为将将蛋清肽加入壳聚糖溶液中，经搅拌超声后加入三聚磷酸钠。

步骤三中超声波处理过程为240w超声波处理10min～60min。

本发明提供的一种包埋活性肽的纳米颗粒由以上方法制得。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用了离子凝胶的方式，以壳聚糖和三聚磷酸钠为纳米包材，对酶解得到的四种不同分子量构成的蛋清源活性肽进行包埋，制备得到了包埋性能较好的蛋清肽-壳聚糖纳米颗粒，填补了保护和促进蛋清源活性肽生物吸收利用方面的空白；

(2)本发明属蛋品资源的精深加工技术，采用自然界存在广泛、性能优良的壳聚糖为纳米包材原料，制备蛋清肽-壳聚糖纳米颗粒，对其在诸如饮料、保健品等领域的开发利用具有较大的借鉴意义，能促进蛋品产业高附加值成分的综合开发利用，提高经济价值；

(3)本发明运用了离子凝胶技术，操作简单，参数条件温和，生产周期短，易于在工业化生产中应用；

(4)操作过程中采用的原材料壳聚糖属保健食品，无毒易降解，对其利用也能加大水产产品的综合利用和精深加工；三聚磷酸钠的使用量远小于国标所设定的最低标准(5g/kg)，其他溶剂均安全无毒，且使用量较少，在一定程度上可较好的节约成本；

(5)制备出的蛋清肽-壳聚糖纳米颗粒均一稳定，且粒径较小，能够较好的被人体吸收，发挥相应功效；

(6)制备出的蛋清肽-壳聚糖纳米颗粒能够较好的保持蛋清肽的相应功能，同时，乙酸的酸味也能较好地掩盖蛋清肽的腥味，能够较好的满足生产保健食品如蛋清肽类降血压、抗衰老食品等生产的原料需求，又能为高端药品的生产提供优等的原材料。

希望通过本发明，能够推动对保护和促进蛋清源活性肽生物吸收利用方面的系统研究，对蛋品产业的精深加工提供新的思路，实现对蛋品资源的整合和最大化的合理运用。

附图说明

图1为本发明制备得到的壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒透射电镜(tem)图。

图2为本发明制备得到的蛋清肽-壳聚糖纳米颗粒粒径分布图。

图3为本发明制备得到的蛋清肽-壳聚糖纳米颗粒电势分布图。

具体实施方式

请参阅图1至图3所示：

实施例一：

本发明提供的包埋活性肽的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、蛋清源活性肽的制备：取200g蛋清蛋白粉，按料液质量比为1:10配制成蛋清蛋白粉原料液，加热至85℃，持续10min，对蛋白质进行变性处理，然后冷却至50℃，用1m氢氧化钠溶液调节ph值至10，加入8g碱性蛋白酶，持续水解100min后，沸水浴10min灭酶，最后离心处理，取上清液，依次经过分子量为10k、3k和1k的超滤膜过滤后，得到分子量分别为＜10kda的活性肽、10kda～3kda、3kda～1kda和＜1kda的四种蛋清源活性肽，分别冻干，得到蛋清源活性肽样品；

步骤二、壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒的制备：采用离子凝胶法，即称取分子量为150kda的壳聚糖50mg，采用声波降解法将壳聚糖溶解于100ml0.1wt％的乙酸溶液中，按壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为3:1的比例，搅拌状态下加入20.8ml浓度为0.8mg/ml的三聚磷酸钠溶液，调节ph值至3，测量其粒径和电势分布情况，得到粒径为150±15nm，zeta电势为51±0.92mv的壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒的溶液；

步骤三、蛋清肽-壳聚糖纳米颗粒的制备：按蛋清源活性肽：壳聚糖＝1:1的比例称取分子量为3k-10k的蛋清源活性肽50mg，搅拌状态下加入到由步骤二方法制得的100ml壳聚糖溶液中，240w超声波处理10min后，加入20.8ml浓度为0.8mg/ml的三聚磷酸钠溶液，混匀后调节ph值至3，测量其粒径和电势分布情况，得到粒径为195±12nm，zeta电势为46.3±3.8mv，包埋率为30.37±0.005％的蛋清肽-壳聚糖纳米颗粒溶液。

实施例二：

本发明提供的包埋活性肽的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、蛋清源活性肽的制备：取400g蛋清蛋白粉，按料液质量比为1:50配制成蛋清蛋白粉原料液，加热至90℃，持续15min，对蛋白质进行变性处理，然后冷却至50℃，用1m氢氧化钠溶液调节ph值至9，加入16g碱性蛋白酶，持续水解200min后，沸水浴10min灭酶，最后离心处理，取上清液，依次经过分子量为10k、3k和1k的超滤膜过滤后，得到分子量分别为＜10kda的活性肽、10kda～3kda、3kda～1kda和＜1kda的四种蛋清源活性肽，分别冻干，得到蛋清源活性肽样品；

步骤二、壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒的制备：采用离子凝胶法，即称取分子量为150kda的壳聚糖100mg，采用声波降解法将壳聚糖溶解于100ml1wt％的乙酸溶液中，按壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为4:1的比例，搅拌状态下加入31.25ml浓度为0.8mg/ml的三聚磷酸钠溶液，调节ph值至3，测量其粒径和电势分布情况，得到粒径为195.9±14nm，zeta电势为52±0.91mv的壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒的溶液；

步骤三、蛋清肽-壳聚糖纳米颗粒的制备：按蛋清源活性肽：壳聚糖＝1:1的比例称取分子量为＜10kda的活性肽的蛋清源活性肽100mg，搅拌状态下加入到由步骤二方法制得的100ml壳聚糖溶液中，240w超声波处理20min后，加入31.25ml浓度为0.8mg/ml的三聚磷酸钠溶液，混匀后调节ph值至3，测量其粒径和电势分布情况，得到粒径为176.2±4nm，zeta电势为49.9±1.36mv，包埋率为40.18±0.92％的蛋清肽-壳聚糖纳米颗粒溶液。