发芽糙米蛋白‑葡聚糖接枝复合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物及其制备方法和应用。

背景技术：

糙米是稻谷(oryzastatival.)除去果皮后的一种形态，与白米相比，它是一种保留了胚芽、糠层等的全谷米粒。糙米的糠层和胚芽中富含多种营养物质，如维生素e、γ-氨基丁酸、谷胱甘肽、谷维素、米胚蛋白、米糠蛋白、膳食纤维等，而仅有胚乳部分的精米，主要营养物质为90％的淀粉和9％的蛋白质。糙米在我国有很长的食用历史，古代的多部古书都对糙米的营养价值做出了描述，如《名医别录》中称糙米能“益气止渴止泄”；唐代著名中药学家孟诜在他的《食疗本草》中说，糙米有“止痢、补中益气、坚筋骨、和血脉”的功效之功；在《本草纲目》中，李时珍称糙米具有“和五脏、好颜色”的妙用。可见糙米不仅具有很高的营养价值，而且还具有医疗保健、养生延年的效用。

米蛋白是营养界所公认的优质植物蛋白，按照osborne的分类方法，米蛋白主要由清蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)、醇溶蛋白(prolamin)和谷蛋白(glutelin)组成。其中谷蛋白是大米中含量最高的蛋白质，达到米蛋白含量的70～90％。相对于其他禾谷类粮食，米蛋白是质量最好的一种蛋白质，具有氨基酸组成合理、高生物价和低敏性等特性^[24]。米蛋白的必需氨基酸模式与fao/who所推荐的氨基酸模式极为相近，它的必需氨基酸被机体利用的程度就越高，米蛋白的营养价值也相对越高。米蛋白的生物价为77，高于其它粮食品种，并且可以与动物蛋白相媲美。更重要的是，米蛋白是低过敏性蛋白，而传统的大豆蛋白、花生蛋白都存在致敏因子。美国的临床研究发现，在700个遗传性过敏症的病例中，对大米过敏的高度过敏性病人不到1％，甚至儿科中也很少有病例对米蛋白过敏。因此，米蛋白是一种优质的植物蛋白资源，特别适合作为婴幼儿的食品基料。

正是由于米蛋白这些营养特性，其市场需要量日趋增加，对米蛋白的研究也比较多，米蛋白在食品工业中的应用也越来越广泛，如大米蛋白粉、大米改性蛋白、高附加值肽、有特殊功能的生物活性肽等；米蛋白还可以作为多种食品的辅料，如混合饮料、婴儿食品等。尽管米蛋白的用量和需求日趋增加，但它在食品行业的应用却十分有限，主要的原因是由于米蛋白的溶解性较低，尤其是占米蛋白约70％～90％的谷蛋白，因其中大量的疏水性氨基酸(如谷氨酰胺)通过疏水作用相互靠近，同时生成大量的二硫键，导致谷蛋白分子聚集沉淀，造成米蛋白不易溶解，其价值无法得到充分利用。长期以来，用于改善疏水性，提高蛋白功能性质的研究受到广泛的关注。蛋白质的溶解性能够影响蛋白质的乳化、增稠、起泡和凝胶作用，因此，米蛋白由于其溶解性较差，不能在水中与其他物料形成均匀的体系，从而影响了米蛋白在溶液体系中的应用。如何降低米蛋白的疏水性从而提高其溶解性，扩大米蛋白的应用领域，必须对米蛋白进行科学的改性研究。

技术实现要素：

本发明所解决的现有技术的问题是：现有的为了提高米蛋白的溶解性的方法，多集中在酶法、物理法和化学法，但是酶法用到的蛋白酶的价格较高，化学改性可能会造成蛋白质中的氨基酸产生消旋作用，生物效价降低，产生有毒物质，化学试剂修饰有试剂残留。而且常用的酰化、烷基化、磷酸化、脱酰胺等植物蛋白化学改性方法，始终受到改性效果及安全性的质疑。而采用冷冻、加压、加热、电场、磁场、辐射等物理作用的改性，改性的效果又不显著。而且对于改善疏水性植物蛋白功能性领域的研究大多集中在大豆蛋白，有关米蛋白的研究还比较少。

为了解决如上问题，本发明通过葡聚糖与发芽糙米蛋白进行接枝，提供了一种发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物及制备方法和应用。糙米经过发芽后能够生成各种营养物，包括γ-氨基酸和谷胱甘肽等，糙米的特性相较于未发芽的糙米蛋白也发生了很多改变，尤其是糙米的蛋白质含量及溶解性都得到了显著的提高。

具体来说，本发明提供了如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将糙米进行发芽处理，然后提取得到发芽糙米蛋白；

(2)将步骤(1)得到的发芽糙米蛋白和葡聚糖混合反应，制备得到发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物。

优选的，根据以上所述的制备方法，步骤(1)中糙米在发芽处理之前进行浸泡，浸泡的温度为25-35℃，浸泡时间为8-24h；糙米发芽处理的温度为25-35℃，发芽处理的时间为20-40h。

优选的，根据以上所述的制备方法，步骤(1)中糙米在浸泡发芽之前进行消毒处理，优选采用0.2mol/l-0.4mol/l的次氯酸钠溶液浸泡消毒。

优选的，根据以上所述的制备方法，步骤(2)中所述葡聚糖的相对分子质量为20kd-100kd。

优选的，根据以上所述的制备方法，步骤(2)中发芽糙米蛋白和葡聚糖的反应的温度为80-100℃。

优选的，根据以上所述的制备方法，步骤(2)中发芽糙米蛋白和葡聚糖的反应的ph值为9-11。

优选的，根据以上所述的制备方法，步骤(2)中发芽糙米蛋白和葡聚糖的质量比为1:1-1:4。

第二方面，本发明还提供了以上任一项所述的制备方法制备得到的发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物。

优选的，根据以上所述的发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物，所述发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物的乳化活性为0.9-1.2，放置10min后的乳化稳定性在55％以上。

第三方面，本发明提供了以上所述的发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物在食品领域中的应用。

本发明所取得的有益效果是：本发明将糙米进行适度发芽后，提高了糙米蛋白的溶解度；然后再以发芽糙米蛋白和葡聚糖为原料进行接枝偶联的湿法反应，克服了干法工艺中原料混合不均一，反应时间太长的缺点。相比于发芽糙米蛋白，发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物的乳化性、乳化稳定性、溶解性、抗氧化活性都得到了明显的提高。

附图说明

图1为发芽糙米蛋白的扫描电镜图。

图2为发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物的扫描电镜图。

图3为发芽糙米蛋白和发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物的傅立叶红外(ftir)光谱图，其中标号1为发芽糙米蛋白，标号2为发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物。

图4为葡聚糖、发芽糙米蛋白-葡聚糖物理混合物、发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物的x射线衍射图，其中标号1为葡聚糖，标号2为发芽糙米蛋白-葡聚糖物理混合物，标号3为发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物。

具体实施方式

如上所述，本发明提供了一种发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将糙米进行发芽处理，然后提取发芽糙米蛋白；

(2)将步骤(1)得到的发芽糙米蛋白和葡聚糖混合反应，制备得到发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物。

其中，在一种优选实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将糙米进行发芽处理，然后提取糙米蛋白；

(2)将步骤(1)得到的发芽糙米蛋白和葡聚糖混合反应，制备得到发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物，其中，步骤(2)中，发芽糙米蛋白和葡聚糖的质量比为1:1-1:4，发芽糙米蛋白和葡聚糖的反应的温度为80-100℃，反应ph值为9-11。

其中，在一种更优选实施方式中，所述葡聚糖的相对分子质量为20kd-100kd。

同时，本发明还提供了一种根据以上制备方法制备得到的发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物，实验验证，发芽糙米蛋白与葡聚糖发生共价结合，因此也可以称为发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物或者发芽糙米蛋白-葡聚糖共价接枝复合物。

下面结合实施实例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施实例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限制作用。

其中，实施例中所用到的原料的厂家及参数如下所示。

糙米(稻花香2号)，北大荒农业股份有限公司；

考马斯亮蓝g-250，北京博奥拓达科技有限公司；

牛血清蛋白标准品，百灵威科技有限公司；

十二烷基硫酸钠(sds)，北京博奥拓达科技有限公司；

葡聚糖，百灵威科技有限公司；

tnbs试剂，上海士锋生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

实验过程中用到的实验设备如下：

sha-b水浴恒温振荡器，精达机械有限公司

dk-8d三温三控水槽，上海博迅实业有限公司

hc-3018r高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司

精密ph计，梅特勒-托利多公司

烘箱，豪贝烘箱厂

myp11-2a磁力搅拌器，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司

kdy-9820凯氏定氮仪，北京科拓有限公司

lgj-18真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司

795-紫外可见光分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司

wqf520aft-ir光谱仪，北京北分瑞利分析仪器有限公司

d-8x射线衍射仪，德国布鲁克axs有限公司

q2000dsc系统，美国ta仪器公司

飞纳pro-x型台式扫描电镜仪，复纳科学仪器(上海)有限公司

多用分散机，江阴精细化工机械有限公司

t25basicultra-turrax分散机，德国ika公司

高压均质机，意大利fbf公司

s3500激光粒度仪，美国麦奇克有限公司

实施例1

分别采用如下方法制备发芽糙米，具体的方法分别如制备例1-制备例7所示。

制备例1

(1)糙米消毒

称取100g糙米放置于烧杯中，先用自来水冲洗3遍，洗去表面的糠粉和灰尘，用纱布沥干后，用0.2mol/l的次氯酸钠溶液浸泡消毒25min，再用去离子水冲洗3遍。

(2)糙米的浸泡

经消毒后的糙米放于规格为150mm的培养皿中，并添加适量的去离子水，水面覆盖糙米，置于28±1℃的恒温水浴锅中浸泡12h，每隔4h更换浸泡的去离子水。

(3)糙米发芽

将浸泡好的糙米置于30±1℃恒温水浴锅中进行发芽，用湿润的双层纱布覆盖培养皿。每隔4h用去离子水冲洗糙米，发芽时间为35h。

(4)发芽糙米的干燥

将发芽后的糙米，置于50±1℃烘箱中干燥5h，干燥后的发芽糙米用粉碎机粉碎，过60目筛，获得发芽糙米粉。

制备例2

(1)糙米消毒：同制备例1

(2)糙米的浸泡

经消毒后的糙米放于规格为150mm的培养皿中，并添加适量的去离子水，水面覆盖糙米，置于25±1℃的恒温水浴锅中浸泡24h，每隔6h更换浸泡的去离子水。

(3)糙米发芽

将浸泡好的糙米置于25±1℃恒温水浴锅中进行发芽，用湿润的双层纱布覆盖培养皿。每隔8h用去离子水冲洗糙米，发芽时间为40h。

(4)发芽糙米的干燥：同制备例1

制备例3

(1)糙米消毒：同制备例1

(2)糙米的浸泡

经消毒后的糙米放于规格为150mm的培养皿中，并添加适量的去离子水，水面覆盖糙米，置于35±1℃的恒温水浴锅中浸泡8h，每隔2h更换浸泡的去离子水。

(3)糙米发芽

将浸泡好的糙米置于35±1℃恒温水浴锅中进行发芽，用湿润的双层纱布覆盖培养皿。每隔5h用去离子水冲洗糙米，发芽时间为20h。

(4)发芽糙米的干燥：同制备例1

制备例4

(1)糙米消毒：同制备例1

(2)糙米的浸泡

经消毒后的糙米放于规格为150mm的培养皿中，并添加适量的去离子水，水面覆盖糙米，置于30±1℃的恒温水浴锅中浸泡16h，每隔4h更换浸泡的去离子水。

(3)糙米发芽

将浸泡好的糙米置于28±1℃恒温水浴锅中进行发芽，用湿润的双层纱布覆盖培养皿。每隔6h用去离子水冲洗糙米，发芽时间为30h。

(4)发芽糙米的干燥：同制备例1

制备例5

(1)糙米消毒：同制备例1

(2)糙米的浸泡：同制备例1

(3)糙米发芽

将浸泡好的糙米置于30±1℃恒温水浴锅中进行发芽，用湿润的双层纱布覆盖培养皿。每隔5h用去离子水冲洗糙米，发芽时间为10h。

(4)发芽糙米的干燥：同制备例1

制备例6

(1)糙米消毒：同制备例1

(2)糙米的浸泡：同制备例1

(3)糙米发芽

将浸泡好的糙米置于30±1℃恒温水浴锅中进行发芽，用湿润的双层纱布覆盖培养皿。每隔5h用去离子水冲洗糙米，发芽时间为15h。

(4)发芽糙米的干燥：同制备例1

制备例7

(1)糙米消毒：同制备例1

(2)糙米的浸泡：同制备例1

(3)糙米发芽

将浸泡好的糙米置于30±1℃恒温水浴锅中进行发芽，用湿润的双层纱布覆盖培养皿。每隔5h用去离子水冲洗糙米，发芽时间为45h。

(4)发芽糙米的干燥：同制备例1

然后采用碱溶酸沉的方法对制备例1-制备例7制备得到的发芽糙米粉提取发芽糙米蛋白，具体操作如下：

称取一定重量上述制备好的发芽糙米粉，加入0.1mol/lnaoh溶液(固液比为1:6)在40℃恒温水浴锅中浸泡，并进行磁力搅拌2h。然后在8000g离心力的条件下离心15min，收集蛋白上清液。在蛋白上清液中缓慢加入0.1mol/l盐酸，直到ph值降到糙米蛋白的等电点5.0时终止，然后在8000g离心力的条件下离心15min，得到蛋白沉淀。酸沉后的蛋白沉淀用0.1mol/lnaoh溶液调至中性，并用去离子水清洗3次，获得发芽糙米蛋白沉淀，然后将蛋白沉淀进行真空冷冻干燥，得到糙米蛋白粉，即为发芽糙米蛋白粗提物(用mi表示)。

然后分别对制备得到的发芽糙米蛋白粉中蛋白质含量，糙米蛋白得率，溶解度，以及常规成分包括脂肪、水分和灰分进行测定。具体的测定方法如下：

(1)蛋白含量的测定：利用凯氏定氮法gb5511-85(n％×5.95)测定蛋白含量，通过凯式定氮法测定发芽糙米蛋白粗提物中蛋白质的含量，用纯度p表示；通过凯式定氮法测定发芽糙米(即不经过碱溶酸沉的方法提取)中蛋白质的含量，测定结果用mj表示。

然后按照如下公式计算得到发芽糙米蛋白得率及提取率。

发芽糙米蛋白得率：g(％)＝(mi/mo)×100

式中：g——发芽糙米蛋白得率；mo——发芽糙米原料的量；mi——发芽糙米蛋白粗提物的量。

发芽糙米蛋白提取率：r(％)＝{(mi×p)/mj}×100

式中：r——发芽糙米蛋白的提取率；p——发芽糙米蛋白的纯度；mj——发芽糙米中蛋白质的量。

(2)常规成分的测定

脂肪的测定：索氏抽提法gb5497-85

水分的测定：105℃恒重法gb5512-85

灰分的测定：干法灰化法gb5505-85

其中，具体的测定结果如表1所示。

表1发芽糙米蛋白的主要成分表

实验结果：

从表1中的制备例1-4可以看出，虽然发芽糙米蛋白的得率和提取率较低，但是蛋白含量大于80％(干基)，可以认为是纯的发芽糙米蛋白，能到达到实验要求，因此，该蛋白可以作为本实验中发芽糙米蛋白的来源。另外，制备例5-制备例7中，对于发芽时间作了改变，可以看出，当发芽时间过短时，表现为发芽10h和15h时，蛋白纯度稍有下降，但是蛋白含量变化不大，当发芽时间过长，蛋白质含量开始降低。

实施例二发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物的制备

以实施例一中制备例1制备得到的发芽糙米蛋白为例，与葡聚糖制备发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物。具体的制备过程分别如下：

制备例8

称取100mg的糙米蛋白，加去离子水，用0.1mol/lnaoh调ph值至12，在50±1℃水浴条件下，震荡搅拌30min，于室温下冷却。再以糙米蛋白与葡聚糖的质量比为1:1的比例，加入100mg相对分子质量为20kd的葡聚糖，搅拌使蛋白/糖充分混合，然后用0.1mol/lhcl调节ph值至11，在90±1℃水浴下反应60min，反应结束，密封于4℃冰箱中备用。

制备例9

称取100mg的糙米蛋白，加去离子水，用0.1mol/lnaoh调ph值至12，在50±1℃水浴条件下，震荡搅拌30min，于室温下冷却。再以糙米蛋白与葡聚糖的质量比为1:2的比例，加入200mg相对分子质量为50kd的葡聚糖，搅拌使蛋白和糖充分混合，然后用0.1mol/lhcl调节ph值至10，在80±1℃水浴下反应40min，反应结束，密封于4℃冰箱中备用。

制备例10

称取100mg的糙米蛋白，加去离子水，用0.1mol/lnaoh调ph值至12，在50±1℃水浴条件下，震荡搅拌30min，于室温下冷却。再以糙米蛋白与葡聚糖的质量比为1:4的比例，加入400mg的相对分子质量为100kd的葡聚糖，搅拌使蛋白和糖充分混合，然后用0.1mol/lhcl调节ph值至9，在100±1℃水浴下反应20min，反应结束，密封于4℃冰箱中备用。取一定量的样品液然后按照制备例8的方法测定复合产物的特性。

制备例11

称取100mg的糙米蛋白，加去离子水，用0.1mol/lnaoh调ph值至12，在50±1℃水浴条件下，震荡搅拌30min，于室温下冷却。再以糙米蛋白与葡聚糖的质量比为1:1的比例，加入100mg的相对分子质量为20kd的葡聚糖，搅拌使蛋白和糖充分混合，然后用0.1mol/lhcl调节ph值至8，在70±1℃水浴下反应60min，反应结束，密封于4℃冰箱中备用。

制备例12

称取100mg的糙米蛋白，加去离子水，用0.1mol/lnaoh调ph值至12，在50±1℃水浴条件下，震荡搅拌30min，于室温下冷却。再以糙米蛋白与葡聚糖的质量比为2:1的比例，加入50mg的相对分子质量为250kd的葡聚糖，搅拌使蛋白和糖充分混合，然后用0.1mol/lhcl调节ph值至7，在80±1℃水浴下反应50min，反应结束，密封于4℃冰箱中备用。

然后分别按照如下方法测定复合物的接枝度，乳化活性以及乳化稳定性等。

(1)复合物接枝度的测定

采用tnbs法，具体操作如下：

取0.4ml样品液加入到盛有2ml磷酸盐缓冲溶液(ph＝8.2，1/15mol/l)的带盖试管中，再加入1ml0.1％tnbs试剂，震荡混匀，在50±1℃下水浴中，试管外壁包上铝箔避光反应1h，然后取出试管加入2ml0.1mol/lhcl终止反应，室温下放置30min，在420nm下测定吸光值。

接枝度dg％＝(a0－at)/a0×100％

式中，a0－未反应时样品吸光值；at－反应t分钟后样品吸光值

(2)复合物乳化活性的测定

采用浊度法并稍作改进，具体操作如下：

取上述制备的蛋白悬浮液于室温下搅拌，边搅拌边缓缓加入5ml美藤果油，在9500r/min转速下分散1min，制备得到的乳状液在30±1℃水浴下放置，分别于不同时间(0，10min)从溶液底部吸取50μl乳浊液，加到5ml0.1％sds溶液中，于500nm处测定吸光值。每次取样取三次。0min时测得的吸光值a0即乳化活性ea。乳化稳定性用es(％)＝a0×100/(a0－a10)表示，其中a10为将乳状液放置10min后测得的乳化活性值。

表2发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物的测定结果

从表2可以看出，制备例8-制备例10所制备得到的发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物其接枝度均在30％以上，乳化稳定性均在55％以上。而制备例11将接枝反应的温度调到70℃，将ph值调节到8时，制备得到的发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物接枝度稍低，乳化稳定性值也在55％以下。同样，制备例12所采用的葡聚糖的相对分子质量为250kd，发芽糙米蛋白与葡聚糖的质量比为2:1时，反应ph值调节为7，所制备得到的发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物的接枝度仅在26％左右，乳化稳定性也仅为42％。实验结果表明，通过控制发芽糙米蛋白与葡聚糖的重量比，所采用的葡聚糖的相对分子质量，以及反应的温度和反应的ph值，能够得到接枝度在30％以上的发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物，而且所制备得到的发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物的乳化液放置10min后的乳化稳定性在55％以上。

实施例三

分别以实施例一中制备例1制备得到的发芽糙米蛋白、实施例二中制备例8制备得到的发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物为例

(1)扫描电子显微镜(sem)观察

使用飞纳pro-x型台式扫描电镜观察样品的微观结构。将样品平铺在粘有导电胶的载物台上，用氮气吹干并置于样品杯上，采用10kv加速电压，用扫描电镜观察样品的微观结构，放大倍数为5000倍。

结果分析：

将发芽糙米蛋白、发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物分别冷冻干燥后，用台式扫描电子显微镜观察其颗粒特性。从图1中可以看出，发芽糙米蛋白呈现聚集状态，颗粒比较大并且不均与，结构不规则。从图2中可以看出，发芽糙米蛋白经过接枝偶联反应后，生成的共价复合物的蛋白颗粒均匀细腻，并分散地附着在多糖分子的片层结构上。由此可见，发芽糙米蛋白与葡聚糖共价结合后，因为多糖分子的空间阻碍作用，使得蛋白质分子发生扩散，并降低了蛋白质分子之间因疏水相互作用而发生的团聚，最终形成均匀细小的颗粒，从而改变了发芽糙米蛋白的空间结构。

(2)傅立叶红外(ftir)光谱测定

将样品与一定量的kbr混合，仔细研磨成均匀的粉末，压成薄片，然后使用ft-ir光谱仪在4000-400cm^-1范围内以4cm^-1的分辨率进行全波段扫描24次，获得平均值。

ft-ir光谱法主要用于化合物的定性鉴定和分子结构的表征，因此，ft-ir光谱是蛋白质-多糖体系研究的有效方法。如图3所示，在发芽糙米蛋白中鉴定了两个典型的酰胺和氢键结合峰，分别为1700～1500cm^-1和3392cm^-1。在美拉德反应过程中，葡聚糖的羰基被添加到发芽糙米蛋白的多肽链中，从而消耗官能团并引起羟基和羰基振动。这些变化对应于蛋白-聚糖共价复合物在3650-3200cm^-1(-oh拉伸)和1100-1000cm^-1(-oh弯曲)的特征峰。与发芽糙米蛋白相比，发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物在1536cm^-1和1460-1240cm^-1处峰的强度由于nh2基团的改变而降低。

(3)x射线衍射仪测定

x射线衍射仪在室温下以40kv的电压运行，将样品在10^°-80^°的2θ角范围内进行测试，扫描速率为5^°/min。

x射线衍射仪(xrd)技术是分析晶体结构的主要方法，具有信息量大、快速、不损伤样品、测量精度高等优点，因此被广泛应用于各个科目的研究和生产。x射线衍射分析的原理是对不同的材料进行x射线照射后，会产生不同程度的衍射，并且与晶体的类型、分子的构象、材料的组成和分子的键合模式相关。图4为葡聚糖(标号1，相对分子质量为20kd)、发芽糙米蛋白和葡聚糖物理混合物(标号2，其中发芽糙米蛋白为实施例一中制备例1制备得到的，葡聚糖的相对分子质量为20kd，发芽糙米蛋白和葡聚糖的质量比为1：1)和发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物(标号3)的xrd图谱，从图中可以看到，葡聚糖、发芽糙米蛋白和葡聚糖物理混合物的衍射图由位于10°和20°附近的两个主要晶体峰组成。与葡聚糖、发芽糙米蛋白和葡聚糖物理混合物相比，发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物的衍射图在衍射角和峰强度方面发生了很大的变化，两个主要晶体峰都迁移到了15°和25°，同时在40°左右出现了一个新峰。这些研究结果表明葡聚糖与发芽糙米蛋白之间的共价结合改变了葡聚糖的晶体形态。因此，基于ft-ir光谱和xrd的结果可以得出以下结论：葡聚糖与发芽糙米蛋白发生接枝反应后生成了蛋白-多糖共价复合物。

(4)差示扫描量热仪(dsc)测定

采用差示扫描量热法(dsc)测定样品的变性温度和变性焓值。将样品(5.0mg)精确称重到铝盘中，温度扫描范围为40-180℃，升温速率10℃/min，以空铝盘为对照，变性温度(td)和焓变(δh)由设备软件计算。

蛋白质的功能特性和结构受热处理的影响，导致热变性不可逆变化。发芽糙米蛋白，发芽糙米蛋白和葡聚糖物理混合物(其中发芽糙米蛋白为实施例一中制备例1制备得到的，葡聚糖的相对分子质量为20kd，发芽糙米蛋白和葡聚糖的质量比为1：1)、发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物的dsc特征变化如表3所示，发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物(122.15℃)的变性温度(td)明显高于发芽糙米蛋白(107.46℃)和发芽糙米蛋白和葡聚糖物理混合物(112.96℃)(p<0.05)，表明蛋白质和葡聚糖共价结合后，蛋白质的结构发生了一些变化。通常来说，td越高，表示蛋白质的热稳定性越好。因此，当葡聚糖与发芽糙米蛋白发生结合时，gbrp的热稳定性显著提高。此外，发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物的焓变(δh)明显小于发芽糙米蛋白和发芽糙米蛋白和葡聚糖物理混合物，这可能是由于放热反应降低了gbrp与葡聚糖交联过程中的δh。另一方面，发芽糙米蛋白和葡聚糖物理混合物的变性温度(td)和焓变(δh)高于发芽糙米蛋白。这可能是葡聚糖分子提高了蛋白质分子之间的空间间隔，并通过降低水合物结合位点的相关作用来阻止发芽糙米蛋白分子的聚集。

表3发芽糙米蛋白、发芽糙米蛋白-葡聚糖物理混合物及发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物的热变形温度(td)和熵变(δh)^a

^a所有值都是平均值±标准偏差(n＝3)。同一列中不同的上标字母表示显著性差异(p<0.05)，其中差异显著，为不同的字母，差异不显著，为相同的字母。

从以上各个结果不难看出，通过扫描电子显微镜、傅立叶红外光谱、x射线衍射仪、差示扫描量热仪等手段研究发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝偶联复合物的理化性质和分子结构，证实了发芽糙米蛋白与葡聚糖发生了共价结合。

实施例四

分别对实施例一中制备例1到制备例7制备得到的发芽糙米蛋白、实施例二中制备例8到制备例12制备得到的发芽糙米蛋白-葡聚糖接枝复合物的性质进行研究，同时以糙米蛋白为对照，测定了各个样品的溶解性和抗氧化活性。

其中，糙米蛋白的具体的制备方法如下：

1)糙米消毒

称取100g糙米放置于烧杯中，先用自来水冲洗3遍，洗去表面的糠粉和灰尘，用纱布沥干后，用0.2mol/l的次氯酸钠溶液浸泡消毒25min，再用去离子水冲洗3遍。

2)糙米的浸泡

经消毒后的糙米放于规格为150mm的培养皿中，并添加适量的去离子水，水面覆盖糙米，置于28±1℃的恒温水浴锅中浸泡12h，每隔4h更换浸泡的去离子水。

3)糙米的干燥

将发芽后的糙米，置于50±1℃烘箱中干燥5h，干燥后的发芽糙米用粉碎机粉碎，过60目筛，获得糙米粉。

然后按照与实施例一相同的方法，即采用碱溶酸沉的方法利用糙米粉提取糙米蛋白，得到糙米蛋白。

(1)溶解度测定

称取10mg糙米蛋白、发芽糙米蛋白及发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物，加入1/15mol/lph值为11的缓冲液在30℃水浴下搅拌分散2h，然后在10000g离心力条件下离心20min，通过凯氏定氮法测定上清液中的蛋白质含量(n％×5.95)。

溶解度计算为上清液中蛋白质与总蛋白质含量的百分比。

(2)dpph自由基清除活性的测定

将1.0ml浓度为4％(wt)的样品与1.0ml20μmdpph的95％乙醇充分混合，并在25℃的黑暗条件下放置30分钟。然后将混合物以750g离心力离心5分钟，然后在517nm处测定上清液的吸光度。每次处理做三个平行，结果是三次测量的平均值。样品的较低吸光度表现出更高的自由基清除活性。

dpph自由基清除活性(％)计算为：

清除率/％＝[1－(asample－acontrol)/ablank]×100

其中asample是样品的吸光度，acontrol是对照的吸光度(乙醇替代dpph)，ablank是空白的吸光度(乙醇替代样品)。

(3)总还原能力的测定

将1.0ml浓度分别为4％(wt)的样品与1.0ml1％(w/v)铁氰化钾溶液、2.5ml0.2μm磷酸盐缓冲液(ph6.6)混合，将混合溶液在50℃下加热30分钟，待冷却后加入10％(w/v)三氯乙酸2.5ml并摇匀，接着将混合物在3000g离心力下离心10分钟。取2.0ml上清液与1.0ml1％(w/v)三氯化铁和5.0ml蒸馏水混合，静置10分钟后，在700nm测量反应体系的od值，样品的较高吸光度表示较高的还原能力。

具体的测定结果见表4。

表4不同物质性能特定结果

从表4可以看出，发芽可以增加显著增加糙米蛋白质的溶解度以及抗氧化活性；将发芽糙米蛋白与葡聚糖进行接枝偶联反应后，其溶解度、dpph自由基清除活性、总还原能力都较发芽糙米蛋白有了明显的提升。不受理论的限制，其中一个可能原因是蛋白质发生美拉德反应能够生成杂环化合物，氨基还原酮和高分子黑色素，因而可以提高蛋白质的抗氧化活性。

实施例五

将发芽糙米蛋白与葡聚糖通过接枝偶联反应生成共价复合物，实现了发芽糙米蛋白功能特性的有效改善，充分发挥糙米蛋白的低敏性和高营养特性。此外，将该共价复合物作为乳化剂可以应用到o/w型美藤果油乳状液中，能够有效改善乳状液的粒径特性。以实施例一中制备例1制备得到的发芽糙米蛋白为例，以实施例二中制备例8制备得到的发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物为例，同时以制备例1制备得到发芽糙米蛋白和相对分子质量为20kd的葡聚糖的物理混合物作为发芽糙米蛋白和葡聚糖的物理混合物(其中两者质量比为1：1)，研究了它们分别作为乳化剂对于最终制备得到的美藤果油乳液的粒径的影响。

其中，美藤果油乳状液的制备方法及粒径测定方法如下：

(1)美藤果油乳状液的制备

准确称取一定量的乳化剂(分别为发芽糙米蛋白、发芽糙米蛋白和相对分子质量为20kd的葡聚糖的质量比为1:1的物理混合物，以及发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物)溶于50～60℃的蒸馏水中，使其质量浓度分别为0.5％、1％、2％、4％、8％，高速搅拌使其充分溶解，在高速剪切过程中缓慢加入美藤果油(浓度为8％)形成粗乳液，粗乳液在40mpa/5mpa压力下均质3次，制得美藤果油乳液备用。

(2)美藤果油乳状液的粒径测定

采用激光粒度仪测定乳状液的粒径及粒度分布仪器基于动态光散射理论，通过建立粒子大小与散射强度的相关函数，确定粒子的粒径大小及粒度分布。粒径大小以体积平均粒径(d43)表示，按公式(1)计算，其中ni代表直径为di的颗粒个数。

表5不同乳化剂稳定的美藤果油乳液的粒径(平均值±标准差，μm)

同一列中不同的上标字母表示显着性差异(p<0.05)。

液滴尺寸和分布是测量乳化剂乳化性能的关键指标之一，也是影响乳液的物理化学性质和感官特性的重要因素。当乳液制备过程中具有表面活性的乳化剂分子被吸附到油/水界面时，由于界面张力的降低，形成了小液滴。因此，乳化剂的结构，溶解性及其它特性将对乳液的液滴尺寸产生影响。用0.5，1，2，4，8％质量浓度的发芽糙米蛋白，发芽糙米蛋白-葡聚糖物理混合物，发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物制备的美藤果油乳液的粒径测量值见表5。

如表5所示，由发芽糙米蛋白和发芽糙米蛋白-葡聚糖物理混合物制备的乳液具有比其它乳液更大的粒径。不受理论限制，对于发芽糙米蛋白，这种现象可以归因于其相对较低的电荷从而引起的液滴絮凝的结果，这也意味着发芽糙米蛋白的静电阻力不够强大到足以克服任何疏水吸引力或范德华力。对于发芽糙米蛋白-葡聚糖物理混合物制备的乳液粒径比其它乳液都要大，这种效应可归因于当连续相中的游离葡聚糖分子出现时，通过耗尽机制诱导产生液滴絮凝。发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物制备的乳液的粒径小于其他乳液(p<0.05)，表明它是最有效的乳化剂。浓度为2％的发芽糙米蛋白-葡聚糖共价复合物的平均液滴直径达到0.483μm，达到最小值。该结果表明，共价复合物在均质过程中抑制液滴聚集并产生粒径小的液滴方面具有很大的优势。由于液滴上的电荷量的改善，聚集稳定性可能增加。另一方面，这可能是因为葡聚糖的共价结合能够增加液滴之间的界面涂层的厚度，从而能够提高空间排斥力。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。