专利名称：营养组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于哺乳动物的营养组合物，如浸剂和运动饮料。更具体地说，涉及的是含有L-谷氨酰-L-胱氨酸(以下称为Glu-Cys-Cys)和/或L-谷氨酰-L-半胱氨酸二硫化物〔以下称为(Glu-Cys)2〕的营养组合物。
L-半胱氨酸(以下称为半胱氨酸)被认为不是必须氨基酸，因为半胱氨酸在生物体内可由L-蛋氨酸(以下称为蛋氨酸)合成，因此，含硫氨基酸如半胱氨酸的营养补充是利用蛋氨酸。但是，近几年来，已揭示出在新生儿以及肝硬化和有高胱氨酸血症等病人的身体内，蛋氨酸不能充分转化为半胱氨酸。由此提出为了补充含硫氨基酸营养源，不仅需要提供蛋氨酸，而且还需提供半胱氨酸〔新陈代谢，第37卷，第8期，P796(1988)〕。
已经进一步揭示出，过度锻炼和饮酒后，人体对含硫氨基酸的需求量增加，并认识到使用半胱氨酸或具有一个半胱氨酸基的L-谷胱甘肽(γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，本文后称谷胱甘肽)的有效性。
半胱氨酸在溶液中不稳定，因此很难将半胱氨酸直接加到浸剂之类的液体营养组合物中。已对利用N-乙酰基-L-半胱氨酸代替半胱氨酸进行了研究，而且已部分付诸实践，然而，发现其稳定性存在问题。另外，虽然具有一个半胱氨酸基的谷胱甘肽比半胱氨酸要稳定，但当其被加热灭菌时问题仍未解决。另一方面，从营养学观点看，L-胱氨酸(本文后称胱氨酸)被认为与半胱氨酸等价，由于L-胱氨酸为半胱氨酸的氧化形式，所以它极其稳定，然而，胱氨酸在水中的溶解性很低(小于0.11克/升，25℃)，故它不能用于浸剂等中。为此，最近已试验使用具有一个胱氨酸基(谷胱甘肽的氧化形式)的谷胱甘肽二硫化物，但尚未提供实际用途。
作为改进半胱氨酸稳定性的一种方法，有已知的如上所述半胱氨酸的乙酰化方法，该方法已部分实际用于浸剂处方。考虑到胱氨酸从营养学观点与半胱氨酸等价，研究了采用具有一个胱氨酸基的谷胱甘肽二硫化物和将胱氨酸转化为肽来改进溶解性的方法。作为包括含胱氨酸的肽的营养组合物，已知的有一种含N，N′-双-α-天门冬氨酰-L-胱氨酸〔本文后称(Asp-Cys)2〕的组合物(日本特许公开151156/87);一种含N2-半胱氨酰-N6-L-半胱氨酰-L-赖氨酸〔本文后称Cys-Lys(Cys)〕的组合物(DE3206810);一种含有以(X-Cys)2为代表的化合物(其中X是甘氨酰Gly，丙氨酰Ala，亮氨酰Leu，异亮氨酰Ile或苯丙氨酰Phe)的组合物(EP264953);一种含有双(乙酰甘氨酰)-L，L-胱氨酸的组合物(日本特许公开233999/88)，以及等组合物。另外，在Clin.Nutr.SPec.Supp/.4，P116-123(1985)上有一篇关于L-半胱氨酰-双-L-丙氨酸〔本文后称(Cys-Ala)2〕溶解性的报导，在“营养杂志”118，P1470(1988)上有一篇关于双-α-L-丙氨酰-L-胱氨酸〔本文后称(Ala-Cys)2〕和双-甘氨酰-L-胱氨酸〔本文后称(Gly-Cys)2〕在血液中的情况的报导。
为了将不稳定的半胱氨酸或与半胱氨酸在营养学上等价的胱氨酸作为营养组合物供给由加热灭菌而制备的液体物中，提出要求开发一项技术。
本发明提供了能将半胱氨酸引入体内系统，但不含半胱氨酸的营养组合物，该组合物含有Glu-Cys-Cys和/或(Glu-Cys)2，其含量足以增加上述系统中的半胱氨酸水平。利用这种营养组合物，可将不能包含在通过加热灭菌而制备的液体营养组合物中的半胱氨酸或胱氨酸作为营养成份供给。
本发明还提供了使上述肽通过口服、非肠道或肠内给药而将半胱氨酸引入体内系统的方法。
图1表示对鼠注射γ-Glu-Cys-Cys后，经过一段时间，血液中γ-Glu-Cys-Cys及其氨基酸组分的浓度变化，符号○-○，□-□和●-●分别代表γ-Glu-Cys-Cys，谷氨酸和胱氨酸。
图2表示对鼠注射(γ-Glu-Cys)2后，经过一段时间，血液中(γ-Glu-Cys)2，γ-Glu-Cys-Cys及其氨基酸组分的浓度变化，符号○-○，■-■，□-□和●-●分别代表(γ-Glu-Cys)2和γ-Glu-Cys-Cys，谷氨酸和胱氨酸。
图3表示对鼠注射(Ala-Cys)2后经过一段时，血液中(Ala-Cys)2、丙氨酰胱氨酸〔本文后称Ala-(Cys)2〕及其氨基酸组分的浓度变化，符号○-○，■-■，□-□和●-●分别代表(Ala-Cys)2，Ala-(Cys)2，丙氨酸和胱氨酸。
图4表示对鼠注射γ-Glu-Cys-Cys，(γ-Glu-Cys)2和(Ala-Cys)2后，经过一段时间，肾中谷氨酸和丙氨酸的浓度变化，符号□-□，■-■和○-○分别代表由γ-Glu-Cys-Cys衍生的谷氨酸，由(γ-Glu-Cys)2衍生的谷氨酸和由(Ala-Cys)2衍生的丙氨酸。
下面详细说明本发明。
Glu-Cys-Cys和(Glu-Cys)2分成两类，α和γ，两种类型都可用于本发明，但优选使用γ型。
Glu-Cys-Cys和(Glu-Cys)2可按照“酶学方法”〔113，P555-564(1985)〕中介绍的方法制备。
通常以溶液，膏状体和粉末等形式与其它组分如氨基酸和营养物一起使用，但也可以以不含其它组分的溶液形式使用。
Glu-Cys-Cys和(Glu-Cys)2可单独或作为混合物加入，营养组合物既可含有这些化合物;又可含混合物，其量为0.0005-30%(重量)。
从营养学角度看，为补充胱氨酸或半胱氨酸，优选的营养组合物实例包括Glu-Cys-Cys和/或(Glu-Cys)2的水溶液，生理盐水或缓冲溶液以及含有Glu-Cys-Cys和/或(Glu-Cys)2与氨基酸或蛋白质水解物(肽)和如下所述营养添加剂等的组合物，如氨基酸浸剂，为补充营养的口服营养制剂和胶状营养制剂。
在口服或肠内给药的情况下，可将营养添加剂如易消化的碳水化合物，脂肪，维生素和矿物质加入到组合物中以调节平衡营养。另外，还可以加入增味剂如人工增味剂、甜味剂、香料和染料、增香剂以及外观改善剂等，从而改进口服给药组合物的味道。营养添加剂的具体例子包括淀粉、糊精、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、脱脂乳、蛋黄粉、蛋黄油、麦芽提取物、中链脂肪酸、维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟碱酸、泛酸、维生素B12、L-抗坏血酸、α-生育酚、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸铁。
将上述组分掺混，与水混合并分散，形成的组合物作为饮料或糊状物封装于防湿的袋、瓶、罐等之中，然后加热灭菌、储存，销售和使用。另一种方法是，将上述组分以粉末状均匀混合，该粉状组合物可以在贮存或销售或使用前再与水混合并分散。Glu-Cys-Cys和(Glu-Cys)2可以随意进行处理，如加热蒸煮和灭菌，因为它们对热高度稳定，并能在溶液中稳定很长时间。
含有Glu-Cys-Cys和/或(Glu-Cys)2的氨基酸浸剂具有如下所列成份，其中单位为毫克/分升L-异亮氨酸 160-1070L-亮氨酸 180-1720L-赖氨酸盐酸盐 180-2400L-苯丙氨酸 130-1400L-蛋氨酸 50-1200L-苏氨酸 80-720L-色氨酸 30-350L-缬氨酸 70-1130L-精氨酸盐酸盐 120-1500L-组氨酸盐酸盐 50-900甘氨酸 200-2500L-丙氨酸 70-1130L-天门冬氨酸钠 0-1300
L-谷氨酸钠 0-1300Glu-Cys-Cys 1-7000和/或(Glu-Cys)2L-脯氨酸 90-1080L-丝氨酸 60-1200L-酪氨酸 3-90按照制备氨基酸浸剂的常规方法，例如根据以下实施例1所示方法，本发明的氨基酸浸剂能从上述氨基酸组合物获得。
如下述比较例1所示，已证实了Glu-Cys-Cys和(Glu-Cys)2比胱氨酸具有高得多的溶解性，而且甚至在加热灭菌时，或者以营养组合物形式保存很长时间后也极其稳定。例如，这些物质在浓度为10毫摩尔(mM)，PH＝6.5时，于110℃加热20分钟难于分解，进一步说，这些物质在浓度为10mM，PH＝6.5时，于40℃下保持60天不会分解。
比较例1对γ-Glu-Cys-Cys和(γ-Glu-Cys)2与胱氨酸和已知的含胱氨酸的肽的溶解性进行比较，可以证实γ-Glu-Cys-Cys和(γ-Glu-Cys)2的溶解性比胱氨酸有显著提高。
表1在1000毫升水中的溶解性(克)γ-Glu-Cys-Cys ＞70(γ-Glu-Gys)2＞70Cys-Lys(Cys) ＞50(Asp-Cys)2＞50(Gly-Cys)2＞50(Ala-Cys)2＞50(Cys-Ala)28.1胱氨酸 0.1PH＝6.5，25℃γ-Glu-Cys-Cys和(γ-Glu-Cys)2为存在的肽，因此可以有效地在体内利用。事实上，有报导说当单独将这些化合物对鼠进行皮下注射时，它们能用来合成肾谷胱甘肽〔Proc.Natl.Acad.Scl.作者M.E.Anderson和A.Meister，美国，第80卷，P707(1983)〕。另外，可以假设γ-Glu-Cys-Cys和(γ-Glu-Cys)2是体内γ-谷酰基转移酶的底物，并且能在体内有效地利用。
下面涉及的比较例2-6描述了在注射后，γ-Glu-Cys-Cys和(γ-Glu-Cys)2在γ-谷酰基转移酶作用下的水解，在人体和鼠的血浆中它们的体外水解作用，以及从血液中消失而由肾吸收的作用。
比较例2按照下述试验方法，将γ-Glu-Cys-Cys-Glu-Cys-Cys和(γ-Glu-Cys)2在γ-谷酰基转移酶作用下的水解与(Asp-Cys)2，(Gly-Cys)2和(Ala-Cys)2的水解进行比较，用于本发明的前两个化合物几乎完全水解，而后三个已知化合物不发生水解，因此认识到这些肽之间对于体内的利用存在差别。
〔试验方法〕将肽以5mM浓度溶解于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(PH7)中，并将由猪肾制取的γ-谷酰基转移酶加入该溶液中，于37℃下反应120分钟，测定残留的肽量。
比较例3按照下述试验方法，将γ-Glu-Cys-Cys和(γ-Glu-Cys)2在人体血浆中的体外水解作用与如表2所示的已知的含胱氨酸肽的水解进行比较，正如表2所显示的，用于本发明的前两个化合物与后三个已知化合物相比，前者在血浆中的水解困难，因此认识到这些肽之间对于体内的利用存在着明显的差别。
〔试验方法〕从人体采集并制取100微升血浆，向其中加入10微升24mM浓度的含肽生理盐水溶液，于37℃下反应30分钟，测定残留的肽量。
表2血浆中残留量(%)γ-Glu-Cys-Cys 67(γ-Glu-Cys)285(Asp-Cys)230(Gly-Cys)235(Ala-Cys)226比较例4按照下述试验方法，γ-Glu-Cys-Cys和(γ-Glu-Cys)2于鼠血浆中在体外的水解与(Ala-Cys)2的水解进行比较。
如表3所示，用于本发明的前两个化合物与(Ala-Cys)2相比，前者在血浆中的水解困难。
〔试验方法〕从C2H/He鼠(6周龄，雄性，重22克)采集并制取50微升血浆，向其中加入5微升27.1mM浓度的含肽生理盐水溶液，然后于37℃下反应30分钟，以5只鼠作为一个试验组，结果用平均值表示。
表3血浆中残留量(%)γ-Glu-Cys-Cys 53(γ-Glu-Cys)284(Ala-Cys)20比较例5
按照下述试验方法，比较γ-Glu-Cys-Cys和(γ-Glu-Cys)2与(Ala-Cys)2从鼠血液中消失的情况，(Ala-Cys)2给药后非常迅速地从血液中消失，并且同时能观察到有丙氨酸迅速释放到血液中，另一方面，分别接受γ-Glu-Cys-Cys和(γ-Glu-Cys)2的试验组，其肽量减少和谷氨酸增加则是平缓的。由此认识到肽从血液的消失情况存在着很大的差异。
〔试验方法〕将含γ-Glu-Cys-Cys，(γ-Glu-Cys)2和(Ala-Cys)2的生理盐水溶液分别通过尾静脉注射到C2HC2H/He鼠试验组(6周龄，雄性，重22克)，用药剂量为250微摩尔/每千克体重，然后于30分钟内采集血样，测定出在这段时间内血液中肽浓度的变化和它们的氨基酸组成浓度变化。以5只鼠作为一个试验组，结果用平均值±SEM表示，见表4。
比较例6按照下述试验方法，比较γ-Glu-Cys-Cys和(γ-Glu-Cys)2与(Ala-Cys)2被鼠肾的吸收。
在分别接受了γ-Glu-Cys-Cys和(γ-Glu-Cys)2的试验组中，谷氨酸浓度极其高，这说明肽被肾吸收并且有效利用了。另一方面，对任何试验的肽，未在肾中检测到胱氨酸。
〔试验方法〕将含γ-Glu-Cys-Cys，(γ-Glu-Cys)2和(Ala-Cys)2的生理盐水溶液分别通过尾静脉注射到C3H/He鼠试验组(6周令、雄性、重22克)，用药剂量为250微摩尔/每千克体重，在用药1，5和20分钟后切开肾，然后测定肾中的谷氨酸、丙氨酸和胱氨酸。以5只鼠为一试验组，结果用平均值±SEM表示，见表5。
表5单位微摩尔/克肾湿重施用肽后的时间(分钟)0 1 5 20Glu 5.54 13.09 20.32 15.1(GCC) ±0.33 ±0.23 ±1.18 ±1.23Glu 5.54 14.82 22.5 18.14(GCCG) ±0.3 ±0.75 ±1.00 ±3.37Ala 2.33 2.87 2.59 2.16(ACCA) ±0.11 ±0.18 ±0.28 ±0.31
如上所示，γ-Glu-Cys-Cys和(γ-Glu-Cys)2与其它含胱氨酸的肽相比，前者在血浆中难于水解，并且只能由γ-谷酰基转移酶水解。γ-谷酰基转移酶广泛分布在肾、小肠、肝等的生命组织中。当γ-Glu-Cys-Cys和/或(γ-Glu-Cys)2施用于血液时，与已知的含胱氨酸的肽对照，它们能在肾、肝等内被利用而几乎不在血液中水解。另一方面，当γ-Glu-Cys-Cys和/或(γ-Glu-Cys)2口服或肠内给药时，认为它们在小肠内通过谷酰基转移酶进行水解，而且经肠道被有效利用。此外，认为γ-Glu-Cys-Cys和(γ-Glu-Cys)2也被细胞吸收。
本发明的一些实施方式由下列有代表性的实施例给出。
实施例1在下述氨基酸组合物中，于70℃下，加入1升注射用蒸馏水以溶解这些成份。用NaOH溶液调节PH至6.5，该溶液经过微孔过滤器过滤，滤液按200毫升一份装入玻璃瓶，接着用无菌氮吹扫30秒钟，然后封口，将瓶子于110℃下加热60分钟灭菌，从而制得氨基酸浸剂。
L-异亮氨酸 4.6克L-亮氨酸 7.7克L-赖氨酸盐酸盐 5.0克L-苯丙氨酸 4.3克L-蛋氨酸 2.1克L-苏氨酸 2.9克L-色氨酸 1.0克L-缬氨酸 4.9克
L-精氨酸盐酸盐 6.1克L-组氨酸盐酸盐 2.6克甘氨酸 3.4克L-丙氨酸 4.6克L-天门冬氨酸钠 0.3克L-谷氨酸钠 0.3克γ-Glu-Cys-Cys 3.0克L-脯氨酸 3.9克L-丝氨酸 2.3克L-酪氨酸 0.3克实施例2在下述氨基酸组合物中，于70℃下，加入1升注射用蒸馏水以溶解这些成份。用NaOH溶液调节PH至6.5，该溶液经过微孔过滤器过滤，滤液按200毫升一份装入玻璃瓶，接着用无菌氮气吹扫30秒钟，然后封口，将瓶子于110℃下加热60分钟灭菌，从而制得氨基酸浸剂。
L-异亮氨酸 5.6克L-亮氨酸 12.5克L-赖氨酸 11.0克L-苯丙氨酸 9.5克L-蛋氨酸 3.7克L-苏氨酸 6.5克L-色氨酸 1.0克L-缬氨酸 4.9克
L-精氨酸盐酸盐 9.5克L-组氨酸盐酸盐 8.0克甘氨酸 10.4克L-丙氨酸 6.5克L-天门冬氨酸 3.8克L-谷氨酸钠 2.5克(γ-Glu-Cys)23.0克L-脯氨酸 3.9克L-丝氨酸 2.3克L-酪氨酸 0.3克实施例3酪蛋白水解产物 10克明胶 8克γ-Glu-Cys-Cys 2.5克糊精 20克还原麦芽糖 20克水 300毫升上述组合物于100℃加热30分钟并分散后，将分散液冷却成胶状营养制剂。γ-Glu-Cys-Cys在加工条件下可稳定地保留下来。
权利要求
1.一种能将半胱氨酸引入体内系统，但不含半胱氨酸的营养组合物，它包括L-谷氨酰-L-胱氨酸和/或L-谷氨酰-L-半胱氨酸二硫化物，其含量足以增加所述系统内的半胱氨酸水平。
2.根据权利要求1的营养组合物，其特征在于所说的营养组合物含有0.005-30%(重量)的L-谷氨酰-L-胱氨酸和/或L-谷氨酰-L-半胱氨酸二硫化物。
3.根据权利要求1或2的营养组合物，其特征在于所说的营养组合物是一种氨基酸浸剂。
4.一种具有下述组份的氨基酸浸剂毫克/分升L-异亮氨酸 160-1070L-亮氨酸 180-1720L-赖氨酸盐酸盐 180-2400L-苯丙氨酸 130-1400L-蛋氨酸 50-1200L-苏氨酸 80-720L-色氨酸 30-350L-缬氨酸 70-1130L-精氨酸盐酸盐 120-1500L-组氨酸盐酸盐 50-900甘氨酸 200-2500L-丙氨酸 70-1130L-天门冬氨酸钠 0-1300L-谷氨酸钠 0-1300L-谷氨酰-L-胱氨酸和/或L-谷氨酰-L-半胱氨酸二硫化物 1-1700L-脯氨酸 90-1080L-丝氨酸 60-1200L-酪氨酸 3-90
全文摘要
用作氨基酸浸剂的营养组合物包含L-谷氨酰-L-胱氨酸和/或谷氨酰-L-半胱氨酸二硫化物。该营养组合物能获取半胱氨酸和胱氨酸的极高利用，而半胱氨酸和胱氨酸迄今为止尚不能用于营养组合物。
文档编号A23L1/305GK1049598SQ9010390
公开日1991年3月6日 申请日期1990年4月24日 优先权日1989年4月24日
发明者古川忠康, 原孝博 申请人:协和发酵工业株式会社