可分离的编码肿瘤排斥抗原前体的核酸序列的制作方法

专利名称：可分离的编码肿瘤排斥抗原前体的核酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种编码肿瘤排斥抗原前体的核酸分子。特别是涉及一种基因，将它编码肿瘤排斥抗原前体被特殊处理成至少一种在细胞表面上由HLA-A2分子能提呈的肿瘤排斥抗原。
哺乳动物免疫系统识别和与外源物质反应的过程是一个复杂的过程。该系统的重要部分是T细胞应答。这种应答要求T细胞识别称之为人白细胞抗原(“HLA”)的细胞表面分子的复合体，即主要组织相容性复合体(“MHCS”)对应的多肽分子，并与之相互作用。所述的肽来自也可提呈HLA/MHC分子的细胞所加工后的大分子。关于此问题可参见Male et al.，Advaned Immunology(J.P.Lipincoit Company，1987)，特别是第6至10章。T细胞和HLA/肽复合体之间的相互作用是受限制的，它要求T细胞对于HLA分子和肽的特定结合是特异的。假如特异的T细胞不存在，就不会有T细胞应答，这在T细胞匹配复合体(Partner complex)存有的情况下也是如此。同样，如果T细胞存在但不存在特异性结合的复合体，也没有这种应答反应。这种机理涉及在自身免疫病理学中，免疫系统对外源物质的反应，以及对细胞异常时的反应。最近，大量研究工作都集中在把蛋白处理成能与HLA结合的多肽的机理上。关于此内容参见Barinaga，Science 257∶880(1992);Fremont et al.，Science 257∶919(1992);Matsumura et al.，Science 257∶927(1992);Latron et al.，Science 257∶964(1992)。
T细胞识别细胞异常情况的机理也已经包含在癌症机理中。例如，1992年5月22日申请，并于1992年11月26日公开的PCT/US92/04354专利申请中揭示了一组基因，它在细胞表面表达的肽被加工处理后，可使特异性的CTLs溶解肿瘤细胞。该基因据称可编码“肿瘤排斥抗原前体”(tumor rejection antigen precu rsors)，即“TRAP”分子，由此得到的多肽称做“肿瘤排斥抗原”即“TRAs”分子。参见Traversar et al.，Immunogen etics 35∶145(1992)∶van der Bruggen et al.，Science 254∶1643(1991)从该文献中能进一步了解到这类基因的资料。
在US专利申请938，334中，记载了由HLA-A1分子提呈的九肽(nonapeptides)。该文献指出人们了解到特定肽对特定HLA分子特异性的话，那么就希望一个特定多肽分子结合一个HLA分子，而不结合其他分子。这一点很重要，因为不同的个体具有不同的HLA表型。其结果是，一旦鉴定出一个特定肽是一个特异性HLA分子的匹配物(partner)则具有诊断和治疗作用，对于具有那种特定HLA表型的个体而言，就只有与之相关了。该领域还需要进一步研究，因为细胞的异常性并不只受一个特殊HLA表型限制，定位疗法(targeted therapy)还需要有关该问题中异常细胞表型方面的知识。
在1993年1月22日申请的US008，446专利申请中披露MAGE-1表达产物被处理成另一个TRA。这个TRA由HLA-C10-分子提呈。该文献指出所述的TRAP能产生出大量的TRAs。
在1992年12月22日提交的US994，928专利申请中，酪氨酸酶被说成为肿瘤排斥抗原前体。该文献记载由某些正常细胞(例如黑色素细胞)产生的分子在肿瘤细胞中被加工处理成肿瘤排斥抗原，该抗原由HLA-A2提呈。
现在已经发现有其他核酸分子编码与前述不同的肿瘤排斥抗原前体。本发明中所述的TRAP被加工成至少一种由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原，然而序列分析显示本发明的TRAP不是酪氨酸酶，同酪氨酸酶也无关。因此，本发明涉及的核酸分子编码的肿瘤排斥抗原前体，即“TRAP”分子(tumor rejection antigen precursor)，不是酪氨酸酶(tyrosinase)。本发明之TRAP进一步被加工成至少一种肿瘤排斥抗原，即“TRA”，该抗原由HLA-A2分子提呈。该TRA同酪氨酸酶无关，而且来自本发明的TRAPs的其他TRAs可以由其他的HLA分子提呈。
以下将进一步描述本发明各个方面的内容。
附图简要说明

图1A表示用CTL克隆I/95对LB39-MEL，K562，和LB39胚细胞的细胞溶解试验结果。
图1B表示用CTL克隆I/95对SK23-MEL和SK29-MEL的溶解结果。
图2是采用各种细胞系和CTL I/95进行肿瘤坏死因子(TNF)释放测定结果。
图3A是用CTL克隆I/95检测由不同细胞系包括转染了诱导的TNF释放试验结果。
图3B表示用CTL克隆IVSB的TNF释放数据。
图3C所示用CTL克隆10/196的TNT释放。
图4表示一组织、细胞系和肿瘤，采用来自本文所述的核酸分子寡聚核苷酸探针，并用聚合酶链反应检测AaG1c124的表达情况。
实施例1用标准方法采集患者LB39的黑色素瘤细胞，建立了一株黑色素瘤细胞系“LB-39-MEL”。一旦细胞系建立之后，辐照其样品，目的是使细胞不再具有繁殖性能。然后这些辐照后的细胞用于分离其特异性的溶细胞性T细胞(“CTLs”)(cytolytic T cells)。
从患者LB39处采集外周血单核细胞(“PBMCs”)样品再将其与辐照后的黑色素瘤细胞相接触。观察混合物以确定所述黑色素瘤细胞的溶解情况，这将显示血样中存在有由黑色素瘤细胞提呈的HLA分子和肽形成的复合体特异性的CTLs。
采用的细胞溶解测定方法是铬释放测定法，参见Herin et al.，Int.J.Cancer 39∶390-396(1986)。该方法为体外长好的黑色素瘤靶细胞，然后，以107细胞/ml悬浮在DMEM中，加入10mM HEPES和30%FCS，用200μCi/ml的Na(51Cr)O4一起共同在37℃孵育45分钟。再用含有10mM Hepes的DMEM液洗涤标记细胞三次，细胞进一步悬浮含有10mM Hepes和100%FCS的DMEM液中使之成为100μl中含有103细胞时，将其分配到96孔的培养板中。再将100μl用上述同样培养基悬浮的外周血淋巴细胞样品加到上述板孔中，每样重复测定二次。然后以100g离心培养板4分钟，在80%的CO2条件中37℃孵育4小时。
再离心该培养板，收集100μl上清液，计数。51Cr释放的百分数计算公式如下%51Cr释放＝ ((ER-SR))/((MR-SR)) ×100其中ER为观察到的实验51Cr释放量，SR是单纯在200μl培养基中孵育103标记细胞测到的自发性释放量，MR是向靶细胞中加入100μ1 0.3%Triton X-100而得到的最大释放量。
那些显示高CTL活性的单核细胞血样经过有限稀释扩大和克隆，再用同样的方法筛选。从而分离出CTL克隆LB39-CTL I/95。
采用相同方法测定靶细胞K562，以及植物血凝素Plant Haemoagglutinin(PHA)诱导的T胚细胞(blasts)。如图1A所示，其结果表明该CTL克隆可识别和溶解黑色素瘤细胞系，但不识别和溶解K562或者所述的T细胞胚细胞。然后再用与前述相同方式用CTL，LB39-CTL I/95对黑色素瘤细胞系SK23-MEL和SK29 MEL进行测定。这两种细胞系的细胞也都溶解了。这两种细胞系都是从配型试验确定为HLA-A2的LB39患者体内分离得到的。因此该结果表示所述的CTL克隆LB39-CTL/I/95识别的是由HLA-A2提呈的抗原。
实施例2进一步进行的研究是为了判断当LB39-CTL I/95同靶细胞接触时是否也产生肿瘤坏死因子(“TNF”)。其采用的方法参见Traversari et al.，Immunogenetics35∶145～152(1992)。简单地讲，将CTL细胞系的样品同目的靶细胞的样品(Sample of a target cell of interest)，在培养基中混合。24小时后，移出培养物上清，然后测定其对TNF敏感的WEHI细胞的作用。除LB39-MEL和SK23-MEL之外，如上所述，还测定其他的HLA-A2细胞系，如SK29-MEL.1，HLA-A2缺失突变体(HLA-A2 Loss variant)，如SEK29-MEL1.22，和无HLA-A2细胞系(a non HAL-A2 Line)，如MZ2-MEL，它是HLA-A1。
其结果见图2，其中是以依赖接触上清后死亡的WEHI细胞的百分数表示。这些结果表明HLA-A2缺失突变体SK29-MEL1.22不能刺激所述的CTL克隆，因此证实由LB39-CTL I/95识别的抗原由HLA-A2表示。
实施例3实施例2的结果表示SK MEL29.1代表目的靶抗原(the target antigen of interest)，可被用来做总的RNA源的制备cDNA文库。
从该细胞系先分离出总RNA。在确定一个共识的方法后再采用寡聚-dT结合试剂盒(oligo-dT binding kit)分离出mRNA，一旦mRNA获得后，再用标准方法将其转录成cDNA。然后按试剂盒产品说明书将cDNA连接到EcoRI接头上并克隆到质粒pcDNA-I/Amp的EcoRI位点中。再将重组质粒用电穿孔法(electroporated)转染到大肠杆菌受体菌JM101株中。(电穿孔条件在2500v，25μ法拉第条件下，脉冲1次)。
用氨苄青霉素(50μg/ml)筛选转染后的细菌，然后分成800个库(pools)。每个库含100个克隆。每个库代表着约50个不同的cDNAs，因为分析结果表明约50%的质粒含有一个插入片段。每个库的质粒扩增至饱盒后不用酚抽提而用碱溶解细菌，醋酸钾沉淀法分离出质粒DNA。其方法参见Maniatis et al.，in Molecular Cloning∶Laboratory Manual(Cold Spring Harbor，N.Y.1982)。
实施例4按实施例3的方法制备文库，将cDNA转染到真核细胞内。此处所述的转染可以重复二次。以每孔15，000个细胞的量把COS-7细胞样品种植到组织培养用平底微孔板的板孔内，培养基是含有10%的胎牛血清的Dulbeco’s modified Eagles Medium(“DMEM”)。37℃过夜孵育细胞后，除去培养基，再在每孔内加入30μl含有10%Nu血清，400μg/ml DEAE-葡聚糖，100μM氯奎，100ng的质粒pc DNA-I/Amp-A2以及加上所述的一组cDNA文库的DNA100ng的DMEM培养基。质粒pc DNA-I/Amp-A2含有源于SK29-MEL的HLA-A2基因。在37℃进行4小时孵育后，去除培养基，加入50μl含有10%二甲亚砜(DMSO)的PBS。两分钟后，去除该培养基，再换入含有10%胎牛血清(FCS)的200μl的DMEM。
在进行上述各培养基变换后，37℃孵育COS细胞48小时。弃去培养基，加入1000个CTL I/95细胞到100μl含有10%库后的人血和25μ/ml的白细胞介素(IL-2)的Iscove培养基。24小时后去掉上清，在WEHI细胞上测定TNF的含量，其方法参见前述Traversariet al.。
在800个受检克隆库中，有99%可刺激TNF释放，上清中浓度可达3～6pg/ml。有两个库的产率超过8pg/ml，并且在重复孔中产率也超过8pg/ml。
实施例5上清液内TNF高产率的两个库被选出来作进一步研究。特别是将细菌克隆，从每个库中检测800个细菌。并从中提取出质粒DNA，以前述记载的相同的方式将质粒DNA转染到COS细胞的新样品中。再次测定所述的细胞是否可刺激LB39-CTL克隆I/95。发现一个阳性克隆，命名为AaG1c124。通过对阳性克隆的c DNA和HLA-A2基因转染的COS细胞，仅用HLA-A2基因转染的COS细胞和细胞系SK29-MEL的比较试验可以获得CTLs识别的转染细胞这一确切的证据。参照前述，在WEHI细胞上测定CTL上清中的TNF释放量。采用MTT测定WEHI活细胞的光密度值。图3所示用CTL克隆I/95获得的结果。
进一步测定表明在转染细胞中由HLA-A2提呈的肽不同于以前的观察到的肽，即酪氨酸酶衍生的肽。CTL克隆I VSB对酪氨酸酶衍生肽和HLA-A2的复合体具有特异性。当这一CTL克隆与用AaG1c124和HLA-A2转染过的细胞接触时，如图3B所示TNF释放量最低。
实施例6移出阳性克隆的cDNA，用公知技术对其测序。序列检索表明质粒插入片段显示与公知的基因或蛋白无同源性。序列识别数号(SEQ ID NO)1表示cDNA核苷酸信息，显示出一个从第25至431位的大的、开放读框，与119个氨基酸碱基的蛋白产物相对应。SEQ ID NO∶2表示SEQ ID NO∶1部分延长序列。
实施例7以相同的方法分离CTL克隆LB39-CTL I/95，采自从患者SK29(AV)建立的黑色素瘤细胞系和PBMCs的样品用于分离出CTL克隆SK29-CTL 10/96。按实施例5中所述的相同方法测定这一新的细胞系。其检测结果见图3C，表明由AaG1 c124编码的肿瘤排斥抗原(下文中称其为抗原“LB39-Aa”)，也可被这种CTL克隆识别。这些试验表明其他患者事实上的确可产生对这一抗原特异的CTLs。
由上述序列制备出寡聚核苷酸探针，该探针用于标准聚合酶链反应方法中以确定在正常组织，肿瘤和肿瘤细胞系该基因的表达。其结果见图4，可见在待检的正常组织中只有黑色素细胞表达了基因。注意所有待检的肿瘤样品和/或黑色素瘤细胞系都测出了该基因的表达。
上文的试验描述了一种新分离的编码肿瘤排斥抗原前体，即“TRAP”分子的核酸序列。该分子在细胞内被加工后可生成至少一种肿瘤排斥抗原，即“TRA”。它由HLA-A2分子提呈。前述的HLA-A2表示源于酪氨酸酶的肽，而本发明的核酸序列却不编码酪氨酸酶，所述的TRAs也不是来自酪氨酸酶。
因此，本发明涉及一种分离得到的核酸分子，它编码肿瘤排斥抗原前体，即“TRAP”，而所述的TRAP不是酪氨酸酶。TRAP编码的是一种被加工后成为至少一种肿瘤排斥抗原即TRA，，它由细胞表面的HLA-A2分子提呈。本发明的核酸分子可以是，基因组DNA(“gDNA”)，互补DNA(“cDNA”)，或者一种RNA方式的分子。本发明也涉及分离出的与上述分子互补的核酸分子。本发明特别优选的形式是含SEQ ID NO∶1∶所示序列的分子。
本发明还包括含有本发明之核酸分子的载体，它在操作上与一个启动子相连。所述的载体也可包括编码HLA-A2的分子。HLA-A2和TRAP这两个分子必需能产生一溶细胞性T细胞反应，本发明还包括表达体系，其中编码TRAP和HLA-A2的核酸分子是以单独的各部分形式出现在一个试剂盒中。本发明还包括由本文所述的载体转染的细胞系，这些细胞系是原核细胞，如大肠杆菌，或者真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(“CHO”)或者COS细胞。
如前所述，TRA和HLA-A2复合体可激发溶细胞性T细胞反应，分离出的肿瘤排斥抗原和HLA-A2分子的复合体也被包括在本发明之中，这也包括前述的由核酸序列编码的所分离的肿瘤排斥抗原前体。
本文所述的发明具有许多用途，本文的记载的某些作用包括，首先鉴定由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原，以及编码其对等肿瘤排斥基因前体的核酸分子可使技术人员通过TRAP的表达特征、诊断疾病。这些方法涉及确定TRAP的表达，和/或采自TRAP的TRAs，例如由HLA-A2提呈的TRA。其他的TRAs也可源于本发明的TRAPs并由不同的HLA分子提呈。在前者情形下，经过任何标准核酸鉴定试验，包括聚合酶链反应，或用标记杂交探针测定等方法进行鉴定。在后者情形下，特别优选采用TRA和HLA复合体的配对结合试验。
TRAP基因分离也使得对分离TRAP分子本身，特别是含有SEQ ID NO∶1氨基酸序列的TRAP分子成为可能。这些分离出的分子，当以TRA表示，或者以TRA和HLA复合体的形式表示时，它可以同佐剂类的材料结合，以制备出用于治疗因TRAP分子表达为特征的疾病。另外，也可以用在细胞表面提呈TRA/HLA复合体的细胞来制备疫苗，这些细胞包括具有无培殖特性的癌细胞，不增殖的转染子等等。当采用细胞制备疫苗的情况下，所有这些细胞可以是用必须证实具有CTL反应的，一个或两个组分的编码序列转染的细胞，或者是不进行转染而表达两种分子的细胞。进一步讲，所述的TRAP分子，及其相关的TRAs和TRA与HLA的复合体都可按现有技术中公知的标准方法用于制备抗体。
本文中所用的疾病“(disorder)均表示由表达肿瘤排斥抗原前体而出现的任何一种病理学上的改变，例如特别是恶性黑色素瘤。
按本文公开的内容，其治疗途经假定推论为受治疗者的免疫系统反应，这将会导致提呈TRA细胞，如HLA-A2细胞的溶解。其中这一方法为向具有确定不清的表型异常细胞的受治疗者供给对所述复合体特异性的CTLs。本领域普通技术人员知道在体外如何去制备这种CTLs。特别是象血细胞类的细胞样品同所述的可提呈该复合体并能够激发特异性CTL增殖的细胞相混合接触。靶细胞可以是转染子，例如如前述中记载的那种类型的COS细胞。这些转染子在其表面上提呈所需的复合体，当与目的CTL(CTL of interest)相结合时，就刺激它的增殖。象那些广泛使用的COS细胞可作为其他合适的宿主细胞。
为了详述采用的转移治疗方法，参见称作接纳性转移(adoptive transfer)的有关文献。(Greeneberg，J.Immnnol.136(5)∶1917(1986);Reddel et al.，Science 257238(7-10-92);Lynch et al.，Eur.J.Immunol.21∶1403-1410(1991);Kast et al.，Cell59∶603-614(11-17-89)，若将提呈所需的复合体细胞与CTLs混合则会导致特异性的CTLs增殖。然后把增殖后的CTLs供给患有细胞异常的受治疗者，其异常的特征为某些提呈特定复合体的异常细胞。然后所述的CTL溶解异常细胞，从而达到所需治疗目的。
前述的治疗方法说明至少某些患者的异常细胞呈现HLA/TRA复合体。这一点很容易确定，因为现有技术人员对鉴定提呈特定HLA分子细胞的方法非常熟悉，也对如何鉴定表达含有的所述序列DNA的细胞很熟悉。一且分离之后，可用这种细胞与患者的异常细胞样品一并作用在体外测定细胞溶解情况。假如观察到有溶解，在这种治疗时使用特异性的CTLs可以缓解同异常细胞相关的疾病。采用标准测定，一个较少使用的方法可用于检查异常细胞的HLA表型配型，以及用PCR经扩增测定表达情况。
按本发明接纳性转移(Adoptive transfer)不是本发明唯一的一种可行的治疗形式。采用各种方法，在体内也能激发CTLs。按前述报道用表达复合物的不增殖细胞也是一种方法。在这一方法中使用的细胞正是正常表达复合体的细胞。例如辐射过的黑色素瘤细胞，或用提呈这种复合体所需的一种或两种基因转染的细胞，Chen等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA88∶110～114(1991年1月)列举了这种方法，在其治疗方案中采用了表达HPVE7肽的转染细胞。可以使用各种细胞类型。同样携带一种或二种相关目的基因的载体也可以使用。特别优选的是病毒或细菌载体。在这些体系中，用痘苗病毒或者细菌BCG并携带目的基因。事实上这些材料可“感染”宿主细胞，其最后提呈相关目的复合体(Complex of interest)的细胞被同源CTLs识别，然后增殖。将肿瘤排斥抗原或其前体与一佐剂结合，加速形成提呈目的HLA分子的HLA-A2提呈细胞，也能达到同样的效果。TRAP被加工后就会产生HLA分子肽匹配(peptide partner)，同时TRA不必进一步加工就能被提呈。
本发明的其他方面对于本领域的熟练技术人员十分清楚，本文不必重复。
本文中已经使用的专业术语和表达方式仅用于解释名词术语，不起限定作用，也无任何试图用这些术语和表达方式排除其他任何同等特征的术语和表达之意，因此在本发明范围之内进行的各种修改均被视为可能。
(1)SEQ ID NO∶1的数据(ⅰ)序列特征(A)长度354个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓谱线性(ⅹⅰ)序列名称 SEQ ID NO∶1
(2)SEQ ID NO∶2的数据(ⅰ)序列特征(A)长度676个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓谱线性(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO∶权利要求
1.编码一种分离出的肿瘤排斥抗原前体核酸分子，以及与这种抗原前体核酸分子互补的核酸分子，该前体经加工可成为由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原。
2.如权利要求1所述分离出的核酸分子，其中所述的核酸分子编码所述的肿瘤排斥抗原前体。
3.如权利要求2所述的分离出的核酸分子，其中所述的核酸分子是DNA。
4.如权利要求3所述的分离出的核酸分子，其中所述的DNA是c DNA。
5.如权利要求4所述的分离出的核酸分子，包括SEQ ID NO∶1的核苷酸序列。
6.含有权利要求1所述的核酸分子和能操作接上一启动子的载体。
7.如权利要求6所述的载体，包括SEQ ID NO∶1的核苷酸序列。
8.用如权利要求1所述分离出的核酸分子转染的细胞系。
9.如权利要求8所述的细胞系，其中所述的核酸分子包括SEQ ID NO∶1的核苷酸序列。
10.用载体转染过的，如权利要求8所述的细胞系。
11.如权利要求10所述的细胞系，其中所述的载体包含SEQ ID NO∶1的核苷酸序列。
12.用编码HLA-A2的核酸分子转染的，如权利要求8所述的细胞系。
13.如权利要求6所述的载体，还包含一编码HLA-A2的核酸分子。
14.经权利要求2所述的核酸分子编码的，分离出的肿瘤排斥抗原前体。
全文摘要
本发明涉及编码肿瘤排斥抗原前体的核酸分子。具体说，该肿瘤排斥抗原前体或称TRAP被加工成至少一种由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原。
文档编号C12N5/10GK1093406SQ9410342
公开日1994年10月12日 申请日期1994年3月18日 优先权日1993年3月18日
发明者文森特·布里查德, 艾琳·范佩尔, 卡地亚·特拉弗沙里, 托马斯·沃夫尔, 艾泰恩·德普里, 蒂尔瑞·布恩·法勒尔 申请人:路德维格癌症研究所