专利名称：新生隐球菌的鉴定方法及其所用的培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新生隐球菌的鉴定方法，即一种能够同时检测出该菌种尿素酶特性与酚氧化酶特性的鉴定方法以及该方法所使用的培养基。
新生隐球菌是临床引起隐球菌病的最主要病原性真菌，该病易发生于免疫功能受损的病人，尤其多见于AIDS患者。由于新生隐球菌感染的治疗困难，早期诊断及发现病原菌具有重要意义。传统上，国内外许多医学临床实验室都将尿素酶检测作为新生隐球菌鉴定的重要项目，其阴性结果往往是否定被鉴定菌株为新生隐球菌的主要依据之一。但是近些年，对新生隐球菌的研究结果表明，该菌具有明显的生物学多态性，尤其是新近发现该菌的尿素酶阴性株，这就给临床的菌种鉴定提出了鉴定方法的问题。传统方法显然不能鉴定出尿素酶阴性菌株。同时尿素酶试验方法已经应用了多年，其培养基的制备较为复杂。在我们研究过程中及结合国外已有的报告观察到具不同生物学特性的新生隐球菌均特异性地含有酚氧化酶活性，但是由于酚氧化酶检测的培养基的制备亦无统一的简便方法，从而限制了这些检测项目的广泛使用。
另外，如果采用检测酚氧化酶的方法鉴定新生隐球菌，则在临床上仍需用传统方法再鉴别其尿素酶活性，以区分出尿素酶阳性菌株与阴性菌株。在两种不同培养基中分别进行两次试验，显然不利于结果的判断，而且费时，费力，经济上造成浪费。在同时作大量样品鉴定时，还增加了出差错的可能。
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明将提供一种新生隐球菌的鉴定方法及其培养基，它能准确，简便，快捷，经济地鉴定出新生隐球菌，并且同时鉴定它的两种生物特性，即在检测酚氧化酶，以鉴定新生隐球菌的同时，鉴别出尿素酶阳性菌株或阴性菌株，将使该菌种鉴定的工作量减少到传统方法的1/3，有利于临床上的推广，应用。
为完成上述任务，本发明提供下述技术方案在同一培养基中同时设置两组针对不同生物特性的检测底物，即可因尿素酶的存在而使培养基变色的尿素酶检测底物，与可因酚氧化酶的存在而使菌落变色的酚氧化酶检测底物，同时在培养基中设置H+浓度调节剂，并控制两组底物的浓度与温度，以使两组检测反应同步进行，同时显示结果。
尿素酶是一种胞外酶，该酶作用于尿素，使其分解为NH3和CO2，导致PH升高使PH指示剂变色，如酚红由黄变红。酚氧化酶是一种胞内酶，该酶作用于双酚或单酚化合物如多巴、甲基多巴、儿茶酚、咖啡酸等产生黑色素(melanin)，导致菌的生长菌落变为棕色。即同一培养基中含有二种相应的底物时，可以发生二个可以明确区分的酶反应，即尿素酶使培养基变色，酚氧化酶使菌落变色，从而达到同时检测二种酶活性的目的。
本发明实验方法如下①使用多因素正交试验及线性分析方法研究底物浓度、温度、H+离子含量等变化对二种酶同时反应的影响。
②对尿素酶反应选择更好的PH指示剂和最适尿素用量。
③比较并简化基础培养基并确定各种成份的用量(配方)，同时考虑在国内实施生产的可行性。
④与分别进行两种酶检测法比较在同一培养基上进行两种酶检测方法的可靠性。
⑤用多种临床常见的酵母或酵母样真菌作敏感性、特异性、检测效率及可行性分析。
经实验得到的综合试验培养基的配方为尿素检测底物为尿素与适量的PH指示剂(如溴麝香草酚蓝或酚红等);酚氧化酶的检测底物为单酚或双酚化合物，例如咖啡酸，儿茶酚，多巴，多巴胺，没食子酸，肾上腺素，去甲肾上腺素或甲基多巴等;H+浓度调节剂为KH2PO4或NaH2PO4;培养温度在25℃;培养时间为24-72小时。培养基的赋型剂可以用玉米琼脂如Cornmeal agar (CDifco，USA)或加入葡萄糖，蛋白胨与NaCl的琼脂。其中玉米琼脂还可用玉米浸出液代替，玉米浸出液的制作方法是取玉米粉40g，加入1000ml蒸馏水混匀，于90℃浸出15分钟(摇动)之后用尼龙布过滤，即可。实施生产的流程为各种成份的称量→消毒灭菌→制成试管斜面→备用。使用方法为接种待检菌后于25℃培养观察，72小时内可得到结果(见附
图1和表1)。
即各组分的含量如下双酚或单酚化合物 0.3-0.6g/L尿素 3-20g/L
PH指示剂 适量(使用酚红时，为0.005-0.02g/L;使用麝香草酚蓝时为0.0008-0.0002g/L)H+浓度调节剂 0.1-0.8g/L赋型剂 适量(使用玉米琼脂时为15-20g/L，使用加菌葡萄糖，蛋白胨与NaCl的琼脂时，葡萄糖为0.5-2g，蛋白胨为0.5-2g，NaCl为3-8g，琼脂为15-20g)助溶酚类化合物时可使用15-25ml无水乙醇，其余为蒸馏水。
优点及效果采用本发明所示的方法检测二种酶的活性具有下述优点1.与传统方法相比，本发明提供了同时进行两项检测的方法，从而极大地方便了实验的实施，结果的观察和记录。使用者仅需将接种好的试管放于25℃培养72小时即可得到二种酶反应的结果。
2.本发明解决了临床快捷，可靠的鉴定具不同生物学特性的新生隐球菌的问题，尤其是解决了正确鉴定尿素酶阴性新生隐球菌的问题。
3.由本发明得到的综合培养基的构成做到尽可能的简化，且制备过程仅相当于制备一项检测所使用的培养基的工作量，原材料大约只相当于分开进行两项试验的1/3。并且全部采用国产试剂，无毒，无污染，极有利于本发明的生产实施和推广。
对44株新生隐球菌，以6株白念珠菌为对照，分别使用Christensen尿素酶培养基(日本Wakopure Chemical Industries，LTD产品)，仅含咖啡酸的培养基，仅含尿素酶的培养基及综合试验培养基进行试验。结果由四种培养基得到的结果完全一致，对13株具有现今发现的不同生物学特点的新生隐球菌典型菌株在综合培养基上检测两种酶的活性，结果与由传统方法得到的完全一致。
使用综合试验培养基检测140株临床常见酵母或酵母样真菌，结果全部受试的新生隐球菌(43株)均现酚氧化酶阳性反应，97株其它受试菌株均为阴性反应，表明所测酚氧化酶对新生隐球菌的特异性和敏感性均为100%。除受试新生隐球菌中两株已知尿素酶阴性株外，其余均呈尿素酶阳性，揭示本综合试验培养基可以有效地鉴定新生隐球菌尿素酶阴性株。此外，受试的其它菌种中除酚氧化酶全部阴性外，浅白和罗伦隐球菌，丝孢酵母属菌种，少数克柔氏念珠菌呈尿素酶阳性结果，提示该综合培养基有助于鉴定其它临床常见的酵母样真菌。
现通过实施例作进一步说明实施例1培养基分A，B两部分配制A液取咖啡酸0.4g，加入无水乙醇20ml，微加热助溶;溶解后补加5ml蒸馏水，可防止此后过滤除菌时无水乙醇破坏醋酸纤维滤膜而使除菌失败。加入尿素5g，溶解;加入4%溴麝香草酚蓝(储存液)15ml，溶解。
B液取玉米粉40g，加入1000ml蒸馏水混匀，于90℃±浸出15分钟(摇动)，之后用尼龙布过滤，不足960ml时用蒸馏水补足，加入KH2PO40.2g，琼脂20g。于121℃高压灭菌15分钟后冷却至60℃左右。
将A液用0.22um孔径的醋酸纤维滤膜过滤A液至冷却60℃左右的B液中，立即分装入0.4×10Cm试管(已消毒)，每管3ml，加盖后制成斜面。凝固后放4℃冰箱存放，可用3个月(暂定)。
使用时，加温后接种待测样品，在25℃下培养72小时，如出现棕色菌落，可鉴定为新生隐球菌;同时观察培养基，如无颜色改变，则为尿素酶阴性菌，如培养基变为兰色则为尿素酶阳性菌。具体分析结果见图1与表1。
图1综合培养基检测酚氧化酶和尿素酶实验结果(解释见表1)
表1综合培养基试验结果分析反应结果尿素酶 酚氧化酶 结果分析 见附图中+ + 新生隐球菌 ⑧⑨- + 新生隐球菌尿素酶阴性株 ⑧⑦+ - 隐球菌属中的其它菌种,等 ④⑤- - 念球菌菌属大部份菌种,等 ②③实施例2配制方法及使用方法与实施例1相同，配方更改如下儿茶酚 0.3g/L尿素 3g/L酚红 0.02g/LNaH2PO40.1g/L玉米琼脂 17.5g加蒸馏水至900ml无水乙醇 15ml蒸馏水补足 1L实施例3配制方法及使用方法与实施例1相同，配方更改如下多巴 0.6g/L尿素 20g/L酚红 0.005g/LKH2PO40.8g/L葡萄糖 2g/L蛋白胨 2g/LNaCl 8g/L琼脂 20g/L无水乙醇 25ml蒸馏水补足 1L
实施例4配制方法及使用方法与实施例1基本相同，配方更改如下多巴胺 0.5g/L尿素 10g/LNaH2PO40.6g/L4%溴麝香草酚蓝 5ml4%玉米浸液 9800g无水乙醇 15ml蒸馏水补足 1L
权利要求
1.新生隐球菌的鉴定方法，将待检样品接种在培养基中，进行培养，其特征是在培养基中同时设置两组针对不同生物特性的检测底物，即可因尿素酶的存在而使培养基变色的尿素酶检测底物，与可因酚氧化酶的存在而使菌落变色的酚氧化酶检测底物，同时，在培养基中设置H+浓度调节剂，并控制两组底物的浓度与培养温度，以使两组检测反应同步进行，同时显示结果。
2.按照权利要求1所述的新生隐球菌的鉴定方法，其特征是尿素酶检测底物为尿素与PH值指示剂，酚氧化酶的检测底物为单酚或双酚化合物，H+浓度调节剂为KH2PO4或NaH2PO4，接种后最佳培养温度为25℃。
3.一种新生隐球菌的培养基，由赋型剂，检测底物与蒸馏水组成，其特征是在培养基中同时设置有两组不同生物特性矫检测底物一组检测尿素酶的底物为尿素与ph值指示剂，另一组检测酚氧化酶的底物为单酚或双酚化合物，同时设置H+浓度调节剂。
4.按照权利要求3所述的培养基，其特征是单酚或双酚化合物为咖啡酸或儿茶酚或多巴或多巴胺，PH指示剂为溴麝香草酚蓝或酚红，H+浓度调节剂为KH2PO4或NaH2PO4，赋型剂为玉米琼脂或玉米浸液或加有葡萄糖，蛋白胨与NaCl的琼脂。
5.按照权利要求3或4所述的培养基，其特征是各组份配方如下单酚或双酚化合物 0.3-0.9g/L尿素 3-20g/LPH指示剂 适量H+浓度调节剂 适量无水乙醇(助溶酚类化合物用) 15-25ml其余为赋型剂与蒸馏水。
6.按照权利要求3，4或5的培养基，其特征是各成份优选含量为单酚或双酚化合物 最佳值0.4g/L尿素 最佳值5g/LPH指示剂 使用酚红时为0.005-0.02g/L，最佳值0.012g/L，使用溴麝香草酚兰时为0.0008-0.0002，最佳值0.0006g/L，无水乙醇 20mlH+浓度调节剂 0.2g/L
全文摘要
新生隐球菌的鉴定方法及其所用的培养基，可以在一种培养基上同时检测新生隐球菌的两种生物特性，即在培养基中同时设置两组检测底物；检测尿素酶的底物为尿素与pH值指示剂，可在尿素酶存在时使培养基变色；检测酚氧化酶活性的底物为双酚或单酚化合物，可在酶氧化酶存在时使菌株变为棕色。同时调节pH值、培养温度与底物浓度，使两种检测反应同步进行，同时显示结果，可简便，快捷，准确，经济地鉴定该菌种，并同时鉴定出菌株的尿素酶活性。
文档编号C12Q1/04GK1092468SQ94111230
公开日1994年9月21日 申请日期1994年1月25日 优先权日1994年1月25日
发明者李安生, 吴绍熙 申请人:中国医学科学院皮肤病研究所