专利名称：回收天然存在的大环内酯用的新萃取方法
技术领域：
本发明涉及从通过发酵方法得到的物质中将天然存在的中性大环内酯，具体是三环大环内酯如雷帕霉素、32-去甲雷帕霉素、15-去氧雷帕霉素或FK-506与其它天然存在的组分分离的方法。更具体地说，本发明涉及从发酵肉汤萃取提浓物和从母液提浓物中回收大三环内酯雷帕霉素的方法。
以雷帕霉素和FK-506为代表的三环大环内酯具有免疫抑制活性以抗菌和其它药物活性，可用于治疗皮肤及器官移植排斥、炎症和自身免疫疾病，如狼疮、类风湿关节炎、糖尿病和多发性硬化病。
三环大环内酯雷帕霉素、32-去甲雷帕霉素、15-去氧雷帕霉素和FK-506是在适当的条件下，由各种链霉菌属菌株发酵制得的，它们都是中性化合物，因为没有碱性氨基、酚基或羧基存在。雷帕霉素是通过在水介质中培养S吸水菌NRRL5491而制得的。含有三环大环内酯的丝菌体是从生长介质中回收并用如甲醇之类的有机溶剂萃取，以得到含有所需的三环大环内酯、相关化合物、酸性化合物(如脂肪酸)、碱性化合物(如生物碱和肽)以及中性亲脂化合物(如脂肪)的混合物。一般发酵肉汤提取物被浓缩以便于运输和/或储存，直到大环内酯能被分离。在本发明之前从发酵肉汤提取物中分离和提纯此三环大环内酯一直是使用各种化学和色谱技术来制取纯物质的昂贵实验室方法。[U.S. 5，091，389;U.S.3，993，749;WO 93/11130;Sehgal，J.of Antibiotics 28(10)727(1975)]。比如雷帕霉素发酵肉汤浓缩提取液只含有5～15%的雷帕霉素和不多于50%的酸性组分，雷帕霉素必须与其它组分分离。从发酵肉汤提取液中回收三环大环内酯的方法一般包括在活性炭上吸附和从它上面解吸、溶解度选择性操作和一次或几次使用柱状色谱和/或高压液相色谱的消耗时间多且昂贵的色谱操作。迄今为止一直避免酸性或碱性条件，因为认为像雷帕霉素这样的三环大环内酯在酸性或碱性条件下是不稳定的。在无机碱(如氢氧化钠水溶液)、有机碱(如4-甲基氨基吡啶，DMAP或1，8-二唑双环[5，4，0]+-烯-7，DBU)或无机酸水溶液(如盐酸)和Lewis酸(如氯化锌)等作用下，在水混溶性溶液如甲醇或四氢呋喃中的雷帕霉素会发生降解。[Steffan 等Tetrahedron Letter(布印刷中)，D.Yohanes和S.J.Danishefsky，Tetrahedron Letter 33(49)，7469-7472(1992);Luengo 等Tetrahedron Letter 34(6)，991-994(1993)和D.Yohannes 等，Tetrahedron Letters 34(13)，2075-2078(1993)]。
本发明提出了一个从浓缩发酵肉汤提取液中和从重结晶溶剂、研磨液和产品洗涤液中得到的它们的母液或浓缩液中回收大环内酯，特别是三环大环内酯，更具体为雷帕霉素的比较快捷而有效的方法，本发明避免了在U.S. 5，091，389;U.S. 3，993，749;WO 93/11130;和Sehgal，在J.of Antibiotics 28(10)727(1975)中举例的费时、价昂的色谱分离。这个方法包括通过将含有大环内酯的提浓液溶于适当的水混溶性溶剂、将酸性和/或碱性组分分别抽提到碱或酸水溶液中以及使用选择性溶解或萃取技术将浓缩液中的中性极性三环大环内酯与非极性中性物质分离，从而使酸性和/或碱性组分与中性组分分离。虽然本说明书中叙述的方法适用于发酵肉汤提取物或母液的提浓液，但只要发酵肉汤提取或重结晶、培养或洗涤所用的溶剂或混合剂对本方法是适合的、溶剂的量不过大，所有的提取溶液或母液溶液都可用于本发明的方法中。通过部分提浓可以减少溶剂的量。本发明的方法适用的任何溶液都可以认为是含大环内酯浓缩液。
通过本领域专业人员熟知的标准程序可将由所述方法得到的产物提纯可接受的纯度。
下面程序1中概述了本发明的方法，在如下的对本发明方法的公开中，非极性溶剂是一种非芳香的烃类，比如环己烷、环己烯、己烷、庚烷、戊烷等。与非芳烃相容的溶剂包括但不限于乙腈和二甲基甲酰胺。萃取这一术语表示将一种溶剂与另一种不混溶溶液充分混合，让这些互不混溶溶液彼此分离、并从物理上从一层或一个相中分离出另一层或另一相。洗涤一词当用作溶液时表示一种萃取操作，当用于固体时表示用一种固体基本不溶于其中的溶剂来漂洗该固体。母液一词指的是从所选固体的水萃取液、洗涤液及研磨液的结晶滤液、洗涤液及回萃液中得到的有机溶剂的溶液。大环内酯溶剂是一种将能溶解大环内酯及伴生杂质(如酸性或碱性组分)的溶剂或混合溶剂。大环内酯非溶剂是一种大环内酯基本不溶于其中，但在其中可溶解如脂肪之类中性组分的溶剂或混合溶剂。大环内酯结晶溶剂是大环内酯在其中可以进行重结晶，或从研磨中的无定形态进行结晶的溶剂或混合溶剂。在本方法需要将溶液进行浓缩之处，指的是溶剂或混合溶剂有足够的挥发度能够在不降解的温度及压力条件下被蒸馏掉。
程序1 按照本发明，将无论是来自发酵肉汤萃取液浓缩液，还是来自结晶和/或洗涤溶剂的含有大环内酯的浓缩液溶解于按其溶解此浓缩液的能力和易于除去来选择的水不混溶性溶剂或混合溶剂中，这些溶剂包括但不限于二氯甲烷、甲基叔丁基醚、醋酸乙酯、甲苯、1-丁醇、醋酸乙酯/甲苯混合物、庚烷/醋酸乙酯混合物或己烷/二氯甲烷混合物。用碱的水溶液，包括氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化铵等，最好是氢氧化钠，以0.1～5N的浓度，优选以约0.1～1.0N，最优选约0.1～0.5N的浓度来萃取酸性组分是特别适合的。有机碱如三乙胺不能像无机强碱水溶液那样有效地除去此酸性组分，用浓度为0.1～5N，优选约0.1～1.0N，最优选约0.1～0.5N的无机酸水溶液来萃取碱性组分是适宜的，这些酸包括盐酸、磷酸二氢甲、硫酸氢钠等，最好是盐酸。有机酸如三氟醋酸不能像无机酸那样有效地除去此碱性组分。在约-5℃至约45℃，优选约-5℃至约30℃，最优选约-5℃至约10℃下进行从含有大环内酯的溶液中萃取出酸性和/或碱性成份的操作，为避免大环内酯在酸或碱中可能发生的降解，此萃取工序应不加延迟地完成。根据存在的酸性和/或碱性组分数量的不同，无论是酸的萃取还是碱的萃取都可能不是必须的，只进行酸性组分的萃取或只进行碱性组分的萃取就可能足以从含大环内酯的溶液中除去得以分离三环大环内酯的足够杂质。
最好在一步省时间的萃取操作中从含大环内酯浓缩液的溶液中除去酸性(或碱性)组分。通过用碱的水溶液(或酸的水溶液)来萃取得自含大环内酯浓缩液溶液的一个等分部分，然后用pH计或其它测定pH值的方法来确定为了进行萃取使这一等分部分具有使化学当量上的碱(或酸)得以过剩时所需要的碱(或酸)的水溶液量就能够确定在此萃取工序中使碱(或酸)呈现过量所需要的碱(或酸)水溶液的量。然后按要进行萃取的溶液的量与从中所取出的等分部分的比例就能成比例地求出被取出等分部分的溶液萃取所需的碱(或酸)的水溶液的量。这样就可以在一步完成酸性(或碱性)组分的萃取，而不用像用碱(或酸)水溶液进行多次萃取那样操作。很明显，在含有大环内酯的溶液中既要除去酸性组分，也要除去碱性组分的场合将需要分别用碱的水溶液和酸的水溶液进行各自的萃取。例如，对于含有雷帕霉素浓缩溶液的溶液，用足以得到最终pH值为12的氢氧化钠进行一次萃取就足以基本除去所有的酸性组分。
用上述方法从溶液中回收的大环内酯可以用本领域专业人员所熟知的普通提纯技术被提纯到所需的纯度。如果需要，滤液和洗涤液可以再次用来回收大环内酯。
在进行了从含有大环内酯的水不混溶性溶剂的溶液中除去酸性和/或碱性组分的萃取操作以后，可以用下面的方法之一将此大环内酯与非极性中性组分分离(1)将与萃取出酸性和/或碱性组分并含有大环内酯的水不混溶性溶剂的溶液可以互相混溶的大环内酯非溶剂或混合非溶剂以足够的数量加到含有大环内酯的溶液中，使大环内酯和可能还有与大环内酯有关的产物不溶于得到的溶液当中，并形成分离相，然后，无论是油或是固体都可用本领域专业人员所熟知的普通分离技术来分开。
(2)将萃取出酸性和/或极性组分的含有大环内酯的与水不混溶溶剂的溶液进行浓缩，并将含有残留物的大环内酯溶于大环内酯可溶的溶剂中，此溶剂如乙腈或二甲基甲酰胺，再用非芳香烃溶剂如环己烷、己烷、庚烷或环己烯进行萃取。分离大环内酯可溶的溶剂层并进行浓缩。然后用结晶溶剂研制含有残留物的大环内酯，就得到了大环内酯(这时所述大环内酯是固体);或者用本领域专业人员熟知的技术进行提纯(这时所述大环内酯是油状物)。另外，在用非芳烃溶剂萃取后的大环内酯可溶溶剂可以如上面操作(1)那样用相容的大环内酯不溶的溶剂处理。
(3)将萃取出酸性和/或碱性组分的含有大环内酯的与水不混溶溶剂的溶液进行浓缩，并用大环内酯的结晶溶剂如二乙醚、二异丙基醚或甲基叔丁基醚将残留物进行研制。
另外，含有大环内酯的浓缩液可以先按照上述(1)至(3)的方法之一进行萃取以除去极性组分，然后将含有残留物的大环内酯溶于一种水不混溶性溶剂(如果当初用的不是这种溶剂)，并用碱和/或酸的水溶液萃取以除去酸性和/或碱性组分。
上述方法具有意外发现的优点，当从含有大环内酯的浓缩液在与水不混溶的溶剂中形成的溶液中进行酸或碱的水溶液萃取操作时，像雷帕霉素这样的大环内酯不会分解。鉴于从放在溶液中的酸或碱会导致雷帕霉素发生可观察到的降解这一事实，原来曾认为会发生降解的。
此萃取方法极大地缩短了从所述浓缩液中回收大环内酯所需要的时间，并避免了耗时与昂贵的色谱操作。
三环大环内酯雷帕霉素是一种可溶于甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、稍溶于二乙基醚、难溶于己烷或石油醚、不溶于水的结晶固体。雷帕霉素具有如下所示的结构。原子标数系统是按《化学文摘》(CA)所用的那种。
如下各实例仅用来说明本发明从发酵肉汤和母液的浓缩液中分离雷帕霉素的方法，不以任何方式构成对本发明范围的限制。在如下各实例中，通过物理、光谱及色谱性质与正式的雷帕霉素进行比较，确认分离出的产品确实为雷帕霉素。用高压液相色谱测定了未重结晶的产品纯度。
实施例1将浓缩的发酵肉汤萃取液(157.0克含雷帕霉素10.4%)放入600毫升二氯甲烷中，在0～5℃用0.5N的NaOH各150毫升洗涤三次，再用水洗涤直至洗涤液呈中性，再用盐水洗涤。将二氯甲烷溶液浓缩，用140毫升二乙基醚研制70.5克残留物。收集结晶的固体，用二乙基醚洗涤并干燥，得到6.3克雷帕霉素，纯度91.7%，产率35.4%，二乙基醚过滤液进行浓缩得到63.5克含雷帕霉素13.1%的油状物。
实施例2将浓缩的发酵肉汤萃取物溶液(206.0克，雷帕霉素含量11.8%)放入800毫升甲基叔丁基醚中，并在0～5℃用3份各400毫升0.5N的NaOH溶液洗涤，然后用水洗涤直至洗涤水成中性。将此甲基叔丁基醚溶液浓缩，并用150毫升二乙基醚研制75.0克残留物。收集晶状固体，用二乙基醚洗涤并干燥，得到11.4克雷帕霉素，纯度92.2%，产率43.3%。浓缩二乙基醚过滤液，得到具有11.3%雷帕霉素的油58.7克。
实施例3将浓缩的发酵肉汤萃取物溶液(10.58克，雷帕霉素含量10.4%)放入23毫升的乙腈中，并用2份23毫升的环己烷洗涤，然后浓缩。将残留液溶于二氯甲烷，依次用3份各23毫升的0.5NNaOH溶液在0～5℃洗涤，用2份各23份0.5N的HCl在0-5℃洗涤，再用水洗到洗涤水呈中性。浓缩该二氯甲烷溶液，并用二乙基醚研制4.07克残留物，收集晶状固体，用二乙基醚洗涤并干燥，得到0.64克雷帕霉素，纯度89.5%，产率58.2%。将二乙基醚过滤液得到3.36克含雷帕霉素9.8%的油状物。
实施例4将加入到400毫升醋酸乙酯中的浓缩发酵肉汤萃取液(100.0克，雷帕霉素含量11.8%)在0～5℃用一次200毫升和2次各100毫升的0.5NNaOH溶液洗涤，然后在0～5℃用2次各200毫升0.5N盐酸洗涤，最后用水洗至洗涤水呈中性为止。用100毫升醋酸乙酯反萃取洗涤水，将醋酸乙酯溶液合在一起。浓缩此醋酸乙酯溶液，并用45毫升二异丙基醚来研制43.2克残留物。收集晶状固体，用二异丙基醚洗涤并干燥，得到9.5克雷帕霉素纯度85.3%，产率68.7%。浓缩此二异丙基醚过滤液得到31.6克雷帕霉素含量6.6%的油状物。
实施例5将放于120毫升甲苯和25毫升醋酸乙酯混合物中的浓缩发酵肉汤萃取物溶液(25.2克，雷帕霉素含量10.4%)先后在0～5℃用三份各50毫升的0.5NNaOH溶液和在0～5℃用2份各50毫升0.5N盐酸重复洗涤，再用水洗到洗涤水呈中性。将此128毫升的甲苯/醋酸乙酯溶液分成相等的两分，进一步用如下方法处理方法A.浓缩此64毫升甲苯/醋酸乙酯溶液，用11毫升二乙基醚研制5.7克残留液。收集晶状固体，再用二乙基醚洗涤并干燥，得到0.84克雷帕霉素，纯度为92.7%，产率为64.1%。浓缩此二乙基醚过滤液得到4.3克雷帕霉素含量6.8%的油状物。
方法B，浓缩此64毫升甲苯/醋酸乙酯溶液，用50毫升乙腈溶解9.0克残留物。用2份各25毫升环己烷洗涤此乙腈溶液。然后浓缩此乙腈溶液并用11毫升二乙基醚研制4.3克残留液。收集晶状固体，用二乙基醚洗涤并干燥，得到0.81克雷帕霉素，纯度为94.6%，产率61.8%。浓缩此二乙基醚过滤液得到3.0克雷帕霉素含量5.9%的油状物。
实施例6用4000毫升甲基叔丁基醚研制母液浓缩液(996.0克，雷帕霉素含量21.6%)。收集结晶固体，并用500毫升甲基叔丁基醚洗涤并干燥，得到36.2克雷帕霉素(纯度为95.1%，产率为13.8%)。用1份2000毫升和2份各1000毫升的0.5N氢氧化钠在0～5℃洗涤过滤液。将碱性萃取液合在一起用500毫升甲基叔丁基醚洗涤一次。将甲基叔丁基醚过滤和萃取液合在一起并且水洗至洗涤水呈中性为止。将萃取水合在一起并用500毫升甲基叔丁基醚萃取。将甲基叔丁基醚溶液合在一起、浓缩，并用350毫升二异丙基醚研制377.1克残留液。收集结晶固体，用二异丙基醚洗涤并干燥，得到126.7克雷帕霉素(纯度为82.4%，产率为58.9%)。这样从母液浓缩液中回收雷帕霉素总量为162.9克(72.7%)。浓缩此二异丙基醚过滤液得到157.9克雷帕霉素含量为20.9%的油状物。
实施例7将放于2000毫升的二氯甲烷中的母液浓缩物溶液用3份500毫升的0.5N NaOH溶液在0～5℃洗涤，然后用1份200毫升的二氯甲烷萃取合在一起的碱水溶液萃取液。将有机溶液合在一起并用2份500毫升的0.5N盐酸溶液在0～5℃洗涤。用1份200毫升的二氯甲烷萃取合在一起的酸水萃取液。用水洗涤合在一起的有机萃取液，直至洗涤水呈中性。浓缩此有机溶液，并用250毫升二丙基醚研制255.0克残留液。收集结晶固体，用二异丙基醚洗涤并干燥，得到108.6克雷帕霉素(纯度为86.6%，回收率为77.4%)。浓缩此二异丙基醚过滤液得到100.2克雷帕霉素含量23.1%的油状物。
实施例8在0～5℃将400毫升0.5N NaOH水溶液加入到猛烈搅拌的冷冻(0～5℃)浓缩发酵肉汤萃取液(198.5克，雷帕霉素含量8.3%)在800毫升甲基叔丁基醚的溶液中，其加入速度应使温度保持在0～5℃。在剧烈搅拌5分钟之后，除去下层碱水层并储存在0～5℃。在0～5℃用2份200毫升的0.5NNaOH水溶液再次萃取有机层将碱水萃取液合在一起，并用200毫升甲基叔丁基醚进行再次萃取。将甲基叔丁基醚合在一起，并用水涤直到洗涤水呈中性(pH＝7)。将水洗液合在一起，并用100毫升甲基叔丁基醚萃取。将甲基叔丁基醚溶液合在一起，用饱合氯化钠水溶液洗涤，并在40℃下真空浓缩。用85毫升二异丙基醚在20～25℃研制残留物至少1个小时，混合物冷却至0～5℃过夜。用烧结玻璃Buchner漏斗收集结晶固体，并在20～25℃用4∶1二异丙基醚/甲基叔丁基醚混合物洗涤(5×20毫升或直至过滤液无色为止)。将结晶固体干燥至恒重得到12.0克雷帕霉素(91.2%纯度，回收率66.4%)。浓缩甲基叔丁基醚过滤液及洗涤液得到63.9克含有雷帕霉素3.63%的胶状物。
实施例9在搅拌下，在室温将母液浓缩液(200克，雷帕霉素含量25%)溶于800毫升甲基叔丁基醚中。搅拌下的溶液被冷却到0～5℃，并立即用预先冷却至0～5℃的270毫升0.65N NaOH水溶液萃取，同时保持混合物的温度在0～5℃。(以浓缩母液的一个等分部分为基础测定为使萃取最终pH值为12所需要的NaOH水溶液的数量)。
将碱水层储存在0～5℃，同时用5%的氯化钠水溶液洗涤有机层，保持混合物在0～5℃。用100毫升甲基叔丁基醚反向萃取碱水萃取液。将有机层合在一起，并用3份各200毫升的5%氯化钠溶液洗涤(最终水洗溶液的pH值为7.4)。在25～40℃的温度和减压(60～130毫米汞柱)下浓缩此有机溶液。在室温和搅拌下，在30分钟内缓慢向残留物中加入80毫升环己烷，并继续搅拌直至完成结晶(3小时)。在室温下搅拌此混合物1个多小时，将冷却至0～5℃的混合物在搅拌下过夜。然后在烧结玻璃Buchner漏斗收集灰白色的晶状固体。用每份40毫升的2∶3甲基叔丁基醚/环己烯混合物洗涤5次。在35～40℃和在真空烘箱中将固体干燥至恒重，得到22.7克雷帕霉素(纯度为90.6%，回收率为41.4%)。浓缩过滤液和洗涤液(甲基叔丁基醚和环己烯)得到60.1克雷帕霉素含量为37.5%的油状物。
权利要求
1.将大环内脂与在发酵肉汤萃取液中含有所述大环内酯的母液的浓缩液中存在的酸性、碱性和非极性中性杂质分离的方法，它包括下列各方法以任何顺序进行的一种或几种a.用碱的水溶液萃取所述浓缩液在与水不混溶溶剂中的溶液，基本除去所有酸性杂质；b.用酸的水溶液萃取所述浓缩液在与水不混溶溶剂中的溶液，基本除去所有碱性杂质；c.用非芳香烃溶剂处理所述浓缩液溶液以除去中性非极性杂质。
2.根据权利要求1的方法，其中通过与第一种溶剂不混溶而能溶解大环内酯的第二种非芳烃溶剂来萃取含有大环内酯的发酵肉汤萃取液浓缩液或母液浓缩液在第一种溶剂中的溶液，以除去其中的中性非极性组分。
3.根据权利要求1的方法，其中用足够数量的相容大环内酯非溶剂来处理在萃取了酸性和/或碱性组分之后的含有大环内酯的与水不混溶溶液，以使大环内酯在得到的混合溶剂中不溶解并因此从溶液中分离，藉此可以将大环内酯从混合溶剂中分离。
4.根据权利要求1的方法，其中将进行了酸性和/或碱性组分的萃取之后的含有大环内酯的水不互溶性溶液浓缩，并通过与结晶化溶剂或混合溶剂混合使残留物结晶。
5.根据权利要求1的方法，其中将进行了酸性和/或碱性组分的萃取之后的含有大环内酯的水不互溶性溶液浓缩，将残留物溶于第一种溶剂，并用与第一种溶剂不相容但可溶解大环内酯的非芳烃第二种溶剂萃取，以除去中性非极性杂质。
6.根据权利要求1的方法，其中先将发酵肉汤萃取液浓缩液或母液浓缩溶于第一种溶剂中，并用与所述第一种溶剂不相容的非芳烃第二种溶剂进行萃取以除去中性非极性杂质，然后将在第一种溶剂中的溶液进行浓缩，将残留物溶于与水不相容的溶剂，并用碱和/或酸性水溶液萃取以除去酸性和/或碱性杂质。
7.根据权利要求1的方法，其中大环内酯是三环大环内酯。
8.根据权利要求7的方法，其中三环大环内酯是雷帕霉素或其天然存在的同系物或类似物，或者是FK-506或其天然存在的同系物或类似物。
9.根据权利要求8的方法，其中三环大环内酯是雷帕霉素，32-去甲雷帕霉素或15-脱氧雷帕霉素。
10.根据权利要求9的方法，其中三环大环内酯是雷帕霉素。
11.根据权利要求8的方法，其中三环大环内酯是FK-506。
全文摘要
本发明涉及从发酵肉汤萃取液浓缩液或母液浓缩中回收大环内酯抗菌素，特别是如雷帕霉素之类的三环大环内酯的方法，按照此方法使用从所述浓缩液在与水不相容溶液中进行碱或酸水溶液的萃取以除去在发酵工艺中形成的酸性或碱性组分，通过选择性溶解度将非极性组分与大环内酯分离。
文档编号C12P19/44GK1109058SQ9411374
公开日1995年9月27日 申请日期1994年11月1日 优先权日1993年11月5日
发明者C·格列特索斯 申请人:美国家用产品公司