专利名称：一种用基因工程方法培养的抗病香料烟草的制作方法
本技术属于分子生物学领域中的植物基因工程学科。该成果在克隆TMV外壳蛋白基因，并获得高效表达的抗TMV烟草工程植株方面达到国际同类研究的先进水平。
现有技术本项目所采用的植物基因工程技术属新兴的高科技学科。以往经典的烟草育种技术都无法在同一水平上与之比较。目前植物基因工程的抗病毒育种方法可有几种，本项目采用的是一种已为国际承认的最有效而安全的方法;即将病毒的外壳蛋白基因转入植物基因组中去的技术。
植物的病毒危害是农业生产上损失最大的病害之一，到目前为止还没有很有效的方法来防治，通常采用的是用农药来杀死、控制传染病毒的昆虫，保护植物免受病毒侵染。这种方法的缺点是不但化学药品的价格较高，而且往往造成严重的环境污染。另一种方法是组织脱毒法，用于无性繁殖的一些植物。取这类植物的茎尖、芽尖等病毒尚未入侵到的组织，通过组培的方法，育出大量的无毒苗，用于田间生产。目前在马铃薯、草莓等上已经应用。这种方法的缺点是，组培脱毒育苗不但成本高，工作量大，而且由于病毒的田间再侵染，能维持无毒的有效期不长，两三年后产量又会严重下降。还有一种防病毒的方法叫交叉保护(croosprotection)法，当把一种病毒的弱株接种到植物上，同种的强病毒再侵染这些植物时，表现出植株受到保护的现象，此时强病毒的侵染能力和致病能力都大大降低。我国从70年代开始，主要将此法用于防止蕃茄上的病毒病。80年代在抗木瓜环斑病毒上也曾使用此法。这个经典的利用病毒的交叉保护特点建立的方法也存在着一些问题。首先，需要找到一株弱病毒，找到一株适用的这样的病毒，往往需要几年时间;其次，虽然选用的是弱病毒，但仍能在一定程度上降低此种作物的产量;再者，弱病毒株只能与和它相类似的病毒有交叉免疫作用，而对相距较大的病毒种类没有什么作用，有时甚至还能和这些不相关的病毒相互影响，加重病害，使作物遭到更大的损失。加之工作量大，成本高，此法比较难以广泛使用。利用植物基因工程解决病毒防治，现有5种方法。
第一种方法是向植物转入病毒的外壳蛋白基因。1986年，在美国通过植物基因工程成功地获得抗病毒的转基因植株。他们首次将烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因转移到了烟草和蕃茄的细胞里去，并培育成株。在这种蕃茄和烟草的叶片里都测到了烟草花叶病毒的外壳蛋白，并且发现当用烟草花叶病毒侵染这些植物时，这些植株能在一定程度上有抵抗作用。TMV外壳蛋白基因在细胞中的存在，能抑制TMV在寄主细胞中的复制，并能阻止或降低TMV在植株体内的传递。1986年的实验结果是在温室里得到的，后经美国农业部批准，这种转基因蕃茄已在美国的几个不同的地区进行了大田实验。结果表明，它们在大田里表现和在温室里的表现一致。大田实验的数据说明有TMV外壳蛋白的蕃茄，在接种TMV后，只有5%左右的植株得病，而对照植株的发病率是99%。在产量上与无病株相比，含TMV外壳蛋白的蕃茄几乎不减产，而对照组的产量损失达26-35%。从此提供了一条通过基因工程来抗病毒的十分诱人的途径。继抗烟草花病毒的外壳蛋白基因工程成功之后，现在已经完成的还有黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、苜蓿花叶病毒(AIMV)和最近即将报导的大豆花叶病毒(SMV)等的外壳蛋白基因工程。应该说，使用转病毒的外壳蛋白基因方法培育出来的抗病毒植物比较安全。因为外壳蛋白本身并没有毒性，我们平日吃的蕃茄和马铃薯里就有这些病毒，只是到目前为止我们还没有足够的证据证明这个方法能够解决所有种类的病毒危害。也许这种办法有一定的限度，但是直到目前为止我们还未曾发现它有什么副作用。另一个问题是，如果某种病毒的外壳蛋白能够装配由昆虫传染的它种病毒的RNA的话，也许会发生危险。但是，直到目前为止并没有提出任何有这种危险存在的迹象和实际根据。
第二种方法是通过病毒的卫星RNA的植物基因工程来防治病毒。不少种类的病毒有卫星RNA。黄瓜花叶病毒(CMV)的卫星RNA是利用植物基因工程方面最早获得成功的一个例子。但是人们普遍地认为，因为病毒的卫星RNA存在着不能彻底地抑制它的互补病毒的复制，本身具有很高的突变率，以及与它种病毒互补后会加强被补病毒的为害等几个问题，如果在生产上使用会有一定的潜在危险。因此，目前这方面的研究存在着一些困难，需要设计一些新的实验。如对卫星RNA的cDNA搞些点突变，作些改造，也许能在农业生产上使用。
第三种方法是利用病毒的反义RNA。这个方法最早用在动物病毒上，的作法是将病毒的基因组反向地结合在启动子后，这样就能在转基因的细胞里编码出反义基因。当外源的病毒RNA侵染进入植物细胞之后，和这些细胞里编码出来反义RNA形成互补，构成双链的RNA，使得病毒无法复制，减轻了病毒的为害。利用植物基因工程的技术，已经成功地将植物的一些病毒基因组反过来接在植物的启动子后面，转到植物细胞里去，出现了抵抗这些病毒侵染的结果。但是，这个方法也还有一些缺点，主要问题是需要比较大量的反义RNA才能彻底抵抗外源病毒的入侵。它的产量起码还要提高50倍，而目前的植物启动子都还达不到这个水平。所以，这个方法可以抵抗不太严重的病毒侵染;当入侵病毒的数量大时，它所起的作用就很小了。
第四个方法是利用植物自己编码的抗病基因。有些植物在受病毒侵染时，表现出一定的抵抗能力，最明显的例子是有的蕃茄品种能抗烟草花叶病毒。育种家们有许多带抗原的材料。我们可以通过克隆这类抗原基因，得到抗某种病毒的转基因植物。这方面的工作的困难在于分离到能被利用的基因。但是如果这种方法成功，这种转基因植物的危险应该最小。
第五，利用病毒上的其他基因。前面说到过的是利用病毒中的一个外壳蛋白基因。在病毒基因组中除了外壳蛋白基因外，还有其他一些基因、复制酶基因等等，我们有可能用改造基因组的办法得到抗病毒的基因。这个办法目前尚处于探索阶段。
在上述五种方法中，比较成功的还是前三种，在国外都已达到得到转基因植物的阶段，有的甚至已经进入大田实验。我国已经开展这方面的工作，并且已得到了不少成果。针对一些国家广泛流行严重的作物病毒，我们实验室开展了它们的外壳蛋白基因分离和转化的工作。现已成功地分离并合成了编码烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒和另外几种常见的作物病毒的外壳蛋白基因，并对这些基因作了序列等方面的分析;同时还得到了其中一些病毒外壳蛋白基因对我国现生产用的烟草、蕃茄优良品种的基因转化植物。全世界每年由植物病毒为害造成的作物减产，至少以10%计。我们这么大的农业国家，其损失难以计数。植物基因工程这一方面的工作对农业增产会有立竿见影的好处，我国需要大力开展这方面的工作。
发明的目的我国烟草行业所需的东方型香料(Oriental aromaticus tobacco)烟草需要量很大，国内目前的种植品种病毒病害严重，品质不高，产量亦不足，而进口不但耗费大量外汇，且常因口岸检疫不合格无法运进，因而严重制约我国香烟的质量与产量。本项目即以解决以上问题为目的而设计，因为影响香料品质和产量的主要原因就是病毒病。通过基因工程技术育成的抗病香料烟“PK-873”解决了TMV对这种烟的危害，并与丹东农科所烟草室合作，在我国丹东地区作了几年的大田试验，同时进行了成份分析和评吸，其结果表明，“PK-873”的大田性状及内在品质优于国产同种用途的香料烟，及我国引种的泰国香料烟。达到我国直接购进，用量最大的泰国香料烟水平。
本项目的主要内容是构建cDNA库，从中获取外壳蛋白基因，通过土壤农杆菌Ti质粒转入烟草，获得抗病烟草。
发明内容
及方案a.成功地克隆了抗TMV的外壳蛋白基因，用它建立了对植物进行转化的有效载体系统。
b.在国内首次利用植物基因工程技术获得了抗TMV的生产用香料烟草；并通过组织培养等方法选出了具有优良性状的工程植株。
c.至1994年已进行了累计3万余亩的大田试验，植株总数达到了亿株。
d.对基因工程香料烟进行了多项指标的品质鉴定。
e.对我国东北地区及山东提供了一个已经完成大田中试的抗病优质香料烟草命名为“PK-873”。
实施例材料与方法病毒实验所用的TMV是从天津甜椒上分离出的一个株系。
烟草用来接种病毒的烟草是TMV能够进行系统侵染的品种，拉丁名是Nciotiana tobacum L.Var.Samsum，接种结果见明显花斑、叶皱缩、叶片呈耳状突起出现厥叶，簇顶等。
酶合成cDNA用Promega的cDNA Syuthesis kit。
序列测定用Promega的K/RTTMSeguencing system中的T7Primer和Klenow。
同位素cDNA和序列测定均使用Amersham的α-32P-αATP。
接种通过机械摩擦接种病毒，摘取被侵染TMV的叶片5克，按3∶1(V/M)加入0.1M硼酸缓冲液pH7.0(0.1M硼酸，0.5mM EDTA，5mM 2-Me pH7.0)，研磨成匀浆，1000克离心30分钟，取上清液加入PEG(600)和NaCl使终浓度分别是4%和1%，在4℃-6℃下搅拌3-4小时，10，000克下离心30分钟，将沉淀悬浮在1/4原体积1/15M的磷酸缓冲液中(pH7.0)7，000克下离心10-15分钟，取上清液重复PEG沉淀及差速离心，取上清液加到预铺好的CsCl上(预铺CsCl梯度10%，20%，30%，40%的CsCl，等体积依次加入)，RP-55T rotor，30，000rpm3小时，用注射器吸出TMV带，用无菌水稀释，再用35，000rpm离心1小时，沉淀溶于水中。纯的TMV紫外扫描结果A280/260＝0.82浓度1.103/3.1×1000/30＝12mg/ml。
TMV RNA的提取TMV(2mg/ml)加入2X蛋白酶K缓冲液，再加蛋白酶K使其终浓度达50μg/ml，37℃下保温30～40分钟，两次等体积苯酚-氯仿，除去乙醚，加入2.5倍体积的无水乙醇，在-70℃放置20-25分钟，取出13，000～14，000rpm离心20-25分钟，沉淀用1ml70%冷乙醇洗一次，13，000～14，000rpm离心10-12分钟，倾去液体，将沉淀抽干，然后加ddH2O50μl溶解。
(1)TMV RNA的紫外扫描结果A260/280＝2.2浓度＝0.22/25×100＝0.88mg/ml。
(2)RNA电泳，结果TMV RNA6.4KpcDNA的合成A.合成PrimerTMV RNA上无polyA，因而逆转录合成cDNA的引物(Primer)需要人工合成，根据前人对TMV tomato stain的序列分析，设计合成了一般与已知序列3′端141-160碱基互补的序列。具体如下160 141tomato stain RNA-ACGUGGUACGUACGAUAACG-Primer TGCACCATGCATGCTATAGC其中第143号碱基的改变造成了一个EcoRV的酶切位点。
B.cDNA的合成a.第一链的合成RNA 1μg 0.38μg/μl 5μlPrimer 0.5μg 0.3μg/μl 2μlddH2O 22μl煮沸1分钟，马上放在冰上Rnasin fou/μl 1μllst buffer 10x 5μl
DTT 100mM 5μldNTDs 10mM 5μlα-32P-dATP 10μg/μl(1.5μl释4μl) 2μlAMV RTase 9.5μ/μl 2μl44℃保温1小时，追加AMV RTase 9.5μ/μl，44℃保温1小时。
b.第二链的合成dd氢 125μl2nd strand buffer 10x 23μlDTT 100mM 23μlNTDs 1mM 7μlα-32P-dATP 10μci/μ1(1.5μl释4μl) 2μlE.Coli DNA ligase 1μ/μl 1μl16℃保温30分钟，加RNase H1.9μ/μl，16℃保温2小时。
c.将CDNA补成平末端70℃加热10分钟，离心一下，放置在冰上。加入T4DNApolymerase 9μ/μl 0.5μ/μgRNA，37℃保温30分钟，加入20μl0.25M EDTA 1/2Vol 7.5M NH4AC 3倍体积乙醇，冰浴5～10分钟，离心13，000rpm离心30分钟，干燥沉淀，沉淀溶到20μl ddH2O中。
d.对一链、二链处理5μl一链，30μl二链，分别进行，加入1/10体积0.25M EDTA，1/10体积2N NaOH，65℃保温1小时，加入1/2体积7.5M NH4AC3倍体积乙醇，冰浴5～10分钟，离心13，000rpm离心30分钟，用80%冷乙醇洗，13，000rpm离心5分钟，干燥沉淀，溶于20μl碱性胶载样缓冲液中，点样前煮5～10分钟变性。
C.碱性胶电泳，常规方法。
D.cDNA连入BLUESCRIPT-smaⅠ位点。
E.将连接好的质粒转入E，ColiDH5株感受态细胞中。
cDNA克隆的鉴定
1、从经转化处理后的诸菌株中筛选cDNA插入克隆约100个，定名为pLcsN，并提取质粒。从cDNA克隆到Bluescript质粒中筛选，筛选获得不同大小的克隆分别编号为plcs23，plcs24，plcs72，plcs65，plcs64，plcs73，plcs26，plcs66，plcs44。
cDNA序列的测定克隆中任意选了一株，名字是plcs72，其插入cDNA大小为1.8Kp左右。用kleuow方法对其进行序列测定。
A.质粒的小量提取采用分子克隆上小量提质粒的方法，为适应测序要求的高纯度而略有变化，其一，第九步重复一次，以尽可能除去白色沉淀，其二，在苯酚-氯仿抽提前加入无DNA酶的RNA酶，终浓度为20μg/μl，37℃保温40～60分钟，其三，苯酚-氯仿以后，再用1倍体积氯仿∶异戌醇(24∶1)洗二次，其四，干燥后的沉淀溶于50μl TE(PH8.0)后，加入30μl120%PEG(6000，8000)-2.5MNaCl倒置混匀水浴60分钟(-70℃5-10分钟)12，000克离心15分钟，吸去上清，用1μl 70%冷乙醇洗沉淀离心抽干。将沉淀溶解在50μl TE PH8.0中。
B.质粒的碱变性加5.5μl 2N NaOH，在室温下放置5分钟，再加20μl 50M NH4Ac混匀，加入27的无水乙醇，冰上保温60分钟(-70℃5μl)取出在12，000克下离心10分钟，用200μl，70%乙醇洗，离心后，抽干沉淀，沉淀溶于ddH2O中，使其浓度是0.5μg/μl左右。
C.引物与模板的结合取6μl模板(～3μg)，加1.5μl 10×klenow buffer 3μl T7 prmer 10μg/μg混匀，把Ependorf管漂在一个250μl装满水的烧杯中，放入微波炉加热，待水开始沸腾，取出烧簿，使其在室温下自然降温，降到室温后，室温下离心进行下一步。
D.Klenow测定DNA序列再加入4μlα-32P-dATP(或5μl-α35与-dATP及1.0～1.5μlKlenow(7μ/μl)混匀。
再注有A、C、G、T四个硅化的Eppendorf管中加入3μl的dNTP 5ddNTP混合物，迅速加入刚混好的模板和酶的混合物3μl，37℃-40℃再保温30分钟，取出，分别加入1μl追加溶液37℃-40℃再保温30分钟，加入5μl反应停止液。
E.序列胶采用8%聚丙烯胺胶，0.4mm厚，成份丙烯胺甲叉丙烯胺胶尿素 10×TBE ddH2O 10%APT EMED7.6g 0.4g 48g 10ml 40ml 500μl 50μl放射自显影。序列测定结果如下(1)用plcs 72质粒，模板准备。
依次λdⅢ plcs72ds plcs72ds plcs72ds上样量4μl 6μl 6μl 6μl(2)以自显影进行序列分析对plcs72的初步测定，获得如下结果，从胶上读出TATCG，ATAAG，CTTGG，ATATC，ATCGG，AATTC，CTGCA，GCCCG，TAATA，CATCA，CGACA，GAGGA，TGCAT，TGTGT，ATTAC，GATCC，CCTAA，AGTTG，ATCTC，GAAAC，TTGGT，(G)CTAAA，CACCA，TCAAG，GATTG，GGAAC，ACTTG，G，共136bp，其中polylinker39个，cDNA97bp。
TMV外壳蛋白基因(CP基因)的获得根据前人工作，已经确定TMV CP基因在3′端。CP基因长为500bp左右，cDNA合成由3′一端开始，所以只要约800bp的cDNA就有可能取得需要的基因。经过酶切筛选，选出plcs70和plcs26，它们片段大小分别是900bp及1.1Kp，其中包括了CP基因。
将CP基因转到土壤农杆菌Co24质粒。
转入的方法有两种1、用双酶切出，定向连入Co24。
用Bam H Ⅰ和EcoR Ⅰ切出cDNA，用Bg1Ⅱ，EcoR Ⅰ切Co24，BamH Ⅰ与Bg1Ⅱ同尾，很容易把含CP基因的片投定向转入Co24。
2、用酶切出cDNA，用酶切开Co24后，用Klenow把所有片段补成平末端，连接筛选。由这种方法可以获得两个方向的插入。
(1)plcs70用定向连接转入Co24会产生不同大小等级的质粒。从获得的16个克隆中选出第15号，定名为plcs70-15，是含coat protein基因的Ti质粒。
(2)plcs26转入Co24plcs26用Bam H Ⅰ和EcoRⅠ切出cDNA，由Klenow变为平末端连入Co24，从69个克隆中酶切鉴定，第32号含有CP基因、定名为plcs26-3。
转化烟草材料及方法(一)材料1、菌株及菌液制备选用土壤农杆菌GV3111-SE(PTiH40)。挑取单菌落，在LB+Km50mg/l+Cm25mg/l+SPC100mg/l液体培养基中，200rpm，28℃培养24-36小时，至细菌处于对数生长期时，3000rpm离心10分钟，弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释5-20倍。稀释好的菌液用于转化。
2、烟草材料取温室中新鲜的巴什马型香料烟(Oriental tobocco)的烟草叶片，清水洗净。先放入75%乙醇中消毒30秒，再入10%次氯酸钠溶液中消毒8-10分钟，无菌水清洗三次。将表面消毒好的叶片剪成1平方米的叶块，用于转化。
3、哺育细胞选用生产迅速的胡罗卜悬浮细胞系。
4、植物培养基(1)T1，(用于细胞和叶片共培养)，MS培养基，3%蔗糖，1mg/l6-BA，0.1mg/lNAA，琼脂粉0.9%，PH＝5.6-5.8，高压灭菌。
(2)T2，(用于预培养)，T1培养基，500mg/l，苄青霉素(carb)。
(3)T3，(用于筛选培养)，T1培养基，100mg/lkm，500mg/lcarb。
(4)T4，(用于生根)，MS培养基，100mg/l，500mg/lcarb。
5、哺育细胞培养基B5培养基。
6、细菌培养基LB培养基，附加不同种类和浓度的抗生素。
(二)转化步骤(全部在无菌条件下进行)1、将叶片放入制备好的菌液中，浸泡3-5分钟取出，在无菌滤纸上吸干表面菌液。
2、T1培养基表面铺一层哺育细胞，其上覆盖一无菌滤纸，将1中已浸菌的叶块摆放在滤块上。28℃，黑暗中共培养48小时。
3、将叶块转入T2培养基中，放置光下，25-28℃培养24小时。
4、将叶块转放T3培养基中，光下25-28℃培养，约15天后叶块切口处有愈伤组织形成和芽点的分化。
5、叶块继续在T3上培养基，每20天左右换一次新鲜培养基。约2-3个月后，芽可长成高3-5cm的小植株。
6、切下较大的小植株，转T4培养基中，20天左右开始有根生成。继续培养40天左右，形成发达根系。
7、从培养瓶中取出根系发达的植株，无菌水洗净琼脂，移入土壤中。开始2-3周将植株用罩子罩住，待植株健壮后，取下罩子，在温室中培养(这步不需在无菌条件)。
由此获得转基因烟草植株，取名PK-873香料烟。
本项目的优点可分两个方面1、在大田种植方面a.抗TMV病毒感染率只有5%，且病势轻微，对照组感染率在99%以上。
b.生长方面和大田管理有关，且不在专利申请范围内，从略。
2、在品质方面抗病毒TMV香料烟草“PK-873”经过两次评定。
第一次评定，沈阳卷烟厂结论意见为香料烟“PK-873”可以用于混合型卷烟，大有开发扩种价值，从品质上讲，“PK-873”接近泰国香料烟的水平持平或略高。
根据第一次评定结果，为进一步确定“PK-873”的品质，由中国烟草总公司有关专家提议，由国家烟草总公司国家级评委迟桂香主持在天津召开的全国郑烟降低焦油讨论会上，由烟草总公司和15家烟厂20名专家采取封名编号打分的形式、评吸比较国内主要栽培品种“沙姆逊”、“泰国1号”、进口泰国香料烟AG(醇化两年以上)和“PK-873”评吸结果、“PK-873”得总分第一名至今为止，事实证明了基因工程香料烟“PK-873”可投入大田生产，在工业上使用也是可行的。
权利要求
1.一种用基因工程方法培养的抗病香料烟草，其特征是所述方法包括TMV纯化、TMV RNA提取、cDNA合成、TMV cDNA测序、TMV外壳蛋白基因(CP基因)的获得，用TMV外壳蛋白基因转化烟草细胞的培养及选育；1).病毒TMV的提取纯化摘取被侵染TMV的叶片5g，按3∶1(V/M)加入0.1M硼酸缓冲液pH7.0(0.1M硼酸，0.5mM EDTA，5mM 2-Me PH7.0)，研磨成匀浆，1000克离心20-30分钟，取上清液加入PEG(6000)和NaCl使终浓度分别是4%和1%，在4℃-6℃下搅拌3-4小时，10，000克下离心30分钟，将沉淀悬浮在1/4原体积1/15M的磷酸缓冲液中(PH7.0)7，000克下离心10-15分钟，取上清液重复PEG沉淀及差速离心，取上清液加到预铺好的CsCl上(预铺CsCl梯度10%，20%，30%，40%的CsCl，等体积依次加入)，RP-55T rotor，30，000rpm3小时，用注射器吸出TMV带，用无菌水稀释，再用35，000rpm离心1小时，沉淀溶于水中；2).TMV RNA的提取TMV(2mg/ml)加入2X蛋白酶K缓冲液，再加蛋白酶K使其终浓度达50μg/ml，37℃下保温30～40分钟，两次等体积苯酚-氯仿，除去乙醚，加入2.5倍体积的无水乙醇，在-70℃放置20-25分钟，取出13，000～14，000rpm离心20-25分钟，沉淀用1ml70%冷乙醇洗一次，13，000～14，000rpm离心10-12分钟，倾去液体，将沉淀抽干，然后加ddH2O50μl溶解；3).cDNA的合成A.合成PrimerTMV RNA上无polyA，因而逆转录合成cDNA的引物(Primer)需要人工合成，根据前人对TMV tomato stain的序列分析，设计合成了一般与已知序列3′端141-160碱基互补的序列；具体如下160141tomato stain RNA-ACGUGGUACGUACGAUAACG-Primer TGCACCATGCATGCTATAGC其中第143号碱基的改变造成了一个EcoRV的酶切位点；B.cDNA的合成a.第一链的合成RNA 1μg0.38μg/μl 5μlPrimer 0.5μg 0.3μg/μl 2μlddH2O 22μl煮沸1分钟，马上放在冰上Rnasin fou/μl 1μllst buffer 10x 5μlDTT 100mM 5μldNTDs 10mM5μlα-32P-dATP 10μg/μl(1.5μl释4μl) 2μlAMV RTase 9.5μ/μl 2μl44℃保温1小时，追加AMV RTase 9.5μ/μl，44℃保温1小时。b.第二链的合成dd氢 125μl2nd strand buffer 10x 23μlDTT100mM 23μlNTDs 1mM 7μlα-32P-dATP 10μci/μl(1.5μl释4μl) 2μlE.Coli DNA ligsae 1μ/μl 1μl16℃保温30分钟，加RNase H1.9μ/μl，16℃保温2小时；c.将CDNA补成平末端70℃加热10分钟，离心一下，放置在冰上；加入T2DNA poly-merase 9μ/μl 0.5μ/μgRNA，37℃保温30分钟，加入20μl 0.25MEDTA 1/2Vol 7.5M NH4AC 3倍体积乙醇，冰浴5～10分钟，离心13，000rpm离心30分钟，干燥沉淀，沉淀溶到20μl ddH2O中；d.对一链、二链处理5μl一链，30μl二链，分别进行，加入1/10体积0.25M EDTA，1/10体积2N NaOH，65℃保温1小时，加入1/2体积7.5M NH4AC 3倍体积乙醇，冰浴5～10分钟，离心13，000rpm离心30分钟，用80%冷乙醇洗，13，000rpm离心5分钟，干燥沉淀，溶于20μl碱性胶载样缓冲液中，点样前煮5～10分钟变性；C.碱性胶电泳，常规方法；D.cDNA连入BLUESCRIPT--sma I位点；E.将连接好的质粒转入E，ColiDH5株感受态细胞中；cDNA克隆的鉴定从经转化处理后的诸菌株中筛选cDNA插入克隆约100个，定名为pLcsN，并提取质粒。从cDNA克隆到Bluescript质粒中筛选获得不同大小的克隆分别编号为plcs23，plcs24，plcs72，plcs65，plcs64，plcs73，plcs26，plcs66，plcs44；4).病毒TMVcDNA序列的测定克隆中任意选了一株，名字是plcs72，其插入cDNA大小为1.8Kb左右。用kleuow方法对其进行序列测定；A.质粒的小量提取采用分子克隆上小量提质粒的方法，为适应测序要求的高纯度而略有变化，其一，第九步重复一次，以尽可能除去白色沉淀，其二，在苯酚-氯仿抽提前加入无DNA酶的RNA酶，终浓度为20μg/μl，37℃保温40～60分钟，其三，苯酚-氯仿以后，再用1倍体积氯仿∶异戌醇(24∶1)洗二次，其四，干燥后的沉淀溶于50μl TE(PH8.0)后，加入30μl120%PEG(6000，8000)-2.5MNaCl倒置混匀水浴60分钟(-70℃5--10分钟)12，000克离心15分钟，吸去上清，用1μl 70%冷乙醇洗沉淀离心抽干，将沉淀溶解在50μl TEPH8.0中；B.质粒的碱变性加5.5μl 2N NaOH，在室温下放置5分钟，再加20μl 50M NH4Ac混匀，加入27的无水乙醇，冰上保温60分钟(-70℃5μl)取出在12，000克下离心10分钟，用200μl，70%乙醇洗，离心后，抽干沉淀，沉淀溶于ddH2O中，使其浓度是0.5μg/μl左右；C.引物与模板的结合取6μl模板(～3μg)，加1.5μl 10×klenow buffer 3μl T7prmer 10μg/μg混匀，把Ependorf 管漂在一个250μl装满水的烧杯中，放入微波炉加热，待水开始胶，取出烧簿，使其在室温下自然降温，降到室温后，室温下离心进行下一步；D.Klenow测定DNA序列再加入4μlα-32P-dATP(或5μl-α35与-dATP及1.0～1.5μlKlenow(7μ/μl)混匀；再注有A、C、G、T四个硅化的Eppendorf管中加入3μl的dNTP 5ddNTP混合物，迅速加入刚混好的模板和酶的混合物3μl，37℃-40℃再保温30分钟，取出，分别加入1μl追加溶液37℃-40℃再保温30分钟，加入5μl反应停止液；E.序列胶采用8%聚丙烯 胺胶，0.4mm厚，成份丙烯胺 甲叉丙烯胺胶 尿素 10×TBE ddH2O 10%APT EMED7.6g0.4g 48g 10ml40ml 500μl 50μl放射自显影，序列测定结果如下(1)用plcs 72质粒，模板准备；依次 λdⅢ plcs72ds plcs72ds plcs72ds上样量 4μl 6μl 6μl 6μl(2)以自显影进行序列分析对plcs72的初步测定，获得如下结果，从胶上读出TATCG，ATAAG，CTTGG，ATATC，ATCGG，AATTC，CTGCA，GCCCG，TAATA，CATCA，CGACA，GAGGA，TGCAT，TGTGT，ATTAC，GATCC，CCTAA，AGTTG，ATCTC，GAAAC，TTGGT，(G)CTAAA，CACCA，TCAAG，GATTG，GGAAC，ACTTG，G，共136bp，其中polylinker39个，cDNA97bp；5).TMV外壳蛋白基因(CP基因)的获得已经确定TMVCP基因在3′端，CP基因长为500bp左右，cDNA合成由3′端开始，所以只要约800bp的cDNA就有可能取得需要的基因，经过酶切鉴定，选出plcs70和plcs26两个质粒，它们片段大小分别是900bp及1.1Kp，其中包括了CP基因；将CP基因转到土壤农杆菌Co24质粒；转入的方法有两种a.用双酶切出，定向连入Co24；用Bam HI和EcoR I切出cDNA，用Bg1 Ⅱ，EcoR I 切Co24，Bam H I与Bg1 Ⅱ同尾，很容易把含CP基因的片投定向转入Co24；b.用酶切出cDNA，用酶切开Co24后，用Klenow把所有片段补成平末端，连接筛选。由这种方法可以获得两个方向的插入；对plcs70使用方法a，对plcs26使用方法b；6).用上述5)中的TMV外壳蛋白基因转化烟草细胞的培养及选育出抗病毒TMV烟草菌株及菌液制备选用土壤农杆菌GV3111-SE(PTiH40)；挑取单菌落，在LB+Km50mg/l+Cm25mg/l+SPC100mg/l液体培养基中，200rpm，28℃培养24-36小时，至细菌处于对数生长期时，3000rpm离心10分钟，弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释5-20倍；稀释好的菌液用于转化；烟草材料取温室中新鲜的巴什马型香料烟(Oeiental tobocco)的烟草叶片，清水洗净；先放入75%乙醇中消毒30秒，再入10%次氯酸钠溶液中消毒8-10分钟，无菌水清洗三次；将表面消毒好的叶片剪成1平方米的叶块，用于转化；哺育细胞选用生产迅速的胡罗卜悬浮细胞系；植物培养基(1)T1，(用于细胞和叶片其培养)，MS培养基，3%蔗糖，1mg/l6-BA，0.1mg/l NAA，琼脂粉0.9%，PH=5.6-5.8，高压灭菌；(2)T2，(用于预培养)，T1培养基，500mg/l，苄青霉素(carb)；(3)T3，(用于筛选培养)，T1培养基，100mg/l km，500mg/lcarb；(4)T4，(用于生根)，MS培养基，100mg/l，500mg/l， carb；哺育细胞培养基B5培养基；细菌培养基LB培养基，附加不同种类和浓度的抗生素；转化步骤(全部在无菌条件下进行)将叶片放入制备好的菌液中，浸泡3-5分钟取出，在无菌滤纸上吸干表面菌液；T1培养基表面铺一层哺育细胞，其上覆盖一无菌滤纸，将1中已浸菌的叶块摆放在滤块上；28℃，黑暗中共培养48小时；将叶块转入T2培养基中，放置光下，25-28℃培养24小时；将叶块转入T3培养基中，光下25-28℃培养，约15天后叶块切口处有愈伤组织形成和芽点的分化；叶块继续在T3上培养基，每20天左右换一次新鲜培养基，约2-3个月后，芽可长成高3-5cm的小植株；切下较大的小植株，转T4培养基中，20天左右开始有根生成；继续培养40天左右，形成发达根系；从培养瓶中取出根系发达的植株，无菌水洗净琼脂，移入土壤中；开始2-3周将植株用罩子罩住，待植株健壮后，取下罩子，在温室中培养(这步不需在无菌条件)；至此，已获得转基因烟草植株。
2.根据权利要求1、1)中所述的方法，其特征是纯化病毒TMV紫外扫描的结果是A280/260＝0.82浓度1.103/3.1×1000/30＝12mg/ml。
3.根据权利要求1、2)中所述的方法，其特征是病毒TMV RNA提取的紫外扫描结果是A260/280＝2.2浓度＝0.22/25×100＝0.88mg/ml，RNA电泳结果6.4Kp。
4.根据权利要求1、3)中所述的方法，其特征是cDNA碱性胶放射自显影结果PA4。
5.根据权利要求1、4)中所述的方法，其特征是cDNA克隆到Bluescript质粒中筛选，筛选获得不同大小的克隆分别编号为plcs23，plcs24，plcs72，plcs65，plcs64，plcs73，plcs26，plcs66，plcs44。
6.根据权利要求1、5)中所述的方法，其特征是TMV cDNA测序1)用plcs72质粒，模板准备依次λdⅢ plcs72ds plcs72ds plcs72ds上样量4μl 6μl 6μl 6μl2)以自显影进行序列分析，对plcs72的初步测定，获得如下结果，从胶上读出TATCG，ATAAG，CTTGG，ATATC，ATCGG，AATTC，CTGCA，GCCCG，TAATA，CATCA，CGACA，GAGGA，TGCAT，TGTGT，ATTAC，GATCC，CCTAA，AGTTG，ATCTC，GAAAC，TTGGT，(G)CTAAA，CACCA，TCAAG，GATTG，GGAAC，ACTTG，G；
7.根据权利要求1、5)中所述的，其特征是经过酶切筛选，选出plcs70和plcs26，它们片段大小分别是900bp及1.1Kp，其中包括了CP基因;将CP基因转到土壤农杆菌Co24质粒，用单切点酶切方法从获得的16个克隆中选出第15号定名为plcs70-15，是含coat protein基因的Ti质粒;plcs26转入到土壤农杆菌Co24，plcs26用Bam H I和EcoR I切出cDNA，由Klenow变为平末端连入Co24，从获得69个克隆中，酶切鉴定，第32号含有CP基因定名为plcs26-3。
8.根据权利要求1、6)中所述的用TMV外壳蛋白基因转化烟草细胞的培养及选育出抗病毒TMV烟草的方法，其特征是用带有TMV-CP基因的土壤农杆菌Co24质粒转化香料烟草叶片经诱导愈伤组织，诱导再生苗等步骤，获得基因组中带有TMV-CP基因的烟草再生植株。
9.根据权利要求1、1)中所述的方法，其特征是转TMV还适用于对大叶烟、蕃茄、甜椒等作物。
全文摘要
一种用基因工程方法培养的抗病香料烟草是从感染烟草花叶病毒的叶片中提取TMV经CsCl梯度提纯，提取TMV RNA，逆转录成cDNA，对一个cDNA克隆plcs72的序列测定进一步由cDNA库中获得含外壳蛋白基因(coat protein genc，简写cp gene)片段并转入Ti质粒，获得特制Ti质粒，用特制Ti质粒浸染烟草叶片，用这些叶片进行组织培养，育成完全的基因工程抗TMV工程植株，经大田中试，化验评吸，确定为有生产前途的抗病毒基因工程香料烟草。
文档编号C12N5/04GK1112605SQ95102130
公开日1995年11月29日 申请日期1995年3月9日 优先权日1995年3月9日
发明者陈章良, 孙宝俊 申请人:北京大学