用人工转座子扩增基因的方法

专利名称：：用人工转座子扩增基因的方法
技术领域：
：本发明涉及用人工转座子扩增棒状杆菌染色体中的所需基因的方法，所述人工转座子在所述的棒状杆菌中是可转座的，本发明还涉及用本方法得到的棒状杆菌。若所需的基因是参于氨基酸或核酸的生物合成的基因，则用由此得到的棒状杆菌可以生产氨基酸或核酸。扩增染色体中的所需基因的方法，对于改进棒状杆菌的育种是很重要的，因为在氨基酸或核酸的工业化生产中要使用所述的棒状杆菌。到目前为止，过艰苦的努力，已经完成了改进棒状杆菌的育种和有效生产氨基酸或核酸的研究。已经报告了使用基因工程的许多育种方法。用质粒或噬菌体已经系统地开发了用于棒状杆菌育种的基因操作方法。例如使用原生质体转化之方法的建立(J.Bacteriol.，byKatsumataR.，OzakiA.，OkaT.andFuruyaA.，159，306-311，(1984)；andJ.Bacteriol，bySantamariaR.I.，GilJ.A.andMartinJ.F.，161，463-467(1985))，各种载体的研制(Agric.Biol.Chem.，byMiwaK.，MatsuiH.，TerabeM.，NakamoriS.，SanoK.andMomoseh，48，2901-2903(1984)；J.，Bacteriol.，byKatsumataR.，OzakiA.，OkaT.andFuruyaA.，159，306-311(1984)；J.Gen.Microbiol.，bySantamariaR.I.，GilJ.A.，MesasJ.M.andMartinJ.F.，130，2237-2246(1984)；Gene，byYehP.，OregliaJ.，PrevotosF.andScicardA.M.，47，301-306(1986)；andAppl.Microbiol.Biotechbol.，bypatekM.，NesveraJ.andHochmannovaJ.，31，65-69(1989))，控制基因表达方法的研究(Bio/Technology，bytsuchiyaM.andMorinagaY.，6，428-430(1988)，粘粒的研究[Gene，byNakamoriS.andSanoK.，39，281-286(1985)].在NucleicAcidsRes.，(MatsueK.，SanoK.andOhtsuboE.，14，10113-10114(1986))；J.Bacteriol(follettieM.T.andShinskeyA.H.，167，695-702(1986))，NuclercAcidsRes.，(MateosL.M.，DelR.G.，AguelarA.andMartinH.F.，15，10598(1987))；NuclercAcidsRes.，(MateosL.M.，DelR.G.，AuilarA.andmartinJ.F.，15，3922(1987))；NuclercAcidsRes.，(MelumbresM.，MateosL.M.，GuerreroC.andMartinJ.F.，16，9859(1988))；Agric.Biol.Chem.，(MatsuiK.，MiwaK.andSanoK.，52，525-531(1988))；Mol.Microbiol(byPeoplesO.P.，LieblW.，bodisM.，MaengP.J.，FollettieM.T.，ArcherJ.A.andSinskeyA.J.，2，63-72(1988))；Mol.Gen.Genet.，(byEikamannsB.J.，FollettieM.T.，GriotM.U.，Martinu.andShinskeyA.J.，218，330-339(1989)；和Gene(byO′ReganM.，ThierbachG.，BachmannB.，VgillevalD.，LepageP.，ViretJ.F.andLemoineY.，77，237-251(1989))中报告了得自棒状杆菌的基因的克隆。在Agric.Biol.Chem.，(by/sanoK.，MiwaK.andNakamoriS.，51，597-599(1987))中报告了各种氨基酸产率的增加。最近，报告了棒状杆菌的转座因子[WO92/02627；WO93/18151；EP0445385；日本特许公开专利申请(下文称为″日本Kokai″)No.46，867/1994；Mol.Microbiol.byVertesA.A.，InuiM.，KobayashiM.，KurusrY.andYukawaH.，11，739-746(1994)；Mol.Microbiol.，byBonamyC.，LabarreJ.，reyerO.andLeblonG.，14，571-581(1994)；Mol.gen.Genet.，byVertesA.a.，AsaiY.，InuiM.，KobayashiM.，KurusrY.andYukawaH.，245，397-405(1994)；FRMSMicrobiologyLetters，byJagarW.，SchaferA.，KalinowkiJ.andPuehlerA.，126，1-6；(1995)；和日本KokaiNo.107，976/1995]。转座因子是可在染色体中转座的DNA片段，而且已知这种转座因子广泛地存在于包括原核生物和真核生物的各种生物中。已经得到了有关真核生物，例如玉米，果蝇，酵母等，以及原核生物，例如大肠杆菌等的详细知识[MobileDNA，AmericanSocietyforMicrobiology，WashingtonD.C(1989)]。细菌的转座因子被分成两类，即插入序列和转座子。插入序列是大小约为760-2000bp的DNA片段，在其两个末端均有约8-20bp的反向重复序列，而且编码转座酶，即在其中转座所必需的酶。而转座子是含有反向重复序列和转座酶以及不直接参与转座过程的基因，例如药物抗性基因的转座因子。转座子通常包括一个位于两个插入序列之间的药物抗性基因，和一个插入在插入序列中的药物抗性基因。插入序列和转座子的特征均在于在导入于插入序列或转座子的靶基因位点中观察到约10bp核苷酸序列的复制[MobileGeneticElements，AcademicPress，NewYork，pp.159-221(1983)]。目前已知的转座因子包括大肠杆菌和Mu噬菌体转座子Tn10和Tn5，它们在染色体基因工程中是非常有用的。例如，认为(1)将转座子转座到染色体基因中，从而破坏了所述的基因，抑制了该染色体基因的表达，(2)将启动子序列插入到转座子中以表达在插入位点存在的染色体基因，和(3)将异源所需基因或同源所需基因包含在用于转座的转座子中以便将新基因导入到染色体中[MobileDNA，AmericanSocietyforMicrobiolgy，WashingtonS.C.pp.879-925(1989)]。最近已在棒状杆菌中发现了作为插入序列的转座因子，但尚未发现作为含有药物抗性基因等转座子的转座因子。已经可能生产其中人工插入有卡那霉素抗性基因的转座子[WO93/18151；JapaneseKokaiNo.107，976/1995；andMol.Gen.Genet.，byVertesA.A.，AsaiY.，InuiM.，KobayashiM.，KurusuY.andYukawaH，245，397-405(1994)]，并且将所述的转座子转座到染色体中。其中生产的人工转座子包括一个插入在两个插入序列之间的药物抗性基因(WO93/18151)和一个插入在插入序列中的药物抗性基因[JapaneseKokaiNo.107，976/1995；andMol.Gen.Genet.，byVertesA.A.，asaiY.，InuiM.，KobayashiM.，KurusuY.andYukawaH.，245，397-405(1994)]。通过多拷贝所述的人工转座子而进行的转座并未观察到，或者说拷贝数的增加不能令人满意。因此，目前尚未确立用在氨基酸或核酸工业化生产中有用的这种转座子来扩增基因的技术。本发明的一个目的是提供一种方法，包括在棒状杆菌插入序列的基础上形成含有药物抗性基因和所需有用基因的人工转座子，用上述的人工转座子在工业化生产氨基酸或核酸所用的棒状杆菌的染色体中扩增所需的基因。本发明的另一目的是提供所需的有用基因在染色体中扩增的棒状杆菌。本发明的另一目的是提供利用棒状杆菌生产物质的方法，在所述的棒状杆菌中所需的有用基因在染色体中扩增。为了解决上述问题，本发明申请人注意到可以转座大肠杆菌等的已知转座子，具有不参与转座过程的药物抗性基因的结构被插入到在其两个末端均有插入序列的反向重复序列之间。本发明人人工构建了各种不同的转座子样序列，所述序列有这样一种结构，即不参与转座过程的药物抗性基因和所需基因被插入到插入序列两端的反向重复序列之间，所述的插入序列来自棒状杆菌的染色体DNA，而且已努力完成这些研究。结果，转座子样序列(人工转座子)以良好的效率被转座，而且适当选择药物抗性基因并确定药物浓度，可以以良好的效率形成扩增基因的微生物，在所述的微生物中，多拷贝的人工转座子被转座到其染色体中。这些发现导致了本发明的完成。即本发明如下1导入并在染色体上扩增所需基因的方法，包括形成人工转座，所述人工转座含有在反向重复系列之间插入了药物抗性基因和所需的基因的结构并且在棒状杆菌细胞内是可转座的，将所述的人工转座子转入棒状杆菌细胞，将所述转座子转座到所述棒状杆菌的染色体中。2发明1的方法，其中，所述人工转座子还有一个转座酶位于反向重复序列之间的结构。3发明1或2的方法，其中所述反向重复序列和转座酶基因来自棒状杆菌的插入序列。4发明3的方法，其中所述插入序列含有序列表中SequcenceNos.1、5或9的任一个所代表的碱基序列。5发明1-4的任一方法，其中药物抗性基因是氯霉素抗性基因或四环素抗性基因。6发明1-5的任一方法，其中所需的基因是参与氨基酸生物合成的基因。7发明6的方法，其中所需的基因是天冬氨酸激酶基因和/或二氢吡啶羧酸合成酶基因。8棒状杆菌，是通过将所需基因用发明1-7中的任一方法转座到染色体中而形成的。9生产氨基酸的方法，包括培养用发明6的方法将参与氨基酸生物合成的基因转座到染色体中而形成的棒状杆菌，以便在培养基中形成并积累氨基酸，然后回收所述的氨基酸。10发明9的方法，其中参与氨基酸生物合成的基因是天冬氨酸激酶基因和/或二氢吡啶羧酸合成酶基因，所述氨基酸是赖氨酸。本发明中所述的反向重复序列可能是存在于从棒状杆菌分离的转座因子的两个末端的反向重复序列。作为得自棒状杆菌的转座因子的实例，在序列表中1，5和9所列的插入序列是已知的(WO93/18151)。在序列1中的插入序列IS714在5′端含有序列3的序列，在反向链的5′端含有序列4的序列，从而形成了反向重复序列。在序列5中的插入序列IS719在5′端含有序列7的序列，在反向链的5′端含有序列8的序列，从而形成了反向重复序列。通过在5′端和反向链的5′端均加入选自序列3，4，7和8的一种序列，可以形成反向重复序列。通过在5′端和反向链的5′端均加入选自序列3，4，7和8的两种序列，可以形成反向重复序列。在序列9中的插入序列IS903在5′端含有序列10的序列，在反向链的5′端含有序列11的序列，从而形成了反向重复序列。通过在5′端和反向链的5′端均加入选自序列10和11的一种序列，可以形成反向重复序列。通过在5′端和反向链的5′端均加入选自序列10和11的两种序列，可以形成反向重复序列。用除序列3，4，7，8，10和11所列序列外，可以在转座因子中起作用的任何其它序列，也可以形成本发明的反向重复序列。被插入插入序列中的药物抗性基因包括卡那霉素抗性基因，氯霉素抗性基因和四环素抗性基因以及对各种药物有抗性的基因，例如氨苄青霉素抗性基因，氨甲蝶呤抗性基因等。药物抗性程度和药物抗性基因的拷贝数之间有关系的药物抗性基因是优选的。由于要扩增所需的基因，因此，可以使用参与各种氨基酸和核酸生物合成的基因。其实例包括用于谷氨酸生物合成的谷氨酸脱氢酶基因，用于谷氨酰胺生物合成的谷氨酰胺合成酶基因，用于赖氨酸生物合成的天冬氨酸激酶基因(下文称天冬氨酸激酶为″AK″，如果需要，编码AK蛋白质的基因在下文中被称为″lysC″)，二氢二吡啶羧酸盐合成酶基因(下文将二氢二吡啶羧酸盐合成酶称为″DDPS″，如果需要，编码DDPS蛋白质的基因在下文中被称为″dapA″)，二氢二吡啶羧酸盐还原酶基因(下文将二氢二吡啶羧酸盐还原酶称为″DDPR″，如果需要，编码DDPR蛋白质的基因在下文中被称为″dapB″)，二氨基庚二酸脱羧酶基因(下文将二氨基庚二酸脱羧酶称为″DDC″，如果需要，编码DDC蛋白质的基因在下文中被称为″lysA″)，和二氨基庚二酸脱氢酶基因(下文将二氨基庚二酸脱氢酶称为″DDH″，如果需要，编码DDH蛋白质的基因在下文中被称为″ddh″)，用于苏氨酸生物合成的同丝氨酸脱氢酶基因，用于异亮氨酸或缬氨酸生物合成的acetohydroxyacid合成酶基因，用于亮氨酸生物合成的2-异丙基苹果酸合成酶基因，用于脯氨酸或精氨酸生物合成的谷氨酸激酶基因，用于组氨酸生物合成的磷酸核糖-ATP焦磷酸化酶基因，用于芳香族氨基酸，例如色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸生物合成的脱氧阿拉伯庚糖醛酸磷酸(DAHP)合成酶基因，用于核酸，例如肌苷酸和鸟苷酸生物合成磷酸核糖焦磷酸(PRPP)酰氨基转移酶基因，肌苷鸟苷激酶基因，肌苷酸(IMP)脱氢酶基因和鸟苷酸(GMP)合成酶基因。此外，也可以使用编码生理学活性蛋白质例如白介素2，白介素6等的基因。按Bergey′sManualofDeterminativeBacteriology，8thed.，p.599(1974)中的描述，本发明中涉及的棒状杆菌包括需氧革兰氏阳性杆菌，分为棒状杆菌属的细菌，曾经分到短杆菌属中，但现在分到棒状杆菌属中的细菌[Int.j.Syst.Bacteriol.，41，255(1981)]，很接近棒状杆菌属的短杆菌属的细菌，和微杆菌属的细菌。总的来讲，在棒状细菌中包括下列已知作为L-谷氨酸-生产菌的微生物。嗜乙酰乙酸棒状杆菌醋各棒状杆菌颈棒状杆菌谷氨酸棒状杆菌百合棒状杆菌(谷氨酸棒状杆菌)栖糖蜜棒状杆菌扩展短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)不嗜海水短杆菌乳酸发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)玫瑰色短杆菌解糖短杆菌生硫短杆菌产氨短杆菌(产氨棒状杆菌)MicrobacteriumammoniaphilumCorynebacteriumthermoaninogenes具体地，提到下列野生型和从其得到的突变菌株。嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870醋谷棒状杆菌ATCC15806颈棒状杆菌ATCC15991谷氨酸棒状杆菌ATCC13020百合棒状杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC15990栖糖蜜棒状杆菌ATCC17965扩展短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC14020黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC14067不嗜海水短杆菌ATCC14068乳酸发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC13869玫瑰色短杆菌ATCC13825解糖短杆菌ATCC14066生硫短杆菌ATCC19240产氨短杆菌(产氨棒状杆菌)ATCC6871MicrobacteriumammoniaphilumATCC15354CorynebacteriumthermoaninogenesAJl2340(FERMBP-1539)本发明的人工转座子含有在反向重复序列之间插入了药物抗性基因和所需基因的结构，而且具有在棒状细菌中转座的能力。本发明的转座酶是例如具有序列表中序列2或6所列的核苷酸序列的转座酶。然而本发明的转座酶还包括在上述序列中有一个或两个以上氨基酸残基缺失，插入，增加，取代或倒位，但只要还具有转座酶活性的转座酶。本发明的转座酶基因具有例如含有序列1核苷酸序列中第130-1437的序列，或含有序列5核苷酸序列中第130-1437的序列。但是本发明的转座酶基因还包括在上述序列中有一个或两个以上氨基酸残基缺失，插入，增加，取代或倒位，但只要所述基因产物具有转座酶活性的转座酶。可以将转座酶基因放在人工转座子内。即，将转座子基因放在反向重复序列之间，而且放在不会影响药物抗性基因和所需基因的功能的位置。可以将转座酶基因放在人工转座子外。可以在一个质粒上用含有人工转座子的质粒携带转座酶基因。也可以用两个质粒，一个含有人工转座子，另一个质粒携带转座子基因。转座子基因可以在染色体上存在。以转座因子为起始材料，可以很容易地构建本发明的人工转座子。在本发明中，可以使用任何插入序列，只要它存在于上述棒状杆菌的染色体中，大小为约760-2000bp，有约8-20bp的反向重复序列，并且其中编码转座所需的转座酶。按照WO93/18151中公开的方法，可以得到所述的插入序列。即，可以经下列方法得到含有插入序列的DNA片段(1)将质粒pEC701导入棒状细菌进行转化，(2)用卡那霉素抗性为标记筛选用pEC701转化的菌株，(3)在含有异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)的琼脂平板上涂布含有质粒pEC701的棒状细菌，然后筛选由此生长的菌株，(4)分析所筛选的菌株所含的质粒中氯霉素乙酰基转移酶基因的调节基因区或结构基因区，和(5)找到在该基因中的插入的序列。另外，可以经下列方法得到上述的DNA片段(1)将质粒pEC901导入棒状细菌进行转化，(2)用卡那霉素抗性作为标记筛选用pEC901转化的菌株，(3)在30℃培养含有pEC901的棒状细菌，甚至在30℃筛选表达氯霉素抗性的菌株，(4)分析所选菌株所含的质粒中的cI阻遏基因，和(5)找到在该基因中的插入序列。棒状细菌插入序列的实例包括由序列表中的SequenceNos.1，5和9，即IS714，IS719和IS903所代表的三种插入序列。这些核苷酸序列不必是严格的，在构建人工转座子时，可以使用包括反向重复序列的插入序列，只要它可以作为插入序列，在所述的反向重复系列中，部分碱基被其他碱基取代或缺失，或者新的系列被插入或加人在这些插入序列的基础上可以构建各种人工转座子。这些人工转座子的结构示于图1。其中本发明所用的人工转座子含有所扩增的药物抗性基因和所需基因被插入到插入序列中的结构。在示于序列1的IS714中，限制性酶NheI位点位于37-42。由于在该位置的插入并不会影响反向重复系列和转座酶的功能，因此该位置适于插入待扩增的药物抗性基因和所需的基因。在示于序列5的IS719中，限制性酶NheI位点位于37-42。由于在该位置的插入并不会影响反向重复系列和转座酶的功能，因此该位置适于插入待扩增的药物抗性基因和所需的基因。在示于序列9的IS903中，限制性酶XcmI位点位于34-48。由于在该位置的插入并不会影响反向重复系列和转座酶的功能，因此该位置适于插入待扩增的药物抗性基因和所需的基因。下文将以IS714为例，描述构建其中插入有药物，例如卡那霉素(新霉素)，氯霉素或四环素抗性基因的人工转座子的方法，以及构建其中插入了药物抗性基因和用于生产氨基酸或核酸(如天冬氨酸激酶)的所需基因的人工转座子的方法。IS714的核苷酸序列示于序列表中的SeqenceNo.1。(1)构建含有卡那霉素抗性基因的人工转座子用限制性内切核酸酶PvuII和EcoRI裂解含有IS714序列的质粒pEC701-IS14，IS714是乳酸发酵短杆菌AJ12036(FERMBP-734)的插入序列，所述乳酸发酵短杆菌AJ12036(FERMBP-734)是棒状细菌的野生型菌株(见WO93/18151)。同时，将含有IS714的片段插入到质粒pHSC4的限制性内切核酸酶SalI位点以构建质粒pHIS714，所述的质粒pHSC4含有得自棒状细菌(日本KokaiNo.7，491/1993)的温度敏感型复制起点。将上述所得的含IS714的1.6kb片段插入到pHIS714的SmaI位点。因此，按图2构建了含有相反方向的IS714的质粒pHTN7141和pHTN7142。然后用限制性内切核酸酶PvuII型解pHTN7141和pHTN7142，以便切出含有IS714和pHSC4温度敏感型复制起点序列的这两个序列的片段。同时，质粒载体pHSG298(由TakaraShuzo制造)还含有两个限制性内切核酸酶PvuII位点。通过用限制性内切核酸酶PvuII裂解该质粒载体可以得到含有新霉素磷酸转移酶基因(卡那霉素抗性基因)的2.3kb片段。用限制性内切核酸酶PvuII裂解pHTN7141和pHSG298，然后连接所得的片段以转化乳酸发酵短杆菌AJ12036。如图3所示，从具有卡那霉素抗性的菌株得到质粒pHTN7143。如图4所示，用上述方法，从质粒pHTN7142和pHSG298得到质粒pHTN7144。pHTN7143和pHTN7144含有新霉素磷酸转移酶基因位于两个IS714系列之间的结构。如图5所示，用上述方法从质粒pHIS714构建质粒pHIS714K1和pHIS714K2，pHSG298作为对照质粒。在pHIS714K1和pHIS714K2中，含有新霉素磷酸转移酶基因的插入片段的方向彼此相反。为了使人工转座子最小化，构建了其中将新霉素磷酸转移酶基因插入到一个IS714中的人工转座子。在IS714中，限制性内切核酸酶NheI位点位于转座子功能不受干扰的位置。用限制性内切核酸酶NheI裂解质粒pHIS714，然后平截其末端。另一方面，用限制性内切核酸酶PstI从质粒pUC4K(由PharmaciaBiotech制造)切出新霉素磷酸转移酶基因区。按图6所示，连接两个片段以得到所需的质粒pHTN7145。(2)构建含有氯霉素抗性基因的人工转座子用限制性内切核酸酶AccII裂解质粒载体pHSG398(由TakaraShuzo制造)得到含有氯霉素酰基转移酶基因的约1.1kb的片段。然后将所述的AccII片段插入到pUC18(由TakaraShuzo制造)的SmaI位点，克隆由此所得的质粒。筛选所得的克隆以得到质粒pUC18-CM。此外，在上述构建的pHIS714K2中，平截位于不影响转座酶功能的位置的IS714的限制性内切核酸酶NheI的位点。将用EcoRI和HindIII从pUC18-CM切出的含氯霉素乙酰基转移酶基因的约1.1kb片段与pHIS714K2的限制性内切核酸酶NheI平端位点相连，以转化大肠杆菌，然后筛选其中插入了氯霉素乙酰基转移酶基因片段的克隆。按图7所示，从所得的克隆可以得到所需的质粒pHTN7151。(3)构建含四环素抗性基因的人工转座子用限制性内切核酸酶EcoRI和AvaI裂解质粒载体pBR322(由TakaraShuzo制造)可以得到含有四环素抗性基因的约1.4kb片段。在上述构建的pHIS714K2中，平截位于不影响转座酶功能的位置的IS714的限制性内切核酸酶NheI位点。将上述形成的DNA片段与该限制性内切核酸酶NheI平端位点相连，以转化大肠杆菌，然后筛选其中插入了四环素抗性基因片段的克隆。按图8所示从所得的克隆可以得到所需的质粒pHTN7152。(4)将赖氨酸生物合成基因之一的天冬氨酸激酶基因插入到含有四环素抗性基因的人工转座子中由于图8中构建的pHTN7152没有适于天冬氨酸激酶基因插入的适宜的限制性内切核酸酶位点，按如下构建新导入一个插入位点的pHTN7156。用限制性内切核酸酶EcoRI和AvaI裂解质粒载体pBR322(由TakaraShuzo制造)可以得到含有四环素抗性基因的约1.4kb片段。将该片段与经用限制性内切核酸酶SmaI裂解质粒载体pHY300PLK(由TakaraShuzo制造)而得到的片段相连以转化大肠杆菌，然后筛选其中插入了四环素抗性基因片段的克隆。从所得的克隆得到质粒pHY300-TC。此外，在上述构建的pHIS714K2中，平截位于不影响转座酶功能之位置的IS714的限制性内切核酸酶NheI位点。将经用限制性内切核酸酶EcoRI和XbaI裂解pHY300-TC而得到的含有四环素抗性基因的片段与该限制性内切核酸酶NheI平端位点相连以转化大肠杆菌，筛选其中插入了四环素抗性基因的克隆。按图9所示从所得的克隆得到所需的质粒pHTN7156。随后，将赖氨酸生物合成基因之一的天冬氨酸激酶基因按如下所述插入到质粒pHTN7156中。用限制性内切核酸酶BamHI裂解质粒p399AK9B，该质粒含有天冬氨酸激酶基因，所述基因得自棒状细菌乳酸发酵短杆菌的赖氨酸-生产突变体，并经过了脱敏，从而同时抑制赖氨酸和苏氨酸(参见WO94/25605)，然后自身连接以构建pHSG399AK，但从中除去了在棒状细菌中起作用的复制起点。用限制性内切核酸酶EcoRI和SphI裂解pHSG399AK以得到约1.7kb的天冬氨酸激酶基因片段。将该片段插入到质粒pHTN7156的限制性内切核酸酶Bg1II平端位点以便按图9所示构建质粒pHTN7156-C，质粒pHTN7156含有携带四环素抗性基因的人工转座子。(5)构建含有四环素抗性基因，但在转座子单元中没有转座酶的人工转座子用限制性内切核酸酶NheI和XbaI裂解质粒pHIS714以得到含有编码转座酶基因的片段。将所述的DNA片段导入质粒载体pUC19的XbaI位点以构建质粒TnpL/pUC19。然后，用限制性内切核酸酶MroI和XbaI裂解TnpL/pUC19以缺失含有IS714终止密码子和3′反向重复(IR)的序列。将被设计用来再导入终止密码子的合成的双链DNA经连接插入到上述的裂解部分。用所述的方法，得到未插入反向重复序列之间的转座酶基因。随后，用限制性内切核酸酶SmaI和XbaI裂解所述的ORFL/pUC19以得到含有转座酶的约1.5kb的基因片段。将该转座酶基因片段插入到通过除去其SmaI和XbaI位点之间的序列而得到的质粒载体pHY300PLK部分，然后用限制性内切核酸酶EcoRI和KpnI切割。EcoRI和KpnI片段是平整末端。同时，用限制性内切核酸酶PvuII部分消化质粒载体pHSG398以缺失含有多克隆位点的片段，然后与上述得到的转座酶基因片段相连。由此构建质粒pORF1(图10)。另一方面，得到含有转座酶基因的质粒pHIS714的NheI-XbaI裂解片段，使其末端平整，然后转入质粒载体pUC19的末端钝化的PstI位点以构建质粒Tnp(Pst)/puc19。用U.S.E.Mutagensis试剂盒(PharmaciaBiotech)使所述Tnp(Pst)/pUC19的转座酶基因经部分碱基取代。被取代的碱基是IS714序列中第288位上的G。用C取代所述的碱基G。经碱基取代的质粒称为Tnp(Pst)M/pUC19。Tnp(Pst)M/pUC19的结构示于图11中。*表示导入的突变。用各种系统控制转座因子的转座。所述控制的实例包括下列系统(MobileDNA，AmericanSocietyforMicrobiology，WashingtolnD.C.(1989))。(1)在转座因子内与转座酶基因邻接的转座酶抑制基因或阻遏基因(例如Tn3)。(2)在一个框架内存在两个ORF。一个靠近3′末端编码区。在两个ORF之间的转译移框的发生频率很低，从而使得表达转座酶的两个ORF被完全转译，(例如IS1)。(3)在编码转座酶的ORF中存在另一个转译起始密码子(ATG，GTG)，而且转译从所述的密码子开始以表达抑制剂(例如Tn5(IS50))。同时，在IS714中存在一个几乎相当于全长IS714的ORF，但未发现另一个ORF。这表明可能是IS714含有编码转座酶样Tn5的ORF，而抑制剂是从所述ORF中的另一个起始密码子开始转译的。寻查启动子样序列的结果表明从286-288的序列GTG可能是抑制剂的起始密码子。设计在质粒Tnp(Pst)M/pUC19上导入的突变，使其不会引发抑制剂的转译。从pORF1中缺失在转座酶前一半基因中限制性内切核酸酶SmaI和NaeI位点之间的序列。将用限制性内切核酸酶SmaI和NaeI裂解Tnp(Pst)M/pUC19而得到的转座酶前一半基因片段插入到上述缺失的部分，通过连接构建pORF2。从pORF2缺失SmaI和XbaI位点之间的序列，使所得的片段末端钝化。用限制性内切核酸酶NaeI和HindIII裂解pBSF2-SD7得到含有色氨酸操纵子弱化子的DNA片段，然后使之成为平端，将前一个片段与后一个片段相连。由此构建的质粒称为pORF3。用限制性内切核酸酶SalI和Bpu1102I裂解pORF3以缺失转座酶的前半段基因片段。将用限制性内切核酸酶SalI和Bpu1102I裂解Tnp(Pst)/pUC19而得到的转座酶前半段基因片段插入到上述缺失的部分，连接后构建图11所示的pORF4。用SacI裂解TnpL/pUC19，然后用BAL31核酸酶于30℃消化20分钟以便从上游侧缺失靠近转座酶基因起始密码子的序列。此后，用SphI位点切出转座酶基因片段，然后与用SmaI和SphI裂解的pHSG398相连。由此构建的质粒称为delTnp5/398。用限制性内切核酸酶KnpI和HindIII裂解delTnp5/398，然后使转座酶前半段基因片段成为平端。然后，用NcoI和HindIII裂解质粒载体pKK233-2(由PharmaciaBiotech制备)，使之成为平端。将前一个片段与后一个片段相连以构建pTrc-ORF。用SspI和Bpu1102I裂解pTrc-ORF以形成含有Trc启动子和转座酶前半段基因的片段。用XbaI裂解pORF3，使之成为平端，然后再用Bpu1102I裂解以缺失转座酶前半段基因片段。将上述形成的片段与所缺失的pORF3相连以便如图12所示构建pORF7。将用限制性内切核酸酶KpnI和HindIII裂解delTnp5/39而得到的转座酶前半段基因片段克隆到质粒载体pUC18的KpnI和HindIII之间。缺失所述质粒delTnp5/18的BsmI和NaeI位点之间部分，将该片段与通过用限制性内切核酸酶BsmI和NaeI裂解Tnp(Pst)M/pUC19而得到的转座酶前半段基因片段相连以构建delTnp5M/18。用KpnI和HindIII裂解delTnp5M/18，使所得的转座酶前半段基因片段成为平端。用NcoI和HindIII裂解pKK233-2，使所得的片段成为平端。将这些片段彼此相连以构建pTrc-TnpM。通过用从pTrc-Tnp构建pORF7相同的方法，从pTrc-TnpM和ORF3构建pORF8(图13)。用上述质粒pORF3，pORF4，pORF7和pORF8构建导入到棒状细菌中的质粒。下面描述从pORF3构建pORF41。首先，用NheI和SacII裂解pHIS714以缺失转座酶基因的主要部分。将被设计的以导入克隆位点的双链合成DNA插入到上述缺失的部分以构建pHTN7160。用限制性内切核酸酶KpnI裂解pHTN7160，使之成为平端，然后再用BglI裂解以得到含有IS714两端的反向重复(IR)序列和在棒状细菌中起作用的温度敏感型复制起点的片段。用限制性内切核酸酶EarI裂解pORF3，使之成为平端，然后再用BglI裂解。将pHTN7160的上述片段插入其中，以构建pORF41-pre。用EcoRV裂解位于IS714两个末端IR之间的pORF41-pre。使含有pBR322的Tc抗性基因的EcoRI-AvaI片段成为平端，与EcoRV-裂解的片段连接以便按图14所示构建pORF41。重复上述方法，以便从pORF4经pORF31-pre，从pORF7经pORF71-pre，从pORF8经pORF81-pre分别构建pORF31，pORF71，pORF81。用XbaI和EarI裂解pORF3，使之成为平端，然后自身连接以构建不含转座酶基因的pORFCO(图15)。用相同于从pORF3构建pORF41的方法，从pORFCO经pORFC2-pre构建pORFC2。这些最终构建的质粒含有转座酶的结构基因，Cm抗性基因，在大肠杆菌中起作用的复制起点，在棒状细菌中起作用的温度敏感型复制起点，位于IS714的IR之间的Tc抗性基因，使得pORFC2不含有转座酶的结构基因。含有IS714两个末端上的IR和Tc抗性基因的单元被称为转座子单元Tn7162。IS714本身或上述Tn7152等具有在一个可转座的区域内转座酶结构基因，而Tn7162的特征在于在可转座的区域内没有转座酶的结构基因。认为Tn7162是通过由位于该单元外并在携带Tn7162的载体上的转座子基因表达的转座子而转座的(图16)。或者认为，由染色体上的转座酶基因表达的转座酶来转座Tn7162。其次，说明如何构建用于棒状细菌，含有转座酶基因，但没有转座子单元的质粒。用EcoO109I和MroI裂解质粒pHIS714K1以缺失IS714，然后将其自身连接以构建pHIS714Kdel。同时，用限制性内切核酸酶EarI裂解pORF3，使之成为平端，然后，再用BglI裂解。用限制性内切核酸酶KpnI裂解pHIS714Kdel，使之成为平端，然后再用BglI裂解以形成含有在棒状细菌中起作用的温度敏感型复制起点的片段。将由此形成的片段彼此连接，以便按图17所示构建pORF40。重量所述的方法，以便从pORF4，pORF7，pORF8和pORFCO分别构建pORF30，pORF70，pORF80，pORFC1。就棒状细菌的插入序列，例如IS719和IS903而言，它们含有由序列表中序列5和9所代表的序列，而且不同于上述的IS714，通过将药物抗性基因。例如氯霉素抗性基因和四环素抗性基因以及所需的基因，例如天冬氨酸激酶基因插入到插入序列中转座酶基因的调节基因区和结构基因区外的适宜限制性内切核酸酶位点，可以构建人工转座子。若在转座酶基因的调节基因区和结构基因区外，没有适宜的限制性内切核酸酶位点，则在不抑制转座酶功能的区域，通过利用聚合酶链反应(PCR)的部分特异性碱基突变，经修饰插入序列，或者用合成DNA寡核苷酸(衔接子)进行基因插入，可以首先制备适宜的限制性内切核酸酶位点。将由此构建的人工座子通过适当的载体，例如质粒导入宿主棒状细菌中。对含有人工转座子的质粒没有特别限定。通常使用来自棒状细菌的质粒。质粒的实例包括pHM1519[Agric.Biol.chem.，48，2901-2903(1984)]，AM330[Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984)]，和通过改进上述质粒而得到的含有药物抗性基因的质粒。为了以良好的效率扩增导入到染色体中的人工转座子，推荐使用在(1)中提到的含有温度敏感型复制起点的质粒(参见日本KokaiNo.7，491/1993)。用原生质体方法[Gene，39，281-286(1985)]或电穿孔方法[Bio/Technology，7，1067-1070(1989)]可以将含有人工转座子的质粒导入到棒状细菌中。用构建的质粒，通过转化棒状细菌，在25℃温育转化体，在所述的温度，可以复制质粒以扩增含人工转座子的质粒达到每细胞数百拷贝，并导入到染色体中，再在34℃下保温以除去额外的质粒，这样通过温度敏感型质粒即可将人工转座子导入到棒状细菌的染色体中。用所述的方法，可以以良好的效率完成基因在染色体中的扩增。可以用正常质粒代替温度敏感型质粒。但是，在许多情况下，在将人工转座子导入到染色体中后，很难除去额外的质粒。此外，还有一种方法，只用人工转座子的DNA片段或不能在棒状细菌中复制的质粒载体(例如，在大肠杆菌中复制的质粒载体)，而将人工转座子导入到棒状细菌中[JapaneseKokaiNo.107，976/1955；andMol.Gen.Genet.，byWertesA.A.，AsaiY.，InuiM.，KobausshiM.，KurusuY.andYukawaH.，245，397-405(1994)]。然而，用该方法不能在转化后的宿主菌株中扩增DNA片段，而且转座到宿主染色体中的效率很差。用与所需基因一起导入的药物抗性基因的药物抗性程度，来筛选所需基因被导入染色体中的菌株或在染色体中扩增的所需基因的菌株。所用的药物抗性基因包括卡那霉素抗性基因，氯霉素抗性基因，四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因，氨甲蝶呤抗性基因等。抗性程度与药物抗性基因的拷贝数相关的药物抗性基因是最优选的。即，从存在高浓度药物的情况下可以生长的克隆可以达到所需基因在染色体中扩增的菌株。用含有药物抗性基因。例如四环素抗性基因等和所需基因，例如脱敏的天冬氨酸激酶基因等的质粒(例如pHTN7156-C)转化棒状细菌，并且人工转座子被转座到宿主染色体中后，可以用下列方法评估转座后在染色体中形成的转座拷贝数。在25℃，于含适当浓度(用Tc时，从1-20μg/ml)药物，例如四环素(Tc)等，10g/L酵母提取物，10g/L胰胨，5g/L葡萄糖和5g/LNaCl的CM2G液体培养基中，将转化子温育过夜。用0.9％NaCl溶液适当稀释培养液，然后以100μl的量涂布在含适当浓度药物的CM2G琼脂培养基上。将所得的培养物在34℃温育。从形成的许多克隆中随机筛选数个克隆。制备染色体DNA，用包括PvuII的不同限制性内切核酸酶完全消化，然后经琼脂糖凝胶电泳。在硝酸纤维素，尼龙或聚偏氟乙烯(PVDF)滤纸上印迹片段。用32P-标记的四环素抗性基因片段作为探针，使所述滤纸经Southern杂交，以检测与该探针杂交的带的数目。用常规使用的方法和条件可以温育所需基因在由此得到的染色体中扩增的转化子。温育所用的培养基是含有碳源，氮源，无机离子等的常规培养基。可以按需要加入有机微量营养物质，例如维生素，氨基酸等。碳源的实例包括碳水化合物，例如葡萄糖和蔗糖，有机酸，例如乙酸，和醇例如乙醇。氮源的实例包括氨气，液氨，胺盐。无机离子的实例包括镁离子，磷酸离子，钾离子和铁离子。根据需要使用这些物质。需氧培养1-7天，同时将pH的范围控制在5.0-8.5，温度控制在15℃-37℃。用人工转座子扩增基因，其结果是生产有用物质的效率得到提高，并且在培养菌株内或外生产并积累所需的物质。用已知方法，可以从培养液中收集所需的物质。实施例参考下列实施例将更详细地说明本发明。实施例1用IS714构建含有卡那霉素抗性基因的人工转座子用限制性内切核酸酶PvuII和EcoRI裂解含有IS714的序列的质粒pEC701-IS14以得到含IS714的1.6kb片段，所述的IS714的序列是棒状细菌的插入序列。含质粒pEC701-IS14的乳酸发酵短杆菌于1992年3月10日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3，HigashilChomeTsukuba-shiIbaraki-Ken305，Japan)，保藏号为No.FERMP-12863，然后于1993年3月9日转变为根据布达佩斯条约的保藏证书。保藏号为BP-4232。同时，用限制性内切核酸酶SalI消化温度敏感型质粒pHSC4，用Klenow片段处理成平端。温度敏感型质粒pHSC4的限制性内切核酸酶SalI位点位于不参与复制的区域。用Klenow片段处理成平端。然后通过连接将所得的片段插入到限制性内切核酸酶SalI位点，得到如图2所示的质粒pHIS714。含质粒pHSC4的大肠杆菌AJ12571于1990年10月11日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3，Higashi1ChomeTsukuba-shiIbaraki-Ken305，Japan)，保藏号为FERMP-11763，然后于1991年8月26日转变为根据布达佩斯条约的保藏证书。保藏号为BP-3524。通过Klenow片段处理将上述含IS714的1.6kb片段制成平端，然后插入到所述pHIS714的SmaI位点，通过连接构建如图2所示的质粒pHTN7141和pHTN7142。限制性内切核酸酶裂解分析表明，将两个IS714片段以相同的方向插入到质粒pHTN7141中，以相反的方向插入到质粒pHTN7142中。用限制性内切核酸酶PvuII裂解pHTN7141和pHTN7142，可以切出在棒状细菌pHSC4中的含两个IS714序列的片段和温度敏感型复制起点的序列。另一方面，质粒载体pHSG298(由Takarashuzo制备)还含有两个限制性内切核酸酶PvuII位点。因此，用限制性内切核酸酶PvuII裂解pHSG298可以得到含新霉素磷酸转移酶基因(卡那霉素抗性基因)的2.3kb片段。用限制性内切核酸酶PvuII裂解pHTN7141和pHSG298，然后将其彼此相连以转化乳酸发酵短杆菌AJ12036。如图3所示，从对25μg/ml卡那霉素(km)有抗性的转化子菌株得到质粒pHTN7143。根据布达佩斯条约，含质粒pHTN7143的乳酸发酵短杆菌于1993年3月9日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3，Higashi1ChomeTsukuba-shiIbaraki-ken305，Japan)。保藏号为BP-4231。按图4所述，用上述方法，从pHTN7142和pHSG298得到质粒pHTN7144。pHTN7143和pHTN7144具有新霉素磷酸转移酶位于两个IS714序列之间的结构。此外，按图5所示，用pHSG298为对照，从质粒pHIS714制备质粒pHIS714K1和pHISK2。在pHIS714K1和pHISK2中，含新霉素磷酸转移酶基因的插入片段位于相反的位点。为了使人工转座子最小化，构建新霉素磷酸转移酶基因插入到一个IS714序列中的人工转座子。限制性内切核酸酶NheI位于IS714中不影响转座酶功能的位置。因此，用限制性内切核酸酶NheI裂解质粒pHIS714，使其末端平整。同时，用限制性内切核酸酶PstI从质粒pUC4K(由PharmaciaBiotech制备)中切出新霉素磷酸转移酶基因区，然后使其末端平整。将这些片段彼此相连，如图6所示，所得质粒称为pHTN7145。含质粒pHTN7145的大肠杆菌AJ12036于1995年6月29日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3，HigashilChomeTsukuba-shiIbauaki-ken305，Japan)，并于1996年5月16日转变为根据布达佩斯条约的保藏证书，保藏号为BP-5537。评估人工转座子的转座性能按如下评估由此得到的人工转座子的转座性能。用含有氯霉素乙酰基转移酶基因的质粒pAJ43转化乳酸发酵短杆菌以产生乳酸发酵短杆菌AJ11882。用含有人工转座子的质粒pHTN7145转化乳酸发酵短杆菌AJ11882，以便质粒pAJ43和质粒pHTN7145共存于所述的乳酸发酵短杆菌中。含质粒pAJ43的大肠杆菌AJ11882于1982年4月28日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3，Higashi1ChomeTsukuba-shiIbauaki-ken305，Japan)，并于1982年5月22日转变为根据布达佩斯条约的保藏证书，保藏号为BP-136。在含有25μg/ml卡那霉素(Km)，5μg/ml的氯霉素(Cm)，10g/L酵母提取物，10g/L胰胨，5g/L葡萄糖和5g/LNaCl的CM2G培养基中，于25℃培养上述得到的含pHTN7145和pAJ43的乳酸发酵短杆菌过夜，同时搅拌。然后将培养液适当稀释，涂布在含25μg/ml卡那霉素(Km)和5μg/ml氯霉素(Cm)的CG2M琼脂培养基中，于34℃培养。在形成的菌落中从100个菌株提取质粒，然后通过电泳检测其大小。其中，质粒pHTN7145和pAJ43的分子量不同。它们是其分子量为pAJ43和人工转座子的总分子量的质粒。通过限制内切酶裂解分析这些质粒时，发现pHTN7145中的序列被插入到pAJ43中。就这些质粒中的一个来看，用双脱氧法确定插入在pAJ43部分附近和插入片段核苷酸序列。结果，鉴定出人工转座子两个末端的序列，经过插入的pAJ43上的靶序列GGTTTATT(SequenceNo.12)是双份的。从这些结果发现若采用一种转座子结果，其中在一个IS714序列中插入不参与转座性能的基因(新霉素磷酸转移酶基因)，则它可以象有所述结构的转座子一样转座。评价人工转座子的转座频率用pHTN714K1、对照质粒、pHTN7143、pHTN7144和pHTN7145转化乳酸发酵短杆菌AJ12036，评价人工转座子转座到宿主染色体内的频率。pHTN7143、pHTN7144和pHTN7145都含有人工转座子。于25℃，在含有25μg/mlKm的上述CM2G液体培养基中将每个转化子温育过夜，然后用0.9％NaCl溶液大致稀释培养物，以100μl的量将之涂布于含25μg/mlKm的CM2G琼脂培养基上。在34℃和25℃保温所得物质，由菌落数目测量每个温度Km抗性菌株出现的频率，用34℃时的菌落数除以25℃时的菌落数，将所得数值定义为转座频率。结果示于表1。表1<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="553">转座因子或人工转座子转座频率比率IS714Tn7143Tn7144Tn71451.85×10-33.52×10-32.38×10-32.08×10-211.91.311.2</table></tables>从上述结果中发现人工转座子Tn7143(包含于pHTN7143中)和Tn7144(包含于pHTN7144中)转座到宿主染色体内的频率仅为作为对照质粒的IS714(包含于pHIS714K1中)的1或2倍，但是人工转座子Tn7145(包含于pHTN7145中)的转座频率大约为对照的11倍，因此它是一个十分有效的人工转座子。实施例2使用IS714构建含有氯霉素抗性基因的人工转座子用限制性内切核酸酶ACCII切割质粒载体pHSG398(由TakaraShuzo制备)，得到含有氯霉素乙酰转移酶基因的约为1.1kb的片段，用T4DNA聚合酶处理以使此ACCII片段的末端钝化，将之插入pUC18(由TakaraShuzo制备)的SmaI位点并克隆之，即从已在含有25μg/mlCm、100μg/ml氨苄西林(Ap)、10g/l胰胨、5g/l酵母提取物和5g/lNall的L-培养基中生长的E.coli转化子中选择所需的克隆。将此质粒称为pUC18-CM。另外，用EcoRI和HindIII从pUC18-CM上切下含有氯霉素乙酰转移酶基因的大约为1.1kb的片段，并使其末端钝化。在实施例1所构建的pHIS714K2中，通过用Klenow片段处理，可使位于不会损害转座酶功能之位置处的IS714的限制性内切核酸酶NheI位点的末端钝化。将上述片段与此限制性内切核酸酶NheI位点连接以转化E.coli，挑选在含有25μg/mlCm和50μg/mlKm的L-琼脂-培养基上生长的菌落，选择其中已插入了氯霉素乙酰转移酶基因片段的克隆，如图7所示，将此克隆中所含的质粒称为pHTN7151。用质粒pHTN7151转化E.coliHB101可得到E.coliAJ13129，1995年6月29日将之保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3、Higashi1chomeTsukuba-shiIbaraki-ken305，Japan)，保藏目录号为FERMP-15012，1996年5月16日变成根据布达佩斯条约的保藏证书，指定保藏号为No.BP-5538。评价染色体中经人工转座子转座而形成的拷贝数用pHTN7151转化乳酸发酵短杆菌AJ12036，用下述方法评价经人工转座子转座到宿主染色体内形成的染色体中人工转座子的拷贝数。于25℃，在上述含有3μg/mlCm的CM2G液体培养基中将所得转化子温育过夜，用0.9％NaCl溶液大致稀释，以100μl的量涂布于含有3μg/mlCm的CM2G琼脂培养基中，将所得物质在34℃中保温。从长出的菌落中选择卡那霉素敏感克隆，于30℃，在上述含有3μg/mlCm的CM2G液体培养基中将此克隆温育过夜，用0.9％NaCl溶液大致稀释，以100μl的量涂布于含有6μg/mlCm的上述CM2G琼脂培养基中，将所得物质在30℃中保温，从形成的菌落中随机选择一些克隆，制备每个克隆的染色体DNA，用限制性内切核酸酶PvuII完全消化，经琼脂糖凝胶电泳，在聚偏氟乙烯(PVDF)滤膜上印迹，使用经32P-标记的氯霉素乙酰转移酶基因片段作为探针，使滤膜经受Southern杂交，测量与探针杂交的带的数目。结果，鉴定出随机选择的四个克隆中有三个，其两拷贝具有氯霉素抗性基因的人工转座子被转座到宿主染色体内。实施例3使用IS714构建含有四环素抗性基因的人工转座子用限制性内切核酸酶EcoRI和AvaI裂解质粒载体pBR322(由TakaraShnzo制备)以得到含有四环素抗性基因的大约为1.4kb的片段。再用T4DNA聚合酶处理使此EcoRI-AvaI-裂解片段的末端钝化。在实施例1所构建的pHIS714K2中，通过用Klenow片段处理，可使位于不会损害转座酶功能之位置处的IS714的限制性内切核酸酶NheI位点的末端钝化，将上述片段与此限制性内切核酸酶NheI位点连接以转化E.coli。得到在含有25μg/mlTc的L-琼脂-培养基上生长的菌落，选择其中已插入了四环素抗性基因的克隆，如图8所示，将此克隆中所含的质粒称为pHTN7152。用质粒pHTN7152转化E.coli可得到E.coliAJ13130，1995年6月29日将之保藏于工业贸易和工业部、工业科学和技术机构的国家生物科学和人类技术研究所(1-3、Higazhi1ChomeTsukuba-shiIbaraki-Ken305、Japan)，保藏目录号为FERMP-15013，1996年5月16日变成根据布达佩斯条约的保藏证书，其指定保藏号为BP-5539。评价染色体中经人工转座子转座而形成的拷贝数用pHTN7152转化乳酵发酵短杆菌AJ12036，按下述方法评价经人工转座子转座而形成的染色体中的拷贝数。于25℃，在含有1.5μg/mlTc的上述CM2G液体培养基中将转化子温育过夜，再用0.9％NaCl溶液大致稀释，涂布于含有1.5μg/ml至5μg/mlT的上述CM2G琼脂培养基中。将所得物质在34℃中保温，从形成的菌落中随机选择一些克隆，制备每个菌落的染色体DNA，用限制性内切核酸酶PvuII完全消化，经琼脂糖凝胶电泳，在聚偏氟乙烯(PVDF)滤膜上印迹，使用经32P-标记的四环素抗性基因片段作为探针，使滤膜经受Southern杂交，测量与探针杂交的带的数目。结果，如表2所示，以高频率检测到具有四环素抗性基因的两或三拷贝人工转座子。因此；鉴定出使用四环素抗性基因作为选择性药物抗性基因可以高频率得到所需的多拷贝型转化子。表2<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="630">Tc浓度(μg/ml)检测的克隆数检测的克隆数1拷贝2拷贝3拷贝1.52.03.04.04.064466443252013100010</table></tables>根据布达佩斯条约，于1996年5月14日将抗4μg/mlTc且染色体上具有了拷贝人工转座子的乳酸发酵短杆菌AJ13188保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3，Higazhi1ChomeTsukuba-ShiIbaraki-Ken305，Japan)，指定保藏号为No.BP-5536。实施例4使用IS714构建含有四环素抗性基因和天冬氨酸激酶基因的人工转座子按下述方法将天冬氨酸激酶基因(赖氨酸生物合成基因之一)插入含有四环素抗性基因的人工转座子中。用限制性内切核酸酶EcoRI和AvaI裂解质粒载体pBR322(内TakaraShuzo制备)以得到含有四环素抗性基因的约为1.4kb的DNA片段，用T4DNA聚合酶处理使此经过EcoRI-AuvI裂解的片段末端钝化，将所得DNA片段与用限制性内切核酸酶SmaI切割质粒载体pHY300PLK(由TakaraShuzo制备)所得的片段连接，并转化E.coli，得到在含有25μg/mlTc的L-琼脂培养基上生长的菌落，选择其中已插入四环来抗性基因片段的克隆，将此克隆的质粒称为pHY300-Tc。另外，可通过用Klenow片段处理，使得通过用限制性内切核酸酶EcoRI和XbaI裂解pHY300-Tc得到的、并含有pBR322的四环素抗性基因的片段的末端钝化。在以上构建的pHIS714K2中，通过用Klenow片段处理，可使位于不会损害转座酶功能之位置处的IS714的限制性内切核酸酶NheI位点的末端钝化。将上述片段与此限制性内切核酸酶NheI位点连接以转化E.coli，得到在含有25μg/mlTc的L-琼脂培养基上生长的菌落，选择其中已插入四环来抗性基因片段的克隆，如图9所示，将此克隆中所含有质粒称作pHTN7156。在另一方面，于1992年4月10日将E.coliAJ12691(WO94/25605)保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3、Higachi1ChomeTsukuba-shiIbaraki-Ken305、Japan)，保藏号为FERMP-12198，1995年2月10日将之变为根据布达佩斯条约的保藏证书，其指定保藏号为NO.FERMBP-4999。E.coliAJ12691中具有质粒p399AK9B，此质粒含有来自乳酸发酵短杆菌产赖氨酸突变体的天冬氨酸激酶基因，此基因对赖氨酸和苏氨酸的协同抑制作用脱敏感。用限制性内切核酸酶BamHI裂解此p399AK9B，并自身连接到已从中去除了在棒状杆菌中起作用的复制起点的构建体PHSG399AK中。用EcoRI和SphI裂解PHSG399AK以得到约为1.7kb的天冬氨酸激酶基因片段。用T4DNA聚合酶处理使此片段的末端钝化，用Klenow片段片理使质粒pHTN7156的限制性内切核酸酶BglII位点的末端钝化，所述质粒具有含四环素抗性基因的人工转座子。然后将以上形成的片段插入此限制性内切核酸酶BglII位点，以此方式构建了如图9所示的质粒pHTN7156-C。用质粒pHTN7156-C转化E.coli可得到E.coliAJ13131，1995年6月29日将之保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3、Higashi1ChomeTsukuba-shiIbaraki-ken305、Japan)，指定保藏号为No.FERMP-15014，1996年5月16日将E.coliAJ13131变成根据布达佩斯条约的保藏，其指定保藏号为No.BP-5540。评价染色体中经人工转座子转座而形成的拷贝数用pHTN7156-C转化乳酸发酵短杆菌AJ12036或乳酸发酵短杆菌AJ3445。评价经人工转座子转座到宿主染色体中而形成的染色体中转座子的拷贝数。AJ12036菌株的染色体上具有野生型天冬氨酸激酶基因，而AJ3445菌株表现出S-2-戊基乙基-L-半胱氨酸抗性，并且具有对赖氨酸和苏氨酸的协同抑制作用脱敏的天冬氨酸激酶基因。1984年3月26日将乳酸发酵短杆菌AJ12036保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3，Higashi1ChomeTsukuba-ShiIbaraki-ken305.Japan)，指定保藏号为No.FERMP-7559，1985年3月13日将乳酸发酵短杆菌AJ12036变成根据布达佩斯条约的保藏证书，其指定保藏号为No.BP-734。1973年3月2日将乳酸发酵短杆菌AJ3445保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3，Higashi1ChomeTsukuba-shiIbaraki-Ken305，Japan)，指定保藏号为No.FERMP-1944，1996年5月17日将乳酶发酵短杆菌AJ3445变成根据布达佩斯条约的保藏证书，其指定保藏号为No，BP-5541。首先，于25℃，在CM2G培养基中将转化子温育过夜，所述培养基含有0.7μg/mlTc10g/l酵母提取物，10g/l胰化蛋白胨，5g/l葡萄糖和15g/lNaCl。用0.9％NaCl溶液大致稀释培养物，以100μl的量涂布于含1.5μg/ml至5μg/mlTc的上述CM2G琼脂培养基中，将所得培养物保温于34℃，从形成的菌落中随机选择一些克隆，并在含有25μg/mlKm的CM2G琼脂培养基中复制，然后选择Km-敏感菌株，制备选定的Km-敏感菌株的染色体DNA，用限制性内切核酸酶GblII完全消化，进行琼脂糖凝胶电泳，在聚偏氟乙烯(PVDF)滤膜上印迹，使用经32P标记的天冬氨酸激酶基因片段(从基因后一半的HindIII位点至EcoRI位点，为440bp)作为探针，对此滤膜进行Southern杂交，检测与探针杂交的带的数目，结果发现当AJ12036用作宿主时，10个分析菌株中的4个有两拷贝的转座子Tn7156-C被转座，当AJ3445用作宿主时，22个分析菌株中的8个有两拷贝的转座子Tn7156-C被转座。这证明通过使用四环素抗性基因作为选择性药物抗性基因，可以高频率将多拷贝有用基因引入染色体。评价使用人工转座子转座天冬氨酸激酶基因的菌株中所产生的赖氨酸的量评价其中转座子转座子的上述菌株中产生的赖氨酸的量。将含有转座子的菌株涂布于含有0.7μg/mlTc的CM2G琼脂培养基的整个表面，于34℃温育过液，将其量为原始量1/6的细胞接种于20ml赖氨酸生产培养基中，所述培养基含有100g/l葡萄糖，55g/l硫酸铵，50ml/lMamenon(AjinomotoCO.，Inc.)，1/gl磷酸二氢钾、1g/l硫酸镁、2mg/l维生素B1、0.5mg/l生物素、5ml/l烟酸酰胺、2mg/l硫酸铁和2mg/l硫酸锰(将此培养基的pH调节至7.5，然后以115℃高压灭菌15分钟，然后向其中加入50g/l的碳酸钙)。于30℃将培养物溶液在Sakaguchi三角锥瓶中温育72小时，分析培养物溶液中所形成的赖氨酸含量，评价含有人工转座子的菌株中所产生的赖氨酸的量，结果，如表3和表4所示，当AJ12036和AJ3445用作亲本菌株时，与无转座子的菌株相比，在Tn7156-C的转座中观察到所产生赖氨酸的量有所增加，另外，转座子的转座拷贝数越大(1拷贝和2拷贝)，所产生赖氨酸的量越多。这证明通过使用四环素抗性基因作为选择性药物抗性基因来引入有用基因的拷贝，可增加此菌株中产生的氨基酸的量。表3使用AJ12036作为亲本菌株，其中转座了转座因子的菌株中所产生的赖氨酸的量<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="602">菌株Tn7156-C的转座拷贝数所产生赖氨酸的量(g/l)AJ12306Tn7156-Cint-Y1Tn7156-Cint-Y20120.012.818.8</table></tables>表4使用AJ13445作为亲本菌株，其中转座了转座因子的菌株中所产生的赖氨酸的量<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="627">菌株Tn7156-C的转座拷贝数所产生赖氨酸的量(g/l)AJ13445Tn7156-Cint-06Tn7156-Cint-01901218.721.325.2</table></tables>实施例5穿梭载体pVK7的构建如日本专利公开No.11，280/1989和USP4,788,762中所述，乳酸发酵短杆菌中存在隐蔽性质粒pAM330。此pAM330产生于乳酸发酵短杆菌ATCC13869，它可用作能在短杆菌原中扩增的穿梭载体复制起点。通过将pHSG299(由TakaraShnzo制备)与pAM330结合可构建一个新的穿梭载体，所述pHXG299是E、coli的多功能载体。用限制性内切核酸酶HindIII在一个位点处切割pAM330，用T4DNA聚合酶使裂解的表面末端钝化。另外，用限制性内切核酸酶AvaII在一个位点处切割pHSG299，用T4DNA聚合酶使裂解的表面末端钝化。将所得片段相互连接可得到pAM330与pHSG299相结合的值粒，pVK7的构建图示于图18中，pVK7可在大肠杆菌和短杆菌中复制，并可将卡那霉素抗性传递给宿主。此载体具有PstI、SalI、BamHI、KpnI、SalI和EcoRI克隆位点，每个位点都允许在一个位点处裂解，它们都来自pHSG299的多克隆位点。穿梭载体pVC7的构建与pVK7类似，将pHSG399(由TakaraShnzo制备)与pAM330联合可构建一种新的穿梭载体pVC7，所述pHSG399是E.Coli的多功能载体。用限制性内切核酸酶HindIII在一个位点处切割pAM330，用T4DNA聚合酶使裂解的表面末端钝化，另外用限制性内切核酸酶BsaI在一个位点处切割pHSG399，并用T4DNA聚合酶使之未端钝化将所得片段互相连接可得到pAM330和pHSG399相联合的质粒。pVC7的构建图示于图19中。pVC7在大肠杆菌和短杆菌中都可复制，并可将卡那霉素抗性传递给宿主，此载体具有PstI.SalI.BamHI、KpnI、SacI、EcoRI、SmaI和HindIII克隆位点，每个位点都允许在一个位点处裂解，它们都来自pHSG399的多克隆位点。含有dapA、dapB和lysA的质粒的产生(1)lysA的制备及含有lysA质粒的构建使用乳酸发酵短杆菌ATCC13869的野生型菌株作为染色体DNA的供体，根据一般方法从ATCC13869菌株中制备染色体DNA，根据PCR从染色体DNA中扩增含有argS、lysA的DNA片段以及含有它们的操纵子的启动子DNA片段。分别使用具序列表中SEQIDNOs13和14所示核苷酸序列的23-聚体合成DNA作为扩增所用的DNA引物，以根据谷氨酸棒状杆菌(Corynebalterinmglutamicum)的已知序列(见MolecularMicrobiology，4(11)，1819-1830(1990)；MolecularandGeneralGenetics，212，112-119(1988))扩增编码精氨酰-tRNA合酶和DDC的约为3.6kb的区域。用常规方法进行DNA的合成和PCR，即根据一般方法，通过使用AppliedBiosystems生产的380B型DNA合成仪并使用亚磷酰胺法(见Tetrahedronletters(1981)，22，1859)以合成DNA。根据供应商指定的方法，使用PJ2000型DNA热循环仪(由TakaraShuzo生产)以及TaqDNA聚合酶，经PCR扩增基因。经扩增的DNA片段的序列示于第15号序列中。使用pHSG399作为克隆载体以扩增3,579bp的基因片段，用限制件酶SmaI消化pHSG399，此载体上连接有含经扩增的lysA的DNA片段。按上述方法得到的质粒被称为p399LYSA，它具有来源于ATCC13869的lysA。用KpnI和BamHI消化p339LYSA可提取到含有lysA的DNA片段，将此DNA片段连接到已被KpnI和BamHI消化的pHSG299上，所得质粒被称作p299LYSA。p299LYSA的构建过程示于图20中。用限制性内切核酸酶KpnI和BamHI裂解p399LYSA以提取lysA片段，将此片段连接到已被KpnI和BamHI裂解的pVK7中，由此产生的质粒被称作pLYSAm(图21)。(2)dapA的制备以及含有dapA的质粒的构建使用乳酸发酵短杆菌ATCC13869的野生型菌株作为染色体DNA供体，根据一般方法从ATCC13869菌株中制备染色体DNA，根据PCR从染色体DNA中扩增含有dapA的DNA片段。分别合成具有序列表中SEQIDNOs16和17所示核苷酸序列的20-聚体DNA以作为扩增所用的DNA引物，从而根据各氨酸棒状杆菌的已知序列(见NueleicAcidsResearch，18(21)，6421(1990)；EMBL登记号为No、X53993)扩增编码DDPS的约为1.5kb的区域。用常规方法进行DNA合成和PCR，经扩增的DNA片段的序列示于第18号序列中。将pCR1000(由Invitrogen生产，见Bio/Technology，9，657-663(1991))用作1.411bp的扩增基因片段的克隆载体，所述基因上连接有经扩增的dapA片段，根据指定的方法使用DNA连接试剂盒(由TakaraShuzo生产)以进行DNA的连接，从而构建出一质粒，其中扩增自乳发酵短杆菌染色体的1，411bp的dapA片段插入到pCR1000上。将接上述方法制得的质粒称为pCRDAPA(图22)，它具有来源于ATCC13869的dapA。将pCRDAPA导入E.coli菌株中可得到转化子菌株AJ13106，根据布达佩斯条约，于1995年5月26日将此菌株国际保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮编305.1-3，Higazhi1-Chome，Tsukuba-Shi，Ibaraki-Ken，Japan)，保藏号为FERMBP-5113。用KpnI和EcoRI消化含有dapA的质粒pCRDAPA，并分离含有dapA的DNA片段，将此片段与已被KpnI和EcoRI消化的pHSG399连接可得到p399DPS(图23)。(3)野生型和突变体lysC的制备以及含有它们的质粒的制备将乳酸发酵短杆菌ATCC13869的菌株，得自ATCC13869菌株并经突变处理的可生产L-赖氨酸的突变体菌株AJ3445用作染色体DNA供体，AJ3445菌株已经过突变以使lysC变成对赖氨酸和苏氨酸的协同抑制作用基本上脱敏(JournalofBiochemistry、68，701-710(1970))。根据PCR法(聚合酶链反应；见WhiteT.J.etal.TrendsGenet.，5.185(1989))，从染色体DNA中扩增含有lysC的DNA片段，合成具有SEQIDNOs19和20所示核苷酸序列的23-聚体和21-聚体单链DNA以作为扩增所用的DNA引物，从而可根据各氨酸棒状杆菌的已知序列(见MoleadarMicrobiology(1991)，5(5)，1197-1204；和MolGen.Genet.(1990)224317-324)扩增编码lysC的约为1,643bp的区域。使用常规方法进行DNA合成和DNA扩增，扩增DNA的序列示于序列21号，经琼脂糖凝胶电泳证实1,643bp的扩增基因片段，然后根据一般方法从凝胶中纯化切下的片段，用限制性酶NruI和EcoRI消化此片段。将pHSG399用作基因片段的克隆载体，用限制性酶SmaI和EcoRI消化pHSG399，并将之与扩增的lysC片段相连接，根据指定方法使用DNA连接试剂盒以连接DNA，因而制备了一种质粒，其中扩增自乳酸发酵短杆菌的染色体的lysC片段分别与pHSG399连接，将含有ATCC13869(野生型菌株)之lysC的质粒称为p399AKY，含有AJ3445(可生产L-赖氨酸的细菌)之lysC的质粒称为p399AK9(图24)。(4)dapB的制备以及含有dapB的质粒的构建将乳酸发酵短杆菌ATCC13869的野生型菌株用作染色体DNA供体，根据一般方法从ATCC13869菌株中制备染色体DNA，根据PCR从染色体DNA中扩增含有dapB的DNA片段。合成分别具有序列表中SEQIDNOs22和23所示核苷酸序列的23-聚体DNA以作为扩增所用的DNA引物，从而根据乳酸发酵短杆菌的已知序列(见JournalofBacteriology，157(9)，2743-2749(1993))扩增编码DDPR的约为2.0kb的区域。用常规方法进行DNA合成和PCR，经扩增的DNA序列示于序列24号中。将pCR-Script(由Invitrogen制备)用作2,001bp扩增基因片段的克隆载体，所述基因片段上连接有扩增的dapB片段，由此构建了一个质粒，其中扩增自乳酸发酵短杆菌染色体的2,001bp的dapB片段插入到pCR-Script上，将按上述方法得到的质粒称作pCRDAPB(图25)，它具有来源于ATCC13869的dapB。将pCRDAPB导入E.coli菌株可得到转化子菌株AJ13107，根据布达佩斯条约，于1995年5月26日将此菌株国际保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮编305，103，Higashi1-Chme，Tsukuba-ShiIbaraki-KenJapan)，保藏号为FERMBP-5114。(5)含有突变体lysC、dapA和dapB联合的质粒的构建用EcoRI和SphI裂解p399DPS以形成钝端，然后提取dapA基因片段，将此片段与已被SalI消化并钝端化的p399AK9连接以构建其中同时存在突变体lysC和dapA的质粒p399CA。用EcoRI消化含有dapB的质粒pCRDAPB并使之钝端化，然后用SacI消化以提取含有dapB的2.0kbDNA片段。用SpeI消化含有dapA和突变体lysC的质粒p399CA并使之钝端化，然后用SacI消化之并与以上提取出的2.0kb的dapB片段连接以得到含有突变体lysC、dapA和dapB的质粒，此质粒被称作p399CAB(图26)。随后，用SacII裂解p399CAB，使裂解片段的末端钝化，再从中提取含有dapA和dapB片段，同时用BamHI裂解pLYSAm，使裂解片段的末端钝化，将这些片段相互连接以产生含有dapA、dapB和lysA的质粒，此质粒在棒状细菌中可自我增殖，将此质粒称作pABLm，pABLm的构建示于图21中。将含有dapA、dapB和lysA的质粒导入乳酸发酵短杆菌Tn7156-Cint-Y2中使用电脉冲洗[日本特许公开专利申请(Kokai)no、207，791/1990，Sugimoto等人]将含有dapA、dapB和lysA的以上产生的质粒pABLm导入乳发酵短杆菌Tn7156-Cint-Y2中。通过药物抗性标记，即质粒的卡那霉素抗性基因以及染色体中扩增的四环素抗性基因来选择转化子，因此，转化子的选择在含有25μg/ml卡那霉素和1.5-μg/ml四环素的完全培养基中进行，将此转化子称为Tn7156-Cint-Y2/PABLm。将含有lysC、dapA、dapB和lysA的质粒导入乳酸发酵短杆菌野生型菌株中将具有可使质粒在棒状杆菌属所属细菌中自主复制之能力的DNA片段(下文称为″Brevi.-ori″)导入p399CAB中。从含有Brevi.-Ori的质粒载体pHK4中制备Brevi-Ori，所述质粒在大肠杆菌细胞和棒状杆菌属所属细菌细胞中都可以自主复制。用限制性酶BamHI消化pHK4，使裂解片段的末端钝化，根据指定的方法使用DNA钝端化试剂盒以进行钝端的形成。钝端形成之后，在其上连接一个磷酸化的KpnI接头(由TakaraShnzo生产)以引进修饰，以使仅用KpnI消化即可从pHK4中切割下相应于Brevi、-Ori部分的DNA片段。用KpnI消化此质粒，将产生的Brevi、-OriDNA片段与已被KpnI消化的p399CAB连接以制备含有lysC、dapA和dapB基因并可在棒状杆菌属所属细菌中自主复制的质粒。此质粒被称作pCAB，构建pCAB的流程示于图26中。用KpnI和BamHI消化pHC4、提取Brevi.-Ori片段，将之与已被KpnI和BamHI消化的pHSG298相连接，即可构建出pHK4(见日本专利特许公开No.5-7491)。pHK4可将卡那霉素抗性赋予宿主，将含有pHK4的E.coli称作E.coliAJ13136，1995年8月1日将之通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮编305，1-3，Higashi1-Chome，Tsukuba-ShiIbaraki-KenJapan)，保藏号为FERMBP-5186。(2)用Kpni和BamHI消化含有lysA的质粒p299LYSA并使其末端钝化，再提取lysA基因片段，将此片段与已被HpaI消化的PCAB连接以构建含有突变体lysC、dapA、dapB和lysA的联合并可在棒状细菌中自主复制的质粒。将构建出的质粒称作pCABL，pCABL的构建过程示于图27中。已注意到pCABL中含有dapB基因的DNA片段的HpaI位点插入了lysA基因片段，然而，HpaI位点位于dapB基因启动子的上游(SEQIDNO24中的核苷酸数611至616处)，dapB基因不能脱偶联。将以上产生的含有lysC、dapA、dapB和lysA的质粒pCABL导入乳发酵短杆菌野生型菌株AJ12036中，在含有5μg/ml氯霉素的完全培养基中进行转化子的选择，将此转化子称为AJ12036/PCABL。对以上构建的菌株培养作评价在L-赖氨酸生产培养基中培养乳发酵短杆菌野生型菌株AJ12036的转化子AJ12036/pCABL和Tn7156-Cint-Y2/pABLm，评价其中产生的L-赖氨酸的量。L-赖氨酸生产培养基组成如下所示。L-赖氨酸生产培养基溶解除碳酸钙以外的下列成分(每升中的量)，用KOH将溶液的ph调至8.0，将所得溶液在115℃灭菌15分钟，加入50g已单独干热灭菌过的碳酸钙。葡萄糖100g(NH4)2SO455gKH2PO41gMgSO4·7H2O1g生物素500μg维生素B12000μgFeSO4·7H2O0.01gMnSO4·7H2O0.01g烟酰胺5mg蛋白水解物(Mamenon)30ml碳酸钙50g将亲本菌株和转化子接种于具有上述组成的培养基中，在31.5℃往复振荡培养。表5中显示了培养72小时后产生的L-赖氨酸的量，培养完成时的生长量(OD562)和稳定性。通过将溶液稀释101倍并测量OD562即可评价生长量，另外，对稳定性而言，稀释后在完全培养基中培养上述培养完成时的培养物溶液，将形成的菌落涂布于含有药物的平板中，稳定性表现为在药物平板上形成之菌落的生长率表5如表5所示，当使用其中质粒上增加了lysC的菌株时以及当使用其中染色体上增加了lysC的菌株时，所产生的赖氨酸的量有所增加。另外，AJ12036/PCABL的稳定性为90％，而Tn7156-Cint-Y2/pABLm的稳定性为100％。实施例6构建质粒pHTN7150由于以上构建出的携有卡那霉素抗性基因的人工转座子Tn7145上不具有适于二氢2，6-吡啶二羧酸合酶基因插入的位点，故可按下述方法构建其中引入了新的插入位点的新质粒pHTN7150。用限制性酶PstI从质粒载体Puc4K(由PharmaciaBiotech制备)上切下卡那霉素抗性基因并使之末端钝化。将含有卡那霉素抗性基因的片段插入pHY300PLK(由TakaraShuzo制备)的SmaI位点以构建pHY300-KM，再用限制性酶EcoRI和XbaI消化pHY300-KM以切下含有卡那霉素抗性基因的片段，使此片段的末端钝化并插入位于质粒pHIS714上的IS714的钝端化NheI位点以构建质粒pHTN7150。pHTN7150上的人工转座子Tn7150具有卡那霉素抗性基因作为标记基因，基BglII位点可用作基因克隆位点。联合pHTN7150和乳酸发酵短杆菌的dapA基因按下述方法将编码二氢2，6-吡啶二羧酸合酶的基因(赖氨酸生物合成酶基因)插入含有卡那霉素抗性基因的人工转座子pHTN7150中。用EcoRI裂解含有dapA的质粒p399DPS后，通过用T4DNA聚合酶处理使所得片段的末端钝化，将磷酸化的BamHI接头(由TakaraShnzo制备)与之结合以修饰片段，致使仅用BamHI即可切下dapA基因。此质粒被称作p399DPSZ，将经用BamHI裂解此质粒形成的1.4kb的dapA片段与用BglII裂解的pHTN7150联合，BglII可给出与BamHI相同的粘性末端。由此构建的质粒被称为pHTN7150A，pHTN7150A的构建示于图28中。人工转座子TN7150A转座到乳酸发酵短杆菌的染色体中按下述方法，使用pHTN7150A可得到经过将含有dapA的人工转座子Tn7150A转座到乳酸发酵短杆菌AJ12036菌株中所形成的菌株。用pHTN7150A转化AJ12036菌株，于25℃，在含有25μg/ml卡那霉素、10g/l酵母提取物、10g/l胰胨、5g/l蔗糖和15g/lNall的CM2S液体培养基中将所得转化子培养过夜，用0.9％NaCl溶液大致稀释培养物，将稀释物涂布于含有25μg/mlCm的上述CM2S琼脂培养基上，于34℃下培养。从形成的菌落中选择氯霉素敏感菌株，随机选择这些菌株中的一些。从中制备染色体DNA，使用dapA片段作为探针进行Southern杂交以鉴定人工转座子的转座，将以上得到的其中转座了人工转座子的菌株称为AJ2036A。PCBLmc的构建以及菌株的产生按下述方法，使用pAM330和pHSG399的穿梭载体pVC7构建含有变体lysC、capB和lysA的质粒。用SacI处理含有dapB的pCRDAPB之后，通过用T4DNA聚合酶处理使所得片段的末端钝化，从而构建了与磷酸化的PstI接头(由TakaraShnzo制备)联合的质粒，由此得到的质粒被称作PCRDAPB2。用BamHI和PstI裂解该质粒，将所得dapB片段(2.0Kb)插入已被BamHI和PstI裂解的PVC7中，此质粒被称为PBmc。用BamHI和EcoRI裂解含有lysC的PAK9，将所得1.6kb的lysC片段与也经BamHI和EcoRI裂解的pBmc连接以构建含有dapB和lysC的质粒，此质粒被称为pBCmc。用EcoRI裂解含有lysA的p399LYSA之后，通过用T4DNA聚合酶处理使所得片段的末端钝化，将之与磷酸化的KpnI接头结合以修饰之，从而可用KpnI裂解lysA。此质粒被称为p399LYSAZ，用KpnI裂解p399LYSA2，将所得的3.6kblysA片段与已被EcoRI消化的pBCmc连接，通过用T4DNA聚合酶处理使其末端钝化，并与磷酸化的KpnI接头结合。由此得到的质粒被称作pCBLmc。此质粒在大肠杆菌和棒状细菌中可自我复制，并可将氯霉素抗性传递给宿主，它含有突变体lysC、dapB和lysA。PCBLmc的构建示于图29中。使用电脉冲法[Sugimoto等人的日本特许公开专利申请(Kokai)No，207，791/1990]将上文构建的pCBLm导入AJ12036A菌株，此菌株中的染色体上已转座了人工转座子Tn7150A。在含有5μg/ml氯霉素和25μg/ml卡那霉素的上述CM2S培养基中进行转化子的选择。将如此构建的菌株称为AJ12036∷A/pCBLmc。评价构建菌株的培养在L-赖氨酸生产培养基中培养亲本菌株和转化子AJ12036/pCABL和AJ12036∷A/pCBLmc，评价所产生的赖氨酸的量，结果示于表6中。表6如表6中可明显看出，在其染色体上增加了dapA的菌株中以及其质粒上增加了lysC的菌株中，所产生的赖氨酸量有所增加。另外，AJ12036/PCABL的稳定性为90％，而AJ12036∷A/pCBLm的稳定性为100％。实施例7转座子单元中不含转座酶的人工转座子的构建使用E.coliTrc启动子或类似物构建转座酶表达质粒用限制性内切核酸酶NheI和XbaI裂解质粒pHIS714，得到含有编码转座酶之基因的片段，其中缺失了IS714的5′端反向重复(IR)序列。将此DNA片段导入质粒载体PNC19的XbaI位点以构建质粒TnPL/pUC19。另外，用限制性内切核酸酶MroI和XbaI裂解TnpL/pUC19以缺失包括IS714终止密码子和3′端反向重复(IR)的序列，通过连接将具有下列序列的合成双链DNA插入以上裂解的部分。5′-CCGGACAGCTCACCCACAAAATCAATGCACTCTAAAAAGGTACCT-3′3′-TGTCGAGTGGGTGTTTTAGTTACGTGAGATTTTCCATGGAGATC-5′(序列25和26)用此方法构建了质粒ORFL/pUC19，其中TnPL/pUC19转座酶3′端存在的IR已经缺失。随后，用限制性内切核酸酶SmaI和XbaI裂解此ORFL/pUC19以得到含有转座酶的约为1.5kb的基因片段，将此转座酶基因片段插入质粒载体pHY300PLK(由TakaraShnzo制备)的部分中，该部分是通过除去质粒中SmaI和XbaI位点之间的序列，再用限制性内切核酸酶EcoRI和KpnI切割而得到的。用T4DNA聚合酶使此EcoRI-KpnI转座酶基因片段的末端印化，同时，用限制性内切核酸酶PvuII部分消化质粒载体pHSG398(由TakaraShuzo制备)以缺失含有多克隆位点的约为0.3kb的片段。将以上得到的转座酶基因片段插入质粒载体pHSG398的已消化部分以构建图10所示的质粒pORF1。另一方面，使较容易得到的、质粒pHIS714的NheI-XbaI裂解片段的末端钝化，并导入质粒载体pUC19的末端钝化的PstI位点以构建质粒Tnp(Pst)/pUC19。使用U.S.E.诱变试剂盒(内PharmaciaBiotech制备)对此Tnp(Pst)/Puc19的转座酶基因进行部分碱基取代。被取代的碱基是LS714序列中第288位碱基G，用C取代此碱基G，这是由GTG变为GTC的变化，而不是氨基酸水平上的变化，将此碱基被取代的质粒称为Tnp(Pst)M/puc19。从pORF1中缺失转座酶前一半基因中存在的限制性内切核酸酶SmaI和NaeI位点之间的序列，通过连接将经用限制性由切核酸酶SmaI和NaeI裂解Tnp(Pst)M/puc19所得的转座酶前一半基因片段(包括GTG→GTC的变化)插入以上经缺失的部分以构建PORF2。从pORF2中缺失SmaI和XbaI位点之间的序列，使所得片段的末端钝化，通过用限制性内切核酸酶NaeI和HindIII裂解pBSF2-SD7，再使其末端钝化可得到含有色氨酸操纵子衰减子的DNA片段。将前一片段与后一片段相连接，由此构建的质粒被称为pORF3。1989年6月1日将用质粒pBSF2-SD7转化的E.coliHB101(AJ12448)通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3、Higashi1ChomeTsukuba-ShiIbaraki-Ken305、Japan)，保藏号为No.FERMP-10758，1992年2月19日将此菌株变成根据布达佩斯条约的保藏证书，指定保藏号为No，BP-3753。用限制性由切核酸酶SalI和Bpu1102I裂解pORF3以缺失转座酶前半个基因片段。通过连接将经用限制性内切核酸酶SalI和Blu1102I裂解Tnp(Pst)/pUC19所得的转座酶前半个基因片段插入以上已缺失的部分以构建如图11所示的pOFR4。用SacI裂解TnPL/pUC19，再于30℃中，用BAL31核酸酶消化20分钟以从转座酶基因起始密码子上游附近缺失序列，当经过缺失的末端钝化之后，使用SphI位点切下转座酶基因片段，并插入已被SmaI和SphI裂解的pHSG398位点，将由此构建的质粒称为delTnp5/398。用限制性由切核酸酶KnpI和HindIII裂解此delTnp5/398，使所得的转座酶前半个基因片段的末端钝化，然后用NcoI和HindIII裂解质粒载体PKK233-2(由PharmaciaBiotech制备)，并使其末端钝化，通过连接反应将前一片段与后一片段相连接以构建pTrc-ORF。用SspI和Bpu1102I裂解PTrc-ORF以形成含有Trc启动子和转座酶前一半基因的片段，用XbaI裂解pORF3，末端钝化，再用Bpu1102I进一步裂解以缺失转座酶的前一半基因片段，将以上形成的片段插入此pORF3的已缺失部分以构建如图12所示的pORF7。将经用限制性由切核酸酶KpnI和HindIII裂解delTnp5/398所得的转座酶的前一半基因片段克隆到质粒载体pUC18的KpnI和HindIII位点之间，此质粒的BsmI和NaeI位点之间的部分已缺失，将此片段与经用限制性内切核酸酶BsmI和NacI裂解Tnp(Pst)M/pUC19所得的转座酶前半个基因片段(G→C取代型)相连接以构建delTnp5M/18。用KpnI和HindIII裂解此delTnp5M/18，使所得的转座酶前一半基因片段的末端钝化。用NooI和HindIII裂解pKK233-2，使所得片段的末端钝化。将这些片段相互连接以构建pTrc-TnpM。使用由pTrc-Tnp构建pORF7的方法(图13)由pTrc-TnPM构建pORF8。构建质粒以导入含有人工转座子单元以及此单元外部的转座酶表达系统的棒状细菌中使用上述质粒pORF3、pORF4、pORF7和pORF8构建质粒，以下描述的是由pORF3构建pORF41。首先用NheI和SacII裂解pHIS714以缺失转座酶基因的主要部分，将具有下列序列的双链合成DNA插入以上已缺失的部分以构建pHTN7160。5′-CTAGCTCGAGATATCAGATCTACTAGTCGACCGC-3′(序列27)3′-AGCTCTATAGTCTAATGATCAGCTGG-5′(序列28)用限制性内切核酸酶KpnI裂解pHTN7160，使之末端钝化，再用BglI裂解以得到含有IS714两条侧链上的反向重复(IR)序列以及在棒状细菌中起作用的温度敏感型复制起点的片段。用限制性内切核酸酶EarI裂解pORF3，使之末端钝化，再用BglI裂解，将上述pHTN7160的片段插入其中以构建pURF41-Pre。然后，用EcoRV裂解pORF41-pre，将含有pBR322的Tc抗性基因并且已末端钝化的EcoRI-AvaI片段插入经EcoRV裂解的片段以构建图14所示的pORF41。重复上述方法以分别通过pORF31-Pre由pORF4构建pORF31，通过pORF71-Pre由pORF7构建pORF71，通过pORF81-Pre由pORF8构建pORF81。根据布达佩斯条约，于1996年6月3日将含有质粒pORF81的E.coliAJ13208保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3，Higashi1ChomeTsukuba-ShiIbaraki-Ken305，Japan)，其指定保藏号为No.BP-5557。用XbaI和EarI裂解pORF3，使之末端钝化，并自身连接以构建不含转座酶基因的pORFCO(图15)。使用与由pORF3构建pURF41相同的方法通过pORFC2-Pre由pORFCO构建仅含有一个转座子单元(不含转座酶基因)的pORFC2。假如pURFC2不具有转座酶的结构基因，则这些最终构建出的质粒具有转座酶的结构基因、Cm抗性基因，在E.coli中起作用的复制起点，在棒状细菌中起作用的温度敏感型复制起点，以及IS714的IR之间所包含的Tc抗性基因。将含有IS714两个末端上的IR并含有Tc抗性基因的单元称为转座子单元Tn7162。评价染色体上内转座子单元转座而形成的具有Tc抗性基因的转座子单元的拷贝数使用以上构建的质粒pORF31、pORF41、pORF81和pORFC2进行转座试验，认为可被转座的单元是转座单元Tn7162。用上述每个质粒转化乳发酵短杆菌AJ12036，评价内转座子单元Tn7162转座到宿主染色体中而形成的宿主染色体中的转座子单元Tn7162的拷贝数。即于25℃，在含有5μg/mlCm的上述CM2G液体培养基中将转化子培养过夜，用0.9％NaCl溶液大致稀释，将稀释物以100μl的量涂布于含有1.5μg/ml至4μg/mlTc的上述CM2G琼脂培养基中，于34℃培养，从形成的菌落中挑选Cm敏感克隆，于34℃培养，从形成的菌落中随机选择一些克隆，从中制备染色体DNA，用限制性内切核酸酶PvuII完全消化，进行琼脂糖凝胶电际，印迹于硝酸纤维素(或尼龙或PVDF)滤膜上，使用经32-P或ECL直接标记系统(由Amersham制备)标记的Tc抗性基因片段作为探针，对此滤膜进行Southern杂交，检测与此探针杂交的带的数目。结果发现，如表7所示，具有Tc抗性标记基因的多拷贝数的转座子单元m7162以某些频率被转座。这表明表达型的转座酶基因可以在质粒转座子单元之外起作用(pORF31、41和81)，也可以在染色体本身存在的转座酶内起作用(pORFC2)。表7</tables>实施例8构建仅含有转座酶表达系统的棒状细菌的质粒以及将转座子单元转座到染色体上构建仅含有转座酶表达系统的棒状细菌的质粒用EcoO109I和MroI裂解质粒pHIS714K1以缺失IS714，然后使之自身连接以构建pHIS714Kdel。同时，用限制性由切核酸酶EarI裂解pORE3，使之末端钝化，再用BglI裂解，用限制性由切核酸酶KpnI裂解pHIS714Kdel，使之末端钝化，再用BglI裂解以形成含有温度敏感型复制起点并在棒状细菌中起作用的片段。将如此形成的片段互相连接以构建如图17所示的pORF40。重复此方法以分别由pORF4构建pORF30、由pORF7构建pORF70、由pORF8构建pORF80以及由pORFCO构建pORFC1。评价染色体中内转座子单元转座而形成的具有Tc抗性基因的转座子单元的拷贝数使用以上构建的质粒pORF80和pORFC1进行转座试验，认为可被转座的单元是转座子单元Tn7162。在实施例7中阐明用含有转座子单元Tn7162的质粒转化乳酸发酵短杆菌AJ12036，多拷贝数的Tn7162被转座到宿主染色体中。通过对染色体DNA进行Southern杂交分析来检测当以上构建的质粒pORF80和pORFC1被进一步导入作为宿主的有一拷贝染色体转座的菌株以增加转座酶活性时，染色体中的Tn7162是否会进一步转座或复制，然后评价拷贝数。即在25℃下，于含有5μg/mlCm的上述CM2G液体培养基中将转化子培养过夜，用0.9％Nacl溶液大致稀释，以100μl的量将稀释物涂布于含有6μg/ml至20μg/mlT的上述DM2G琼脂培养基上，于34℃培养，从所形成的菌落中挑选Cm-敏感克隆。从这些Cm-敏感克隆中随机选择一些克隆，从中制备染色体DNA，用限制性内切核酸酶PvuII完全消化，进行琼脂糖凝胶电泳，印迹于硝酸纤维素(或尼龙或PVDF)滤膜上，使用经32-P或ECL直接标记系统(由Amersham制备)标记的Tc抗性基因片段作为探针，对滤膜进行Southern杂交，检测与此探针杂交的带的数目。结果、多拷贝数的具有Tc抗性标记基因的转座子单元Tn7162以某些频率被转座和复制。序列表(1)SEQIDNO1的资料1(i)序列特征(A)长度1453个碱基对(B)类型核酸(C)链数双链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组的)(iii)假设否(iv)反义否(vi)来源(A)生物乳酸发酵短杆菌(B)菌株AJ12036(ix)特征描述(A)名称/关键词(B)定位130..1440(ix)特征描述(A)名称/关键词.重复区域(B)定位1..15(ix)特征描述(A)名称/关键词.重复区域(B)定位1439..1453(ix)特征描述(A)名称/关键词-35信号(B)定位71..76(ix)特征描述(A)名称/关键词-10信号(B)定位92..97(xi)序列描述SEQIDNO1GGCCCTTCCGGTTTTGGGGTACATCACAGAACCTGGGCTAGCGGTGTAGACCCGAAAATA60AACGAGCCTTTTGTCAGGGTTAAGGTTTAGGTATCTAAGCTAACCAAACACCAACAAAAAG120GCTCTACCCATGAAGTCTACCGGCAACATCATCGCTGACACCATCTGC168MetLysSerThrGlyAsnIleIleAlaAspThrIleCys1510CGCACTGCGGAACTAGGACTCACCATCACCGGCGCTTCCGATGCAGGT216ArgThrAlaGluLeuGlyLeuThrIleThrGlyAlaSerAspAlaGly152025GATTACACCCTGATCGAAGCAGACGCACTCGACTATACCTCCACCTGC264AspTyrThrLeuIleGluAlaAspAlaLeuAspTyrThrSerThrCys30354045CCAGAATGCTTCCAACCTGGGGTGTTTCGTCATCACACCCACCGGATG312ProGluCysPheGlnProGlyValPheArgHisHisThrHisArgMet505560CTCATTGATTTACCCATCGTCGGGTTTCCCACCAAACTGTTTATCCGT360LeuIleAspLeuProIleValGlyPheProThrLysLeuPheIleArg657075CTACCTCGCTACCGCTGCACCAACCCGACATGTAAGCAAAAGTATTTC408LeuProArgTyrArgCysThrAsnProThrCysLysGlnLysTyrPhe808590CAAGCAGAACTAAGCTGCGCTGACCACGGTAAAAAGGTCACCCACCGG456GlnAlaGluLeuSerCysAlaAspHisGlyLysLysValThrHisArg95100105GTCACCCGCTGGATTTTGCAACGCCTTGCTATTGACCGGATGAGTGTT504ValThrArgTrpIleLeuGlnArgLeuAlaIleAspArgMetSerVal110115120125CACGCAACTGCGAAAGCACTTGGGCTAGGGTGGGATTTAACCTGCCAA552HisAlaThrAlaLysAlaLeuGlyLeuGlyTrpAspLeuThrCysGln130135140CTAGCCCTCGATATGTGCCGTGAGCTGGTCTATAACGATCCTCACCAT600LeuAlaLeuAspMetCysArgGluLeuValTyrAsnAspProHisHis145150155CTTGATGGAGTGTATGTCATTGGGGTGGATGAGCATAAGTGGTCACAT648LeuAspGlyValTyrValIleGlyValAspGluHisLysTrpSerHis160165170AATAGGGCTAAGCATGGTGATGGGTTTGTCACCGTGATTGTCGATATG696AsnArgAlaLysHisGlyAspGlyPheValThrValIleValAspMet175180185ACCGGGCATCGGTATGACTCACGGTGTCCTGCCCGGTTATTAGATGTC744ThrGlyHisArgTyrAspSerArgCysProAlaArgLeuLeuAspVal190195200205GTCCCAGGTCGTAGTGCTGATGCTTTACGGTCCTGGCTTGGCTCCCGC792ValProGlyArgSerAlaAspAlaLeuArgSerTrpLeuGlySerArg210215220GGTGAACAGTTCCGCAATCAGATACGGATCGTGTCCATGGATGGATTC840GlyGluGlnPheArgAsnGlnIleArgIleValSerMetAspGlyPhe225230235CAAGGCTACGCCACAGCAAGTAAAGAACTCATTCCTTCTGCTCGTCGC888GlnGlyTyrAlaThrAlaSerLysGluLeuIleProSerAlaArgArg240245250GTGATGGATCCATTCCATGTTGTGCGGCTTGCTGGTGACAAGCTCACC936ValMetAspProPheHisValValArgLeuAlaGlyAspLysLeuThr255260265GCCTGCCGGCAACGCCTCCAGCGGGAGAAATACCAGCGTCGTGGTTTA984AlaCysArgGlnArgLeuGlnArgGluLysTyrGlnArgArgGlyLeu270275280285AGCCAGGATCCGTTGTATAAAAACCGGAAGACCTTGTTGACCACGCAC1032SerGlnAspProLeuTyrLysAsnArgLysThrLeuLeuThrThrHis290295300AAGTGGTTGAGTCCTCGTCAGCAAGAAAGCTTGGAGCAGTTGTGGGCG1080LysTrpLeuSerProArgGlnGlnGluSerLeuGluGlnLeuTrpAla305310315TATGACAAAGACTACGGGGTGTTAAAGCTTGCGTGGCTTGCGTATCAG1128TyrAspLysAspTyrGlyValLeuLysLeuAlaTrpLeuAlaTyrGln320325330GCGATTATTGATTGTTATCAGATGGGTAATAAGCGTGAAGCGAAGAAG1176AlaIleIleAspCysTyrGlnMetGlyAsnLysArgGluAlaLysLys335340345AAAATGCGGACCATTATTGATCAGCTTCGGGTGTTGAAGGGGCCGAAT1224LysMetArgThrIleIleAspGlnLeuArgValLeuLysGlyProAsn350355360365AAGGAACTCGCGCAGTTGGGTCGTAGTTTGTTTAAACGACTTGGTGAT1272LysGluLeuAlaGlnLeuGlyArgSerLeuPheLysArgLeuGlyAsp370375380GTGTTGGCGTATTTCGACGTAGGAGTCTCCAACGGACCAGTCGAAGCC1320ValLeuAlaTyrPheAspValGlyValSerAsnGlyProValGluAla385390395ATCAATGGACGCCTAGAACACCTCCGCGGAATCGCGCTTGGATTCCGC1368IleAsnGlyArgLeuGluHisLeuArgGlyIleAlaLeuGlyPheArg400405410AACCTCACCCACTACATCCTTCGATGCCTCATCCACTCCGGACAGCTC1416AsnLeuThrHisTyrIleLeuArgCysLeuIleHisSerGlyGlnLeu415420425ACCCACAAAAATCAATGCACTCTAAAAACGGAAGAGCC1453ThrHisLysIleAsnAlaLeu*430435(2)INFORMATIONFORSEQIDNO2(i)SEQUENCECHARRACTERISTICS(A)LENGTH437aminoacids(B)TYPEaminoacid(D)TOPOLOGYlinear(2)SEQIDNO2的资料(i)序列特征(A)长度437个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线形(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQIDNO2MetLysSerThrGlyAsnIleIleAlaAspThrIleCysArgThrAla151015GluLeuGlyLeuThrIleThrGlyAlaSerAspAlaGlyAspTyrThr202530LeuIleGluAlaAspAlaLeuAspTyrThrSerThrCysProGluCys354045PheGlnProGlyValPheArgHisHisThrHisArgMetLeuIleAsp505560LeuProIleValGlyPheProThrLysLeuPheIleArgLeuProArg65707580TyrArgCysThrAsnProThrCysLysGlnLysTyrPheGlnAlaGlu859095LeuSerCysAlaAspHisGlyLysLysValThrHisArgValThrArg100105110TrpIleLeuGlnArgLeuAlaIleAspArgMetSerValHisAlaThr115120125AlaLysAlaLeuGlyLeuGlyTrpAspLeuThrCysGlnLeuAlaLeu130135140AspMetCysArgGluLeuValTyrAsnAspProHisHisLeuAspGly145150155160ValTyrValIleGlyValAspGluHisLysTrpSerHisAsnArgAla165170175LysHisGlyAspGlyPheValThrValIleValAspMetThrGlyHis180185190ArgTyrAspSerArgCysProAlaArgLeuLeuAspValValProGly195200205ArgSerAlaAspAlaLeuArgSerTrpLeuGlySerArgGlyGluGln2l0215220PheArgAsnGlnIleArgIleValSerMetAspGlyPheGlnGlyTyr225230235240AlaThrAlaSerLysGluLeuIleProSerAlaArgArgValMetAsp245250255ProPheHisValValArgLeuAlaGlyAspLysLeuThrAlaCysArg260265270GlnArgLeuGlnArgGluLysTyrGlnArgArgGlyLeuSerGlnAsp275280285ProLeuTyrLysAsnArgLysThrLeuLeuThrThrHisLysTrpLeu290295300SerProArgGlnGlnGluSerLeuGluGlnLeuTrpAlaTyrAspLys305310315320AspTyrGlyValLeuLysLeuAlaTrpLeuAlaTyrGlnAlaIleIle325330335AspCysTyrGlnMetGlyAsnLysArgGluAlaLysLysLysMetArg340345350ThrIleIleAspGlnLeuArgValLeuLysGlyProAsnLysGluLeu355360365AlaGlnLeuGlyArgSerLeuPheLysArgLeuGlyAspValLeuAla370375380TyrPheAspValGlyValSerAsnGlyProValGluAlaIleAsnGly385390395400ArgLeuGluHisLeuArgGlyIleAlaLeuGlyPheArgAsnLeuThr405410415HisTyrIleLeuArgCysLeuIleHisSerGlyGlnLeuThrHisLys420425430(3)SEQIDNO3的资料(i)序列特征(A)长度15个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组的)(iii)假设否(iv)反义否(vi)来源(A)生物乳酸发酵短杆菌(B)菌株(xi)序列描述SEQIDNO3(4)SEQIDNO4的资料(i)序列特征(A)长度15个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组的)(iii)假设否(iv)反义否(vi)来源(A)生物乳酸发酵短杆菌(B)菌株AJ12036(xi)序列描述GGCTCTICCGTITIT15(5)SEQIDNO5的资料(i)序列特征(A)长度1453个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组的)(iii)假设否(iv)反义否(vi)来源(A)生物乳酸发酵短杆菌(B)菌株AJ12036(ix)特征描述(A)名称/关键词CDS(B)定位130..1440(ix)特征描述(A)名称/关键词.重复区域(B)定位1..15(ix)特征描述(A)名称/关键词.重复区域(B)定位1439..1453(ix)特征描述(A)名称/关键词-35信号(B)定位71..76(ix)特征描述(A)名称/关键词-10信号(B)定位92..97(xi)序列描述SEQIDNO5GGCCCTTCCGGTTTTGGGGTACATCACAGAACCTGGGCTAGCGGTGTAGACCCGAAAATA60AACGAGCCTTTTGTCAGGGTTAAGGTTTAGGTATCTAAGCTAACCAAACACCAACAAAAG120GCTCTACCCATGAAGTCTACCGGCAACATCATCGCTGACACCATCTGC168MetLysSerThrGlyAsnIleIleAlaAspThrIleCys1510CGCACTGCGGAACTAGGACTCACCATCACCGGCGCTTCCGATGCAGGT216ArgThrAlaGluLeuGlyLeuThrIleThrGlyAlaSerAspAlaGly152025GATTACACCCTGATCCAAGCACACGCACTCGACTATACCTCCACCTGC264AspTyrThrLeuIleGluAlaAspAlaLeuAspTyrThrSerThrCys30354045CCAGAATGCTTCCAACCTGGGGTGTTTCGTCATCACACCCACCGGATG312ProGluCysPheGlnProGlyValPheArgHisHisThrHisArgMet505560CTCATTGATTTACCCATCGTCGGGTTTCCCACCAAACTGTTTATCCGT360LeuIleAspLeuProIleValGlyPheProThrLysLeuPheIleArg657075CTACCTCGCTACCGCTGCACCAACCCGACATGTAAGCAAAAGTATTTC408LeuProArgTyrArgCysThrAsnProThrCysLysGlnLysTyrPhe808590CAAGCAGAACTAAGCTGCGCTGACCACGGTAAAAAGGTCACCCACCGG456GlnAlaGluLeuSerCysAlaAspHisGlyLysLysValThrHisArg95100105GTCACCCGCTGGATTTTGCAACGCCTTGCTATTGACCGGATGAGTGTT504ValThrArgTrpIleLeuGlnArgLeuAlaIleAspArgMetSerVal110115120125CACGCAACTGCGAAAGCACTTGGGCTAGGGTGGGATTTAACCTGCCAA552HisAlaThrAlaLysAlaLeuGlyLeuGlyTrpAspLeuThrCysGln130135140CTAGCCCTCGATATGTGCCGTGAGCTGGTCTATAACGATCCTCACCAT600LeuAlaLeuAspMetCysArgGluLeuValTyrAsnAspProHisHis145150155CTTGATGGAGTGTATGTCATTGGGGTGGATGAGCATAAGTGGTCACAT648LeuAspGlyValTyrValIleGlyValAspGluHisLysTrpSerHis160165170AATAGGGCTAAGCATGGTGATGGGTTTGTCACCGTGATTGTCGATATG696AsnArgAlaLysHisGlyAspGlyPheValThrValIleValAspMet175180185ACCGGGCATCGGTATGACTCACGGTGTCCTGCCCGGTTATTAGATGTC744ThrGlyHisArgTyrAspSerArgCysProAlaArgLeuLeuAspVal190195200205GTCCCAGGTCGTAGTGC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AATTGAGTCT781IleCysLeuTyrAspIleProGlyArgSerGlyIleProIleGluSer145150155GATACCATGAGACGCCTGAGTGAATTACCTACGATTTTGGCGGTCAAG829AspThrMetArgArgLeuSerGluLeuProThrIleLeuAlaValLys160165170GACGCCAAGGGTGACCTCGTTGCAGCCACGTCATTGATCAAAGAAACG877AspAlaLysGlyAspLeuValAlaAlaThrSerLeuIleLysGluThr175180185GGACTTGCCTGGTATTCAGGCGATGACCCACTAAACCTTGTTTGGCTT925GlyLeuAlaTrpTyrSerGlyAspAspProLeuAsnLeuValTrpLeu190195200205GCTTTGGGCGGATCAGGTTTCATTTCCGTAATTGGACATGCAGCCCCC973AlaLeuGlyGlySerGlyPheIleSerValIleGlyHisAlaAlaPro210215220ACAGCATTACGTGAGTTGTACACAAGCTTCGAGGAAGGCGACCTCGTC1021ThrAlaLeuArgGluLeuTyrThrSerPheGluGluGlyAspLeuVal225230235CGTGCGCGGGAAATCAACGCCAAACTATCACCGCTGGTAGCTGCCCAA1069ArgAlaArgGluIleAsnAlaLysLeuSerProLeuValAlaAlaGln240245250GGTCGCTTGGGTGGAGTCAGCTTGGCAAAAGCTGCTCTGCGTCTGCAG1117GlyArgLeuGlyGlyValSerLeuAlaLysAlaAlaLeuArgLeuGln255260265GGCATCAACGTAGGAGATCCTCGACTTCCAATTATGGCTCCAAATGAG1165GlyIleAsnValGlyAspProArgLeuProIleMetAlaProAsnGlu270275280285CAGGAACTTGAGGCTCTCCGAGAAGACATGAAAAAAGCTGGAGTTCTA1213GlnGluLeuGluAlaLeuArgGluAspMetLysLysAlaGlyValLeu290295300TAAATATGAATGATTCCCGAAATCGCGGCCGGAAGGTTACCCGCAAGGCGGCCCACCAGA1273AGCTGGTCAGGAAAACCATCTGGATACCCCTGTCTTTCAGGCACCAGATGCTTCCTCTAA1333CCAGAGCGCTGTAAAAGCTGAGACCGCCGGAAACGACAATCGGGATGCTGCGCAAGGTGC1393TCAAGGATCCCAACATTC1411(19)SEQIDNO19的资料(i)序列特征(A)长度23个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他..合成DNA(iv)反义无(xi)序列描述SEQIDNO19TCGCGAAGTAGCACCTGTCACTT23(20)SEQIDNO20的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他..合成DNA(iv)反义有(xi)序列描述SEQIDNO20ACGGAATTCAATCTTACGGC21(21)SEQIDNO21的资料(i)序列特征(A)长度1643个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型基因组DNA(iv)反义无(vi)来源(A)生物乳酸发酵短杆菌(B)菌株ATCC13869(xi)序列描述SEQIDNO21TCGCGAAGTAGCACCTGTCACTTTTGTCTCAAATATTAAATCGAATATCAATATACGGTC60TGTTTATTGGAACGCATCCCAGTGGCTGAGACGCATCCGCTAAAGCCCCAGGAACCCTGT120GCAGAAAGAAAACACTCCTCTGGCTAGGTAGACACAGTTTATAAAGGTAGAGTTGAGCGG180GTAACTGTCAGCACGTAGATCGAAAGGTGCACAAAGGTGGCCCTGGTCGTACAGAAATAT240GGCGGTTCCTCGCTTGAGAGTGCGGAACGCATTAGAAACGTCGCTGAACGGATCGTTGCC300ACCAAGAAGGCTGGAAATGATGTCGTGGTTGTCTGCTCCGCAATGGGAGACACCACGGAT360GAACTTCTAGAACTTGCAGCGGCAGTGAATCCCGTTCCGCCAGCTCGTGAAATGGATATG420CTCCTGACTGCTGGTGAGCGTATTTCTAACGCTCTCGTCGCCATGGCTATTGAGTCCCTT480GGCGCAGAAGCTCAATCTTTCACTGGCTCTCAGGCTGGTGTGCTCACCACCGAGCGCCAC540GGAAACGCACGCATTGTTGACGTCACACCGGGTCGTGTGCGTGAAGCACTCGATGAGGGC600AAGATCTGCATTGTTGCTGGTTTTCAGGGTGTTAATAAAGAAACCCGCGATGTCACCACG660TTGGGTCGTGGTGGTTCTGACACCACTGCAGTTGCGTTGGCAGCTGCTTTGAACGCTGAT720GTGTGTGAGATTTACTCGGACGTTGACGGTGTGTATACCGCTGACCCGCGCATCGTTCCT780AATGCACAGAAGCTGGAAAAGCTCAGCTTCGAAGAAATGCTGGAACTTGCTGCTGTTGGC840TCCAAGATTTTGGTGCTGCGCAGTGTTGAATACGCTCGTGCATTCAATGTGCCACTTCGC900GTACGCTCGTCTTATAGTAATGATCCCGGCACTTTGATTGCCGGCTCTATGGAGGATATT960CCTGTGGAAGAAGCAGTCCTTACCGGTGTCGCAACCGAGAAGTCCGAAGCCAAAGTAACC1020GTTCTGGGTATTTCCGATAAGCCAGGCGAGGCTGCCAAGGTTTTCCGTGCGTTGGCTGAT1080GCAGAAATCAACATTGACATGGTTCTGCAGAACGTCTCCTCTGTGGAAGACGGCACCACC1140GACATCACGTTCACCTGCCCTCGCGCTGACGGACGCCGTGCGATGGAGATCTTGAAGAAG1200CTTCAGGTTCAGGGCAACTGGACCAATGTGCTTTACGACGACCAGGTCGGCAAAGTCTCC1260CTCGTGGGTGCTGGCATGAAGTCTCACCCAGGTGTTACCGCAGAGTTCATGGAAGCTCTG1320CGCGATGTCAACGTGAACATCGAATTGATTTCCACCTCTGAGATCCGCATTTCCGTGCTG1380ATCCGTGAAGATGATCTGGATGCTGCTGCACGTGCATTGCATGAGCAGTTCCAGCTGGGC1440GGCGAAGACGAAGCCGTCGTTTATGCAGGCACCGGACGCTAAAGTTTTAAAGGAGTAGTT1500TTACAATGACCACCATCGCAGTTGTTGGTGCAACCGGCCAGGTCGGCCAGGTTATGCGCA1560CCCTTTTGGAAGAGCGCAATTTCCCAGCTGACACTGTTCGTTTCTTTGCTTCCCCGCGTT1620CCGCAGGCCGTAAGATTGAATTC1643(22)SEQIDNO22的资料(i)序列特征(A)长度23个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他..合成DNA(iv)反义无(xi)序列描述SEQIDNO22GGATCCCCAATCGATACCTGGAA23(23)SEQIDNO23的资料(i)序列特征(A)长度23个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他..合成DNA(iv)反义有(xi)序列描述SEQIDNO23CGGTTCATCGCCAAGTTTTTCTT23(24)SEQIDNO24的资料(i)序列特征(A)长度2001个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型基因组DNA(iv)反义无(vi)来源(A)生物乳酸发酵短杆菌(B)菌株ATCC13869(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置730..1473(xi)序列描述SEQIDNO24GGATCCCCAATCGATACCTGGAACGACAACCTGATCAGGATATCCAATGCCTTGAATATT60GACGTTGAGGAAGGAATCACCAGCCATCTCAACTGGAAGACCTGACGCCTGCTGAATTGG120ATCAGTGGCCCAATCGACCCACCAACCAGGTTGGCTATTACCGGCGATATCAAAAACAAC180TCGCGTGAACGTTTCGTGCTCGGCAACGCGGATGCCAGCGATCGACATATCGGAGTCACC240AACTTGAGCCTGCTGCTTCTGATCCATCGACGGGGAACCCAACGGCGGCAAAGCAGTGGG300GGAAGGGGAGTTGGTGGACTCTGAATCAGTGGGCTCTGAAGTGGTAGGCGACGGGGCAGC360ATCTGAAGGCGTGCGAGTTGTGGTGACCGGGTTAGCGGTTTCAGTTTCTGTCACAACTGG420AGCAGGACTAGCAGAGGTTGTAGGCGTTGAGCCGCTTCCATCACAAGCACTTAAAAGTAA480AGAGGCGGAAACCACAAGCGCCAAGGAACTACCTGCGGAACGGGCGGTGAAGGGCAACTT540AAGTCTCATATTTCAAACATAGTTCCACCTGTGTGATTAATCTCCAGAACGGAACAAACT600GATGAACAATCGTTAACAACACAGACCAAAACGGTCAGTTAGGTATGGATATCAGCACCT660TCTGAATGGGTACGTCTAGACTGGTGGGCGTTTGAAAAACTCTTCGCCCCACGAAAATGA720AGGAGCATAATGGGAATCAAGGTTGGCGTTCTCGGAGCCAAAGGCCGT768MetGlyIleLysValGlyValLeuGlyAlaLysGlyArg1510GTTGGTCAAACTATTGTGGCAGCAGTCAATGAGTCCGACGATCTGGAG816ValGlyGlnThrIleValAlaAlaValAsnGluSerAspAspLeuGlu152025CTTGTTGCAGAGATCGGCGTCGACGATGATTTGAGCCTTCTGGTAGAC864LeuValAlaGluIleGlyValAspAspAspLeuSerLeuLeuValAsp30354045AACGGCGCTGAAGTTGTCGTTGACTTCACCACTCCTAACGCTGTGATG912AsnGlyAlaGluValValValAspPheThrThrProAsnAlaValMet505560GGCAACCTGGAGTTCTGCATCAACAACGGCATTTCTGCGGTTGTTGGA960GlyAsnLeuGluPheCysIleAsnAsnGlyIleSerAlaValValGly657075ACCACGGGCTTCGATGATGCTCGTTTGGAGCAGGTTCGCGCCTGGCTT1008ThrThrGlyPheAspAspAlaArgLeuGluGlnValArgAlaTrpLeu808590GAAGGAAAAGACAATGTCGGTGTTCTGATCGCACCTAACTTTGCTATC1056GluGlyLysAspAsnValGlyValLeuIleAlaProAsnPheAlaIle95100105TCTGCGGTGTTGACCATGGTCTTTTCCAAGCAGGCTGCCCGCTTCTTC1104SerAlaValLeuThrMetValPheSerLysGlnAlaAlaArgPhePhe110115120125GAATCAGCTGAAGTTATTGAGCTGCACCACCCCAACAAGCTGGATGCA1152GluSerAlaGluValIleGluLeuHisHisProAsnLysLeuAspAla130135140CCTTCAGGCACCGCGATCCACACTGCTCAGGGCATTGCTGCGGCACGC1200ProSerGlyThrAlaIleHisThrAlaGlnGlyIleAlaAlaAlaArg145150155AAAGAAGCAGGCATGGACGCACAGCCAGATGCGACCGAGCAGGCACTT1248LysGluAlaGlyMetAspAlaGlnProAspAlaThrGluGlnAlaLeu160165170GAGGGTTCCCGTGGCGCAAGCGTAGATGGAATCCCAGTTCACGCAGTC1296GluGlySerArgGlyAlaSerValAspGlyIleProValHisAlaVal175180185CGCATGTCCGGCATGGTTGCTCACGAGCAAGTTATCTTTGGCACCCAG1344ArgMetSerGlyMetValAlaHisGluGlnValIlePheGlyThrGln190195200205GGTCAGACCTTGACCATCAAGCAGGACTCCTATGATCGCAACTCATTT1392GlyGlnThrLeuThrIleLysGlnAspSerTyrAspArgAsnSerPhe210215220GCACCAGGTGTCTTGGTGGGTGTGCGCAACATTGCACAGCACCCAGGC1440AlaProGlyValLeuValGlyValArgAsnIleAlaGlnHisProGly225230235CTAGTCGTAGGACTTGAGCATTACCTAGGCCTGTAAAGGCTCATTTCAGCAGC1493LeuValValGlyLeuGluHisTyrLeuGlyLeu240245GGGTGGAATTTTTTAAAAGGAGCGTTTAAAGGCTGTGGCCGAACAAGTTAAATTGAGCGT1553GGAGTTGATAGCGTGCAGTTCTTTTACTCCACCCGCTGATGTTGAGTGGTCAACTGATGT1613TGAGGGCGCGGAAGCACTCGTCGAGTTTGCGGGTCGTGCCTGCTACGAAACTTTTGATAA1673GCCGAACCCTCGAACTGCTTCCAATGCTGCGTATCTGCGCCACATCATGGAAGTGGGGCA1733CACTGCTTTGCTTGAGCATGCCAATGCCACGATGTATATCCGAGGCATTTCTCGGTCCGC1793GACCCATGAATTGGTCCGACACCGCCATTTTTCCTTCTCTCAACTGTCTCAGCGTTTCGT1853GCACAGCGGAGAATCGGAAGTAGTGGTGCCCACTCTCATCGATGAAGATCCGCAGTTGCG1913TGAACTTTTCATGCACGCCATGGATGAGTCTCGGTTCGCTTTCAATGAGCTGCTTAATGC1973(25)SEQIDNO25的资料(i)序列特征(A)长度45个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他..合成DNA(iv)反义无(xi)序列描述SEQIDNO25CCGGACAGCTCACCCACAAAATCAATGCACTCTAAAAAGGTACCT45(26)SEQIDNO26的资料(i)序列特征(A)长度45个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他..合成DNA(iv)反义有(xi)序列描述SEQIDNO26CTAGAGGTACCTTTTTAGAGTGCATTGATTTIGTGGGGTGAGCTGT45(27)SEQIDNO27的资料(i)序列特征(A)长度34个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他..合成DNA(iv)反义无(xi)序列描述SEQIDNO27CTAGCTCGAGATATCAGATCTACTAGTCGACCGC34(28)SEQIDNO28的资料(i)序列特征(A)长度28个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他..合成DNA(iv)反义有(xi)序列描述SEQIDNO28GGTCGACTAGTAGATCTGATATCTCGAG28图1表示各种人工转座子的结构。Kmr表示新霉素磷酸转移酶基因(卡那霉素抗性基因)，Tnp表示转座酶基因。黑色部分表示反向重复序列。图2说明分别含有人工转座子的质粒pHTN7141和pHTN7142的构建。图3说明含人工转座子的质粒pHTN7143的构建。图4说明含人工转座子的质粒pHTN7144构建。图5说明质粒pHTN714K1和pHTN714K2构建。图6说明含人工转座子的质粒pHTN7145构建。图7说明含人工转座子的质粒pHTN7151构建。图8说明含人工转座子的质粒pHTN7152构建。图9说明含人工转座子的质粒pHTN7156-C构建。图10说明质粒pORF1的构建。图11说明质粒pORF3和pORF4的构建。图12说明质粒pORF7的构建。图13说明质粒pORF8的构建。图14说明含转座子单元的质粒pORF41的构建。图15说明质粒pORFCO的构建。图16说明插入序列，人工转座子和转座子单元之间的差异。TCr指四环素抗性基因，Tnp指转座酶基因，黑框指反向重复序列(IR)。在结构图下划线的点部分表示被转座的部分。图17说明质粒pORF40的构建。图18说明质粒pVK7的构建。图19说明质粒pVC7的构建。图20说明质粒p399LYSA和质粒p299LYSA的构建。图21说明质粒pABLm的构建。图22说明质粒pCRDAPA的构建。图23说明质粒p399DPS的构建。图24说明质粒p399AK9的构建。图25说明质粒pCRDAPB的构建。图26说明质粒p399CAB和pCAB的构建。图27说明质粒pCABL的构建。图28说明质粒pHTN150A的构建。图29说明质粒pCBLmc的构建。图30说明质粒pHTN7150的构建。权利要求1扩增所需基因的方法，包括形成人工转座，所述人工转座含有在反向重复系列之间插入了药物抗性基因和所需的基因的结构并且在棒状杆菌细胞内是可转座的，将所述的人工转座子转入棒状杆菌细胞，将所述转座子转座到所述棒状杆菌的染色体中，然后转导并扩增在所述染色体中的所述基因。2权利要求1的方法，其中所述人工转座子还含有转座酶位于反向重复序列之间的结构。3权利要求1或2的方法，其中所述反向重复序列和转座酶基因来自棒状杆菌的插入序列。4权利要求3的方法，其中所述插入序列为序列表中SequenceNo.1、5或9中任一个所代表的碱基序列。5权利要求1至4中任一项的方法，其中所述药物抗性基因是氯霉素抗性基因或四环素抗性基因。6权利要求1至5中任一项的方法，其中所需基因是参与氨基酸生物合成的基因。7权利要求6的方法，其中所需基因是天冬氨酸激酶基因和/或二氢吡啶羧酸合成酶基因。8用权利要求1至7中的任一方法，将所需基因导入染色体而形成的棒状杆菌。9生产氨基酸的方法，包括在培养基中培养用权利要求6的方法，将参与氨基酸生物合成的基因导入染色体而形成的棒状杆菌，以便在培养基中形成并积累氨基酸，然后回收所述氨基酸。10权利要求9的方法，其中参与氨基酸生物合成的基因是天冬氨酸激酶基因和/或二氢吡啶羧酸合成酶基因，而且所述氨基酸是赖氨酸。全文摘要构建扩增在棒状细菌染色体中的所需基因的方法，包括，形成药物抗性基因和所需基因插入棒状细菌的插入序列中的人工转座子，将所说的人工转座子导入棒状细菌中。效果根据本发明的方法，可以在工业化生产氨基酸或核酸的棒状细菌的染色体中扩增所需的基因，可以改善所说的棒状细菌的育种。文档编号C12N1/21GK1163937SQ96111709公开日1997年11月5日申请日期1996年6月29日优先权日1995年6月30日发明者守屋美加,松井裕,横关健三,平野圣子,早川敦,泉井正子,杉本雅一申请人:味之素株式会社