专利名称：：细胞质雄性不育甘蓝植株和获得这种植株的方法
技术领域：
：本发明涉及一种细胞质雄性不育甘蓝(Brassicaoleracea)植株，即这种植株的新亲本系的开发。本发明还涉及获得所说的雄性不育植株的方法，和从该新亲本系获得的杂交种子。芥属(Brassica)作物作为粮食作物已经栽培了几个世纪，其种子内含物是各种各样粮食产品的基础(植物油，芥子等)。从1970年起芥属蔬菜作物一直作为杂交种子出售。这种种子产生杂交甘蓝属植株，它是两个强近交亲本系的杂交产物并结合了两个亲本系的遗传特性。如果一个或两个亲本系(部分地)自花传粉，必须采取措施防止自花传粉以获得纯的杂交甘蓝属植株。一种抗自花传粉方法是利用两个亲本系中之一的所谓的自交不亲合性。以这种方法可以阻止可育花粉在特定植株的雌蕊中生长，包括产生花粉的甘蓝属植株的雌蕊本身。这种方法的一个缺点是在某些情况下自花传粉还会发生。结果是产生的种子近交百分率很高。另外一个防止亲本系中之一发生自花传粉的方法是基于使用细胞质雄性不育(CMS)。在小萝卜(Raphanussativus)中发现一种可以诱导雄性不育的细胞质，这种细胞质还称为OguraCMS细胞质。通过原生质体融合将OguraCMS细胞质的线粒体导入甘蓝植株，而细胞核来源于正常可育的甘蓝植株，以这种途径获得CMS甘蓝植株。通过融合除去OguraCMS细胞质中的叶绿体，这些叶绿体包含负责具有这种细胞质的植株的低温敏感性的DNA。本发明的目的是获得一种细胞质雄性不育的甘蓝植株，其中前面提到的现有技术方法的不利之处被克服了，并由此给出了OguraCMS细胞质一种替换物，为了达到此目的，通过原生质体融合，使此植株的细胞质带有包含起源于(至少部分如此)Brassicanapus植株、并与细胞质雄性不育(的性质)相伴的，换言之，负责甘蓝植株中的细胞质雄性不育的DNA的线粒体。进一步的研究令人吃惊地显示，尽管B.napus植株是正常可育的，通过使用来源于B.napus植株的正常线粒体DNA，原生质体融合可以在甘蓝植株中有效地诱导细胞质雄性不育。上面提到的原生质体融合最好用来源于B.napus的叶片原生质体(供体)和来源于甘蓝植株的下胚轴原生质体(受体)来实现。在一个本发明的较佳实施方案中，甘蓝植株的细胞质进一步带有对该植株正常的种特异性核基因组。这使得它成为一个100％纯的产品。在本发明的另一个实施方案中，细胞包括B.napus的种特异性线粒体。在本发明的一个进一步的实施方案中，通过体细胞杂交导入种特异性的线粒体。在细胞融合中，接收细胞质的植物的核编码遗传成分保持不变(最好保持完整性)。因为可以一次获得具有期望成分的细胞质，所以不需要回交。在实践中，显而易见的是，原生质体融合后获得的甘蓝植株经常是四倍体或非整倍体。由此倍性水平可以增加到超过10倍C，C为单倍体基因组。非二倍体基因组的植株的特征在于其生长的不同以及雄性和雌性不育的发生。使用流式细胞计量术去除所有的通过融合获得的甘蓝植株群体中的非纯二倍体植株。此融合过程后，将二倍体植株进行分子水平分析；通过此分析确定包含已知遗传上与CMS紧密相关的线粒体DNA(或其片段)的植株。在本发明的一个进一步的实施方案中，甘蓝植株是选自由下列组成的集合●花椰菜(B.oleraceaL.convar.botrytis(L.)Alef.var.botrytisL.)，●花茎甘蓝(B.oleraceaL.convar.botrytis(L.)Alef.var.cymosaDuch.)，●Romanesco(B.oleraceaL.convar.botrytis(L.)Alef.var.botrytisL.)，●球芽甘蓝(B.oleraceaL.convar.oleraceavar.gemniferaDC.)，●白甘蓝(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.albaDC.)，●牛心甘蓝(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.albaDC.)，●红甘蓝(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.rubraDC.)，●皱叶甘蓝(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.sabaudaL.)，●芜菁甘蓝(B.oleraceaL.convar.acephala(DC.)Alef.var.gongyloides)，●卷叶羽衣甘蓝(B.oleraceaL.convar.acephala(DC.)Alef.var.sabellicaL.)，●葡萄牙甘蓝(B.oleraceavar.tronchudasyncostata)。本发明还涉及本发明的植株的种子或植株的一部分。本发明进一步涉及一种甘蓝植株的细胞，其细胞质通过原生质体融合而带有包含至少部分起源于B.napus植株并与细胞质雄性不育(CMS)(的特性)相伴(即负责甘蓝植株中的细胞质雄性不育)的DNA的线粒体。杂交细胞包括作为细胞质雄性不育(CMS)载体的线粒体DNA。本发明还涉及产生一种甘蓝植株的方法，包括通过原生质体融合将包含至少部分起源于B.napus植株并与细胞质雄性不育(CMS)(的特性)相伴(即负责甘蓝植株中的细胞质雄性不育)的DNA的线粒体提供给其细胞质的步骤。将B.napus植株(供体)和甘蓝植株(受体)来源的种子消毒并在MS30培养基或类似的培养基上发芽；对供体来说此步骤在光下进行，通过剪下枝条并将其置于新鲜的生长培养基上而使植株生长。受体的种子在黑暗中发芽；从黄化的胚上取下胚轴以供使用。预质壁分离处理后用细胞壁溶解酶如果胶酶和纤维素酶处理叶片和/或下胚轴材料以分离原生质体；此步骤在一个质壁分离溶液中进行。过滤并离心后，用γ射线照射供体的原生质体。受体的原生质体用IOA处理，然后将两组原生质体融合。融合过程中用PEG试剂加强凝集作用；融合过程中的高pH值是重要的。融合过程中，不能搅动原生质体以避免影响融合进程。融合操作后洗掉PEG溶液并用再生培养基替换。原生质体的再生在此培养基中进行，诸如蔗糖的糖类和诸如2，4-D，BA和NAA的激素等的存在具有决定性的重要作用。再生过程中通过相应地加入含较低浓度蔗糖的培养基逐步降低再生培养基的渗透压。将长出的小愈伤组织转移到固体再生培养基上。每两星期将所说的愈伤组织转移到新鲜的再生培养基上。新长出的茎叶置于生根培养基上，其中通过诸如IAA的植物激素增强生根作用。通过取叶片样品并用流式细胞计测定细胞核的相对DNA含量来检测再生植株的倍性水平。保留包含纯二倍体基因组的植株，其它植株弃掉。用分子技术的方法进一步分析保留的植株。使用从叶片样品中分离的DNA和线粒体DNA特异性的探针，探查是否这些植株中存在所需的线粒体。将包括受体植株细胞质的植株(被认为是漏网者)弃掉。在温室和大田条件下通过交配繁殖保留的植株并研究其实用性。诸如不育，种子形成和植株质量的问题受到特别关注。附图简述图1为来自甘蓝、作为可育供体的B.napus、具有ogura细胞质的甘蓝、具有anand细胞质的油菜、具有polima细胞质的B.napus和具有来自可育B.napus的线粒体的甘蓝的细胞质的偶联荧光图。用一个DNA探针进行杂交，此探针由从表现型为不育(CMS)植株中分离出来并经EcoRI消化后克隆到大肠杆菌中的线粒体DNA片段组成。此条带的特征为用EcoRI可以将其从大肠杆菌质粒DNA上切下来并以特定的方式与甘蓝来源的线粒体DNA杂交。图中，泳道1为分子量标记物，由上至下依次为21226bp，7421bp，5804bp，5643bp，4878bp，3530bp(λDNA∷EcoRI；BoehringerMannheim)；泳道2为作为供体的可育的B.napus；泳道3为具有ogura的甘蓝；泳道4为作为受体的甘蓝，上端的条带有时不存在，这取决于洗涤步骤的严格性；泳道5为融合产生的具有CMS的甘蓝植株，其具有泳道2的供体的带型；泳道6为融合产生的具有CMS的甘蓝植株，其具有泳道2的供体和泳道4的受体的联合带型，因此，这种植株是不育的且还显示具有CMS特性；泳道7为具有anand细胞质的油菜(来自芥菜背景)；泳道8为具有polima细胞质的B.napus；泳道9为具有ogura细胞质的甘蓝(＝泳道3)；泳道10为分子量标记物，由上至下依次为21226bp，7421bp，5804bp，5643bp，4878bp，3530bp(λDNA∷EcoRI；BoehringerMannheim)。用下面的实施例作参考，本发明将进一步被阐述，这些实施例都是本发明的较佳实施方案。实施例1种子的表面消毒将甘蓝(B.oleracea)的种子包在滤纸中并浸入含70％乙醇/30％水的混合物中10秒钟；然后浸入55℃无菌水5分钟。接着用0.3％(w/v)NaOCl+Tween80处理20分钟；此处理在层流箱内进行。此处理结束后，将种子包用无菌水洗涤3次，分别为5，5和10分钟。实施例2制备下胚轴原生质体用的亲本(起始)材料的播种最后一次洗涤步骤后，打开种子包并置于容器中的1/2MS15培养基上。将容器保持在25℃的黑暗条件中。约7天后，下胚轴即可用于原生质体分离。实施例3制备叶片原生质体用亲本(起始)材料的播种按实施例2的方法播种消毒的种子。将容器置于25℃的光照条件下。14-18天后，植株叶片即可用于原生质体分离；将植株的茎尖置于新鲜的BB上；将容器置于25℃的光照条件下。完全生长的叶片用于原生质体分离。实施例4原生质体分离将叶片和下胚轴材料切成小块并置于含一薄层质壁分离溶液(12ml)的玻璃培养皿(直径11cm)或TC品质的培养皿(直径9cm)中。所说的剪切后，加入另外12ml的质壁分离溶液。将培养皿包在锡箔中并置于层流箱中至少一个小时。所说的一个小时后，用约24ml的新鲜酶溶液替换质壁分离溶液。将培养皿在锡箔中25℃过夜保存；制备下胚轴原生质体的酶混合物放在一个振荡器上，而制备叶片原生质体的酶混合物不能放在振荡器上。将振荡器设为30rpm，振幅15mm。温育后将悬浊物用两个尼龙过滤膜在Teflon滤膜架上过滤，滤膜孔径相应为110μm和53μm。用1/3体积的CPW16(±8ml)重新冲洗滤膜。将悬浊物在110×g离心5分钟。形成的含有原生质体的小带用无菌巴斯德吸管吸取并转移到一个新的离心管中。小心加入9ml的W5后将原生质体悬浊物在75×g离心5分钟。将叶片原生质体进一步用下述步骤处理倒掉每个离心管的上清并将沉淀物重新悬浮在1-2ml的W5中。合并不同离心管的内含物，并加入W5至总体积为10ml。将含有原生质体(供体)的离心管用Parafilm膜封闭，包裹在锡箔中并置于冰上直到用50kRad射线照射。下胚轴原生质体用下述步骤处理倒掉每个离心管的上清并将沉淀物重新悬浮在1-2ml的W5+2mMIOA(4℃)中。合并不同离心管的内含物并用W5+2mMIOA补加至总体积为10ml，接下来在4℃冰箱中保温10分钟。此处理后将悬浊物在75×g离心5分钟(因此，在IOA中总的保温时间是15分钟)。将沉淀物重新悬浮在1-2ml的W5中并用W5补加至总体积为10ml，然后将其转移到一个无菌的50ml烧瓶中。在原生质体接受照射时，此烧瓶用锡箔包裹，在振荡器上(约30rpm；振幅15mm)于25℃温育。然后将烧瓶中的内含物转移到一个离心管中。有叶片和下胚轴原生质体的两个离心管在75×g离心5分钟，然后将沉淀物重新悬浮在1-3ml的W5中。原生质体悬浊物的密度用血球计数板测定。实施例5原生质体融合两个悬浮原生质体的原生质体以9.105原生质体/ml的密度混合以进行融合。用一个微升吸管将40μl的液滴转移到培养皿中。在一个直径6cm的培养皿中加11滴40μl的液滴或在一个直径9cm的培养皿中加25滴40μl的液滴。盖上培养皿的盖子，然后关掉光线并关掉层流箱15分钟以使原生质体粘附在培养皿的底部。再打开层流箱并在每滴原生质体中加入60μl的PEG溶液。3-5分钟后在培养皿中加入下列数量的SVI4ml到一个直径6cm培养皿9ml到一个直径9cm培养皿3-5分钟后吸去溶液并加入SVII4ml到一个直径6cm培养皿9ml到一个直径9cm培养皿3-5分钟后吸去溶液并小心加入8p4ml到一个直径6cm培养皿9ml到一个直径9cm培养皿为了防止原生质体过早地从培养皿的底部释放出来，小心地加入8p培养基是重要的。3-5分钟后吸去8p培养基并加入新的8p培养基。现在原生质体可以从培养皿的底部释放下来4ml到一个直径6cm培养皿9ml到一个直径9cm培养皿用Parafilm膜封闭培养皿并在约500lux的光照下存放。实施例6再生在融合后的第8天，以至多为原始体积的三倍的数量在培养皿中加入8pA，即8ml到一个直径6cm培养皿18ml到一个直径9cm培养皿将培养皿置于光照下。在融合后的第15天，用一个无菌的刮铲小心刮下在培养皿底部长出的小愈伤组织。用一个10ml吸管将培养皿中的内含物分配到4个离心管中并在75×g离心5分钟。同时在4个新的培养皿中加入6ml的K3PPS-V培养基。离心后弃掉上清并在沉淀物上加入6ml的K3PPS-V培养基。沉淀物由分散的细胞和小愈伤组织组成且可以容易地在K3PPS-V培养基中重新悬浮。用一个10ml吸管吸取培养基和沉淀物并加入培养皿中。从融合后的第21天开始，长出的小愈伤组织从K3PPS-V培养基转移到K3PPS-R培养基中温育。每两星期将正在生长的(小)愈伤组织转移到新鲜的K3PPS-R培养基中。一旦愈伤组织出现茎尖发育，就将其转移到有K3PPS-R培养基的容器中。只要茎尖长到足够大，就收获并置于生根培养基(BB培养基)中。实施例7流式细胞计测量取待分析植株的±1cm2的叶片样品并置于2ml的DAPI溶液中。用锋利的剃刀刀片将此样品切成小块并通过一个15μm过滤器过滤。根据DeLaatetal.的方法用PartecCA-II细胞分析仪测定此样品。通过比较融合植株和二倍体植株DNA的峰位置来测定植株的相对DNA含量。实施例8分子水平测定通过体细胞杂交获得的具有细胞质雄性不育的B.oleracea植株可以用一个DNA探针从具有不同细胞质的甘蓝植株(包括具有ogura，anand或polima细胞质的不同甘蓝种)中区分出来。此探针由从表现型为不育(CMS)植株中分离出来并经EcoRI消化后克隆到大肠杆菌中的线粒体DNA片段组成。此条带的特征为用EcoRI可以将其从大肠杆菌质粒DNA上切下来并以特定的方式与甘蓝来源的线粒体DNA杂交(参见图示)。将200mg待分析植株的叶片材料收集在一个反应管中并用液氮冷冻。在这些管中加入750μl提取缓冲液并用一个Potterstick搅匀。将样品在13000×g离心10分钟，小心弃掉包括绿色材料的上清。在沉淀物中加入125μl提取缓冲液，重新悬浮后加入135μl裂解缓冲液和60μl月桂酰肌氨酸溶液。简单混合后将混合物加热到65℃20分钟。加入375μl氯仿/异戊醇并摇动反应管至少40次。13000×g离心10分钟，如有必要将上层转移到一个新的反应管中并重复一次CHCl3/IAA步骤。最后，加入500μl异丙醇并摇动反应管几次。13000×g离心5分钟。将沉淀物重新悬浮于500μl的TE缓冲液中。用限制性内切酶消化DNA按下列步骤进行RFLP分析需要约4μgDNA。限制酶反应的最终溶液由0.1体积的通用酶切缓冲液，如One-Phor-AllBufferPLUS(Pharmacia)，4μgDNA，4mM亚精胺和2单位的限制酶组成。37℃温育至少3小时。通过从贮液中改变EDTA浓度到10mM来终止反应。通过加入0.1体积的3MNaAc和2.5体积-20℃的乙醇沉淀DNA。此混合物保持在-20℃2小时；10000×g离心10分钟后，用预冷的70％乙醇/水洗涤沉淀物，干燥并溶解于TE缓冲液中。待分离DNA片段的琼脂糖凝胶电泳按下列步骤进行称取2g琼脂糖并在250ml的TAE缓冲液中煮沸。冷却至微温温度时加入溴乙啶至终浓度为0.5mg/l。倒胶并冷却至凝固。将样品与上样缓冲液混合并分离DNA片段。当前沿标记BFB到达距凝胶的末端约1cm时停止电泳。为了准备杂交，将凝胶按下述处理。0.25MHCl(1×)中5分钟0.5MNaOH/1.5MNaCl(2×)中15分钟1MNH4Ac/20mMNaOH(2×)中10分钟将Hybond膜(Amersham)切成与凝胶同样大小，在2×SSC中浸没几秒钟然后在1MNH4Ac/20mMNaOH中浸湿。将3张Whatman3MM滤纸切成此大小。制作一个装置使DNA通过液体转运4小时从凝胶转移到膜上。转移在1MNH4Ac/20mMNaOH中进行。在膜干燥后，通过用UV照射1分钟DNA即结合到膜的两面上。所需的DNA探针按下列标记通过在95℃加热10分钟并迅速置于冰上冷却来变性转移的DNA。将下列物质在一个反应管中混合10ng-3μgDNA2μl六核苷酸混合物2μldNTP’s(带有地高辛配基-dUTP)1μlKlenow聚合酶混合后37℃温育过夜。加入2μl的3MNaAc和44μl的乙醇(96％)沉淀DNA。将混合物置于-20℃30分钟。10000×g离心15分钟后，用溶于水的70％乙醇(v/v)洗涤沉淀，干燥的沉淀溶于50μl的TE。标记片段与膜的杂交将膜置于2×SSC几秒钟。然后将膜用20ml预杂交混合物封闭于一个杂交袋中。将膜在60-65℃温育至少1小时。弃掉预杂交混合物，用4ml杂交混合物替换并温育过夜。温育后洗涤膜洗涤溶液1中4次2分钟；洗涤溶液2中4次2分钟，洗涤溶液3(60-65℃)中2次15分钟。标记条带的检测在室温下进行，杂交膜用漂洗缓冲液1冲洗，然后用每100cm2膜10ml漂洗缓冲液2封闭。在振荡器上温育30分钟后，用每100cm2膜15mlanti-dig溶液替换漂洗缓冲液2。在振荡器上温育30分钟后，在漂洗缓冲液2中洗涤膜2-3次10分钟；漂洗缓冲液1中洗涤3-4次10分钟，并在漂洗缓冲液3中洗涤1次。用每100cm2膜10ml的AMPPD溶液温育膜20分钟。将膜置于一个顶端有Polaroid胶片的盒中；曝光后，移走胶片并冲洗。实施例9具有来源于Brassicanapus的线粒体的一个细胞质雄性不育甘蓝的花表现型的描述花序花的主轴朝向顶端，有时缩短或扁化成一束，经常分枝。花苞很少出现，有时是翻转的和卷曲的。花柄有时缩短或扁化成一束。花芽经常关闭，有时开放，萼片侧面互不相连且是折叠的。膨胀表面光滑，顶端绝大多数是裹起来的，有时是出尖的。雌蕊经常生长在顶端以外。花萼片1-4mm宽，4-12mm长，直立，经常有些翻转，边缘有时向内弯曲，顶端向内弯曲。存在蜜腺。花瓣4个，有时多倍于此多至40个；4-7mm宽，11-19mm长。多于4时内层花瓣经常是更短一些。喙甲可能看上去扁化成一个管子。花板主要不是向回弯曲，经常是强烈地向侧面卷曲，有时是强烈地翻转。颜色上侧面白色或黄色RHS2A-3A-2C-3C-4A-5A-5B-6A，下侧面白色或黄色RHS2A-2B-2C-3A-3C-4B-4C-4A，顶端的侧面经常平滑，有时是齿状的。雄蕊6到2，且在此情况时有时扁化2个2次，长度至花瓣的一半，有时与花瓣等长。花药，小且为三角形，无花粉。一个雌蕊，有时多至3个，其中一个长于其它的，主要是直立，没有授粉时经常生长至长度约为30mm。喙和雌蕊有时弯曲，有时轻微隆起。子房经常翻转和卷曲。在花束顶端的花有时几乎没有花瓣，萼片和雄蕊且子房强烈翻转或卷曲，或看上去扁化2个2次；沿着扁化缝有开口，叶片以平行脉状排列在苞片上。细胞融合所需的溶液</tables>细胞生物学所用的其它溶液酶溶液溶于K3PPS-I的1％(w/v)纤维素酶R-10溶于K3PPS-I的0.1％(w/v)果胶酶pH＝5.6PEG溶液PEG1500266.7mM葡萄糖300mMCaCl2.2H2O50mMpH＝7.0SVI50mlPEG溶液+100ml预质壁分离溶液SVII20mlPEG溶液+100ml预质壁分离溶液IOA(碘化乙酰胺)2mMIOA溶于W5；pH＝5.6溶于MilliQ纯化水的1％琼脂糖溶液。分子生物学用溶液提取缓冲液350M山梨醇100mMTris-碱5mMEDTA加新鲜的20mM硫酸氢钠裂解缓冲液20mMTris-碱50mMEDTA2MNaCl2％(w/v)CTABN-月桂酰肌氨酸，Na盐10％(w/v)氯仿/异戊醇24∶1(v∶v)异丙醇TE10mMTris-HCl；pH8.01mMEDTA4mM亚精胺EDTA贮液1M3MNaAc乙醇96％70％乙醇/水v/v溴乙锭溶液10mg/ml水TAE缓冲液4.84gTris碱/l1.14ml乙酸10mMEDTA；pH8.0上样缓冲液24％Ficoll4000.1％SDS0.1％二甲苯蓝0.1％溴酚蓝0.25MHCl0.5MNaOH/1.5MNaCl1MNH4Ac/20mMNaOH2×SSC30mM二水柠檬酸钠；pH7.2300mMNaCl0.2×SSC10×稀释的2×SSC0.1×SSC20×稀释的2×SSC六核苷酸混合物10×BoehringerMannheim的浓缩六核苷酸混合物dNTP0.1mMdATP0.1mMdCTP0.1mMdGTP0.1mMdTTP0.35mM地高辛配基-dUTP(Boehringer)封闭试剂BoehringerMannheim；货号1175041预杂交混合物75mM柠檬酸钠750mMNaCl0.5％封闭试剂0.1％N-月桂酰肌氨酸(w/v)0.2％SDS杂交混合物75mM柠檬酸钠750mMNaCl0.5％封闭试剂0.1％N-月桂酰肌氨酸0.2％SDS40-50ng地高辛配基-dUTP标记的探针/ml洗涤溶液12×SSC+0.1％(w/v)SDS洗涤溶液20.2×SSC+0.1％(w/v)SDS洗涤溶液30.1×SSC+0.1％(w/v)SDS漂洗缓冲液1100mMTris-HClpH7.5150mMNaCl漂洗缓冲液2漂洗缓冲液10.5％封闭试剂(新鲜配制)漂洗缓冲液3漂洗缓冲液150mMMgCl2anti-dig-AP偶联物BoehringerMannheim；货号1175041AMPPD溶液每ml漂洗缓冲液3中10μlAMPPD(0.26μM)所用的缩写2，4D2，4-二氯苯氧乙酸AMPPD3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧己烷-3，21-三环-[3.3.1.13.7]癸}-4-基)苯基磷酸二钠AP酸性磷酸酶BA6-苄氨基嘌呤CMS细胞质雄性不育DIG地高辛配基dATP脱氧腺苷三磷酸dCTP脱氧胞苷三磷酸dGTP脱氧鸟苷三磷酸dNTP脱氧核苷三磷酸dTTP脱氧胸苷三磷酸DUTP脱氧尿苷三磷酸EDTA乙二胺四乙酸g重力加速度(9.8m.sec-2)IOA碘化乙酰胺kRad1000Rad，离子辐射的单位μg微克μl微升mM毫摩尔μM微摩尔M摩尔MSMurashige&SkoogNAA萘乙酸PEG聚乙二醇pH酸度的度量单位rpm每分钟转数SSC柠檬酸钠盐水SDS十二烷基硫酸钠TC组织培养UV紫外线v/v体积/体积w/v重量/体积对几乎所有的处理来说都可以阐明应该保持在哪那个限定的pH值，浓度等范围内和实验应该在那个水平上实施。下面给出了这些溶液/处理的三个水平组织培养用培养基1/2MS15，MS30enBB；诸如蔗糖的糖类；浓度0.5-600mM，正常为200-400mM。pH5-10；正常为5.5-6.0。培养温度22-27℃，正常为25℃。射线照射0-60kRad；正常为50kRad。融合温度20-25℃；通常为22℃。植物激素的浓度0-10μM；正常为0-3μM。权利要求1.甘蓝植株，其细胞质通过原生质体融合而带有包含至少部分起源于B.napus植株并与细胞质雄性不育(CMS)的特性相伴即负责甘蓝植株中的细胞质雄性不育的DNA的线粒体。2.根据权利要求1的甘蓝植株，其细胞带有对此植株为正常的种特异性核基因组。3.根据权利要求1或2的甘蓝植株，其细胞带有对B.napus为正常的种特异性线粒体。4.根据权利要求3的甘蓝植株，其中所说的种特异性线粒体通过体细胞杂交的方法导入。5.根据上述权利要求1-4的任何一个的甘蓝植株，其中供体B.napus植株是正常可育的。6.根据上述权利要求1-5的任何一项的甘蓝植株，选自如下一组●花椰菜(B.oleraceaL.convar.botrytis(L.)Alef.var.botrvtisL.)，●花茎甘蓝(B.oleraceaL.convar.botrvtis(L.)Alef.var.cymosaDuch.)，●Romanesco(B.oleraceaL.convar.botrvtis(L.)Alef.var.botrvtisL.)，●球芽甘蓝(B.oleraceaL.convar.oleraceavar.gemniferaDC.)，●白甘蓝(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.albaDC.)，●牛心甘蓝(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.albaDC.)，●红甘蓝(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.rubraDC.)，●皱叶甘蓝(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.sabaudaL.)，●芜菁甘蓝(B.oleraceaL.convar.acephala(DC.)Alef.var.gongyloides)，●卷叶羽衣甘蓝(B.oleraceaL.convar.acephala(DC.)Alef.var.sabellicaL.)，●葡萄牙甘蓝(B.oleraceavar.tronchudasyncostata)。7.来源于上述权利要求1-6的任何一项的甘蓝植株的种子或植株的一部分。8.甘蓝植株的细胞，其细胞质通过原生质体融合而带有包含至少部分起源于B.napus植株并与细胞质雄性不育(CMS)的特性相伴即负责甘蓝植株中的细胞质雄性不育的DNA的线粒体。9.生产一种甘蓝植株的方法，包括通过原生质体融合将包含至少部分起源于B.napus植株并与细胞质雄性不育(CMS)的特性相伴即负责甘蓝植株中的细胞质雄性不育的DNA的线粒体提供给其细胞质的步骤。全文摘要甘蓝植株,其细胞质通过原生质体融合而带有包括至少部分起源于B.napus植株并与细胞质雄性不育(CMS)的特性相伴即负责甘蓝植株中的细胞质雄性不育的DNA的线粒体,且其细胞带有对此植株为正常的种特异性核基因组。文档编号C12N15/02GK1172579SQ9711241公开日1998年2月11日申请日期1997年5月29日优先权日1996年5月31日发明者彼得·巴滕申请人:贝朱萨登公司