专利名称：β－呋喃果糖苷酶及其基因的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及具有果糖转移酶活性、可用于低聚果糖的工业生产的一种β-呋喃果糖苷酶及其基因和用途。
背景技术：
除了其果糖部分在C1和C2位通过β键与另外一到三个果糖分子偶联外，低聚果糖的分子结构与蔗糖相同。低聚果糖是不可消化的糖，以诸如促进肠道双歧杆菌生长、加速胆固醇和其他脂类的新陈代谢及较少的龋齿发生率之类的生理学优点著称。
低聚果糖见于植物中，例如芦笋、洋葱、菊芋和蜂蜜。它也可以通过新近的工业化大生产技术由蔗糖合成，这种技术应用来源于微生物的β-呋喃果糖苷酶催化的果糖基转移反应。
1-蔗果三糖和霉菌赤藓醛糖构成当今工业生产的低聚果糖混合物的组分，它们除了果糖部分分别与一分子和两分子果糖偶联外，其分子结构与蔗糖相同。最近发现，它们的高纯度晶体在保持低聚果糖的一般生理学优点的同时，在物理性质和食品加工目的两方面，显示了新的合乎需要的特性(日本专利申请1995年第222923号，日本公开公报1994年第31160号)。从这种意义上说，它们是具有新特征的低聚果糖制品。
鉴于以上因素，一些发明者已经提出一种由蔗糖生产结晶1-蔗果三糖的工业方法(日本专利申请1996年第64682号，日本专利申请1996年第77534号，和日本专利申请1996年第77539号)。根据本方法，首先使具有果糖基转移酶活性的β-呋喃果糖苷酶作用于蔗糖，以产生1-蔗果三糖；生成的1-蔗果三糖用层析分离法分级分离得到80％或更高的纯度；然后，用这个级分作为结晶样本，得到的结晶1-蔗果三糖达到95％或更高的纯度。应用于此方法的具有果糖基转移酶活性的β-呋喃果糖苷酶应能从蔗糖高产量地产生1-蔗果三糖，且最小化副产物霉菌赤藓醛糖的量，后者抑制上述层析分离和结晶反应。当前用于低聚果糖混合物的工业生产的衍生自黑曲霉(Aspergillus niger)的酶中，从蔗糖生产1-蔗果三糖的产率约为44％，而7％转变成霉菌赤藓醛糖(日本专利申请1996年第64682号)。这些数据表明，就结晶1-蔗果三糖的工业生产而论，此酶尚需改进。
之后，一些发明者已成功地从娄地青霉(Penicillium roqueforti)和短柄帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)筛选出具有更优良特征的新酶。这些酶能分别将47％和55％的蔗糖转变成1-蔗果三糖，而7％和4％转变成霉菌赤藓醛糖(日本专利申请1996年第77534号，和日本专利申请1996年第77539号)。这些酶在生产率和稳定性方面逊于源自黑曲霉的酶，而且就结晶1-蔗果三糖的工业生产而论尚需改进。
因此，一些发明者已把注意力放在遗传工程方法上以提高这种酶的生产率，分别从娄地青霉和短柄帚霉分离编码β-呋喃果糖苷酶的基因，并进行结构分析(PCT/JP97/00757)。结果，由来自娄地青霉和短柄帚霉的β-呋喃果糖苷酶基因中分别推断出编码成熟蛋白质的565个氨基酸和574个氨基酸的翻译区，而且它们的表达产物像来自黑曲霉的β-呋喃果糖苷酶一样，显示出具有β-呋喃果糖苷酶活性(L.M.Boddy等人，当代遗传学(Curr.Genet.)，24，60-66(1993))。
发明概述发明者们现在发现，在源自一些发明人先前发现的娄地青霉和短柄帚霉的β-呋喃果糖苷酶基因的C-端加上38和39个氨基酸，提高了它的活性。
因此，本发明的目的是提供一种新的β-呋喃果糖苷酶及其基因。
根据本发明的这种新的β-呋喃果糖苷酶是包含SEQ ID No.1或3或其同系物的氨基酸序列的一种多肽。
此外，根据本发明的基因是编码上述多肽的一种DNA。
在来自一些发明者先前发现的上述娄地青霉和短柄帚霉的β-呋喃果糖苷酶基因的C-端加上38和39氨基酸，构建了根据本发明的SEQ ID No.1或3的氨基酸序列。已发现，被一些当前的发明者推测编码C-端氨基酸的β-呋喃果糖苷酶基因的这个区域实际上存在一个内含子，还发现β-呋喃果糖苷酶基因进一步编码C-端的38和39个氨基酸。令人吃惊的是，同未加入这些序列的蛋白质相比，在C-端加入这些氨基酸后β-呋喃果糖苷酶活性明显提高。
附图简述
图1A、B、C和D显示了表达载体pYPEN02和表达载体pYPEN01的构建，前者引入了编码包含SEQ ID No.1氨基酸序列的酶蛋白质的基因，而后者引入了编码包含SEQ ID No.1氨基酸序列从1到565氨基酸序列的酶蛋白质的基因。
图2A和B显示了表达载体pYSCOP02和表达载体pYSCOP01的构建，前者引入了编码包含SEQ ID No.3氨基酸序列的酶蛋白质的基因，而后者引入了编码包含SEQ ID No.3氨基酸序列从1到574氨基酸序列的酶蛋白质的基因。
发明详述β-呋喃果糖苷酶根据本发明的这种多肽包含SEQ ID No.1或3的氨基酸序列。含有SEQID No.1或3氨基酸序列的这种多肽具有β-呋喃果糖苷酶的酶解活性。根据本发明的这种多肽包括如同序列表显示的SEQ ID No.1或3氨基酸序列的同系物。术语“同系物”指的是在SEQ ID Nos.1和3氨基酸序列内插入、替换或删除一个或多个氨基酸、或在其一端或两端加入一个或多个的氨基酸(如一至数个氨基酸)而保留β-呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。这样的同系物能由本领域技术人员参考SEQ ID No.1或3序列选择和生产，而不必进行过分的试验。
含有根据本发明的SEQ ID No.1和3氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶具有高度果糖基转移酶活性，能高效地生产低聚果糖。明确地说，用30wt％或更高浓度的蔗糖溶液作反应底物时，含有SEQ ID No.1氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶的果糖基转移酶活性比其水解活性至少高4倍，含有SEQ IDNo.3氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶的果糖基转移酶活性比其水解活性至少高7倍。而且，在这两种情况下，均有50％或更多的蔗糖转变成低聚果糖。β-呋喃果糖苷酶基因编码根据本发明的β-呋喃果糖苷酶的新基因包含编码SEQ ID Nos.1和3的氨基酸序列或其同系物的DNA序列。
通常，编码给定蛋白质氨基酸序列的核苷酸序列能容易地从称作“密码子表”的参考表中确定。编码SEQ ID No.1或3氨基酸序列的核苷酸序列中多种核苷酸序列是可用的。因此，术语“编码SEQ ID No.1或3氨基酸序列的核苷酸序列”所指的含义包括SEQ ID No.2或4的核苷酸序列，以及包括与上面相同的简并性允许的密码子组成并编码SEQ ID No.1或3氨基酸序列的核苷酸序列。
作为根据本发明的新的基因的优选实例，本发明的优选实施方案提供了包括SEQ ID No.2或4的核苷酸序列的DNA片段。
如上所述，本发明包括SEQ ID No.1或3氨基酸序列的同系物。因此，根据本发明得到的DNA片段包括编码此同系物的核苷酸序列。
确定了根据本发明的DNA片段的核苷酸序列后，根据用于核酸合成的方法可以得到此DNA片段。
根据遗传工程方法，由娄地青霉或短柄帚霉也能获得此序列，娄地青霉IAM7254或短柄帚霉IFO4843更优选。β-呋喃果糖苷酶基因的表达根据本发明的β-呋喃果糖苷酶能在用编码此酶的DNA片段转化的宿主细胞中产生。更确切地说，将编码根据本发明的β-呋喃果糖苷酶的DNA片段，以可在宿主细胞内复制并能表达上述基因的DNA分子的形式引入宿主细胞，尤其是以表达载体的形式以便转化宿主细胞。然后，培养得到的转化体。
因此，本发明提供了包含编码根据本发明的β-呋喃果糖苷酶的基因的DNA分子，尤其是表达载体。通过在载体分子里引入编码根据本发明的β-呋喃果糖苷酶的DNA片段，即可得到此DNA分子。根据本发明的优选实施方案，此载体是质粒。
根据本发明的DNA分子可以通过遗传工程的标准技术制备。
考虑到使用的宿主细胞的类型，应用在本发明中的载体可以恰当地从病毒、质粒、粘粒载体等中选择。例如，λ噬菌体组中的噬菌体或pBR或pUC组中的质粒可用于大肠杆菌(E.coli)宿主细胞，pUB组中的质粒可用于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，以及YEp或YCp组中的载体可用于酵母菌。
为确保对得到的转化体进行选择，包含可选择标志物的质粒是优选的，例如抗药标志物或修补营养缺陷突变的标志物基因。标志物基因的优选实例包括用于细菌宿主细胞的氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和四环素抗性基因；用于酵母菌的N-(5′-磷酸核糖基)-邻氨基苯甲酸酯异构酶基因(TRP1)、乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因(URA3)和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2)；以及用于霉菌的潮霉素抗性基因(hph)、bialophos抗性基因(bar)和硝酸还原酶基因(niaD)。
也优选用作根据本发明的表达载体的DNA分子包含表达β-呋喃果糖苷酶基因所需的核苷酸序列，此序列包括转录和翻译控制信号，例如启动子、转录起始信号、核糖体结合位点、翻译终止信号和转录终止信号。
除了能在宿主中起作用的插入片段上的启动子外，优选的启动子实例包括，诸如用于大肠杆菌的乳糖操纵子(lac)和色氨酸操纵子(trp)的启动子之类的启动子；诸如用于酵母菌的乙醇脱氢酶基因(ADH)、酸性磷酸酶基因(PHO)、半乳糖调控基因(GAL)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GPD)的启动子之类的启动子；以及诸如用于霉菌的α-淀粉酶基因(amy)和纤维二糖水解酶I基因(CBHI)的启动子之类的启动子。
当宿主细胞是枯草芽孢杆菌、酵母菌或霉菌时，使用分泌型载体以允许在细胞外分泌产生的重组β-呋喃果糖苷酶也是有利的。任何具有已建立的宿主-载体系统的宿主细胞都可以利用，优选酵母菌、霉菌等。也优选用PCT/JP97/00757中所述的无β-呋喃果糖苷酶活性的毛霉菌。
通过以下方法可以由上述转化体获得新的重组酶首先，在适宜的条件下培养上述的宿主细胞，用诸如离心的已知技术，从生成的培养物中得到上清液或细胞体；细胞体应进一步悬浮在一种适宜的缓冲液中，然后用冻融、超声处理或研钵使之匀浆化，紧接着通过离心或过滤，分离出包含这种新的重组酶的细胞体提取物。
通过结合用于分离和纯化的标准技术能纯化此酶。诸如此类技术的例子包括，如热处理这一类依靠热耐受差异的方法；如盐沉淀和溶剂沉淀这一类依靠溶解性差异的方法；如透析、超滤和凝胶过滤以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳这一类依靠分子量差异的方法；如离子交换层析这一类依靠电荷差异的方法；如亲和层析这一类依靠特异亲和性的方法；如疏水层析和反相分配层析这一类依靠疏水性差异的方法；以及如等电聚焦这一类依靠等电点差异的方法。应用β--呋喃果糖苷酶生产低聚果糖本发明进一步提供了应用前述的重组宿主或重组β-呋喃果糖苷酶生产低聚果糖的方法。
在根据本发明生产低聚果糖的方法中，将前述的重组宿主或重组β-呋喃果糖苷酶与蔗糖相接触。
只要这种新的重组酶能作用于蔗糖，根据本发明的重组β-呋喃果糖苷酶或重组宿主与蔗糖作用的方式和条件不局限于任何情形。在溶液中发生作用的优选的实施方案如下蔗糖浓度可以在蔗糖能够得到溶解的适宜的范围内选择。然而，考虑到诸如酶的比活性和反应温度的条件，通常浓度应在5％到80％的范围内，最好在30％到70％之间。这种酶作用于蔗糖反应的温度和pH应该优选地经优化以适于此新重组酶的特性。因此，合理的条件是温度约30-80℃，pH约4-10，优选的温度在40-70℃，pH5-7。
可以适当地选择这种新的重组酶的纯化程度。这种酶可以来自转化体培养物或细胞体匀浆物的上清液的形式作为非纯化物使用，也可以经多种纯化步骤加工后作为纯化物使用，或经多种纯化方式加工后作为分离物使用。
此外，用标准技术固定在载体上的此酶的方式同蔗糖相接触。
将这样产生的低聚果糖根据已知的方法从所得溶液中纯化出来。例如，可以加热溶液使酶灭活，用活性碳脱色，然后用离子交换树脂脱盐。
实施例实施例1来自娄地青霉IAM7254的β-呋喃果糖苷酶基因翻译区的确定应用聚合酶链反应技术扩增来自黑曲霉的含β-呋喃果糖苷酶基因的约2kbp的DNA片段，根据标准程序用由黑曲霉ATCC20611获得的染色体DNA作为模板，引物为SEQ ID No.5或6的合成DNA。此DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳得以分级分离，根据标准方法提取、纯化，然后在无菌水中溶解至0.1μg/μl，以制备用作探针的DNA样本。
下一步是制备来自娄地青霉IAM7254的染色体DNA，用EcoRI完全消化约20μg的染色体DNA，接着用琼脂糖凝胶电泳回收大约4kbp的DNA片段。
将回收的大约4kbp(约0.5μg)的DNA片段与1μg的λgt10载体相结合，此载体已先用EcoRI消化，并用磷酸酶处理，用体外包装试剂盒GIGAPACK II Gold(Stratagene L.L.C)包装，然后引入大肠杆菌NM514，来制备文库。
从上述用以制备探针的DNA样本中制备探针。用ECL直接DNA/RNA标记和检测系统(Amershan International)进行斑点杂交，结果在约25000个斑点中4个克隆呈阳性。这些阳性克隆经第二次筛选得到纯化，用来制备噬菌体DNA，然后用限制酶进行分析。结果表明所有的阳性克隆都有约4kbp的相同EcoRI片段。
用限制酶将这个大约4kbp的EcoRI片段再分解为小片段以选择期望的DNA区域，然后将其亚克隆到质粒载体pUC118或pUC119。根据标准方法从这个亚克隆得到质粒DNA，并用ALFredDNA测序仪(Pharmacia)测序如SEQ ID No.7所示。
在这个序列里包含从1695到1744的50个碱基的序列经鉴定为内含子，因为它显示出丝状真菌的典型内含子结构。结果，通过从SEQ ID No.7序列删除内含子，得到了作为蛋白质编码序列的SEQ ID No.2序列。编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1中所示。实施例2在酿酒酵母中来自娄地青霉IAM7254的β-呋喃果糖苷酶基因的表达表达来自娄地青霉的β-呋喃果糖苷酶基因的质粒pYPEN01和pYPEN02按如下方法制备(图1A、B、C和D)。
用EcoRI和SalI消化pYPR2831(H.Horiuchi等，农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)，54，1771-1779，1990)，然后用T4 DNA多聚酶使其末端变成平端。得到的片段与BamHI连接体(5’-CGGATCCG-3’)连接，用BamHI消化，接着靠自我连接得到载体pY2831，以便在酵母菌中表达。
接着，通过将包含实施例1中制备的β-呋喃果糖苷酶基因的大约4kbp的EcoRI DNA片段插入到质粒pUC118中，得到质粒pPRS01，由该质粒制备单链DNA。用此单链DNA作为模板，SEQ ID No.8的合成DNA作为引物，β-呋喃果糖苷酶基因的翻译区经定点突变，以破坏BamHI位点，而不改变编码氨基酸序列(pPRS 02)。
用质粒pPRS02作模板，用SEQ ID Nos.9和10的合成DNA作引物，通过聚合酶链反应技术，将β-呋喃果糖苷酶基因翻译区的一部分以约1.8kbp BamHI片段制备，并插入到质粒pY2831的BamHI位点以制备pYPEN01。因而，设计质粒pYPEN01以制备包含SEQ ID No.1氨基酸序列的从1到565氨基酸序列的酶蛋白，此序列是跟随分泌信号序列的成熟β-呋喃果糖苷酶。
此外，用质粒pPRS02作模板，用SEQ ID Nos.9和11的合成DNA作引物，通过聚合酶链反应技术，将包含β-呋喃果糖苷酶基因的翻译区的DNA片段以约1.8kbp的BamHI片段制备，并将其插入质粒pUC118的BamHI位点，制备质粒pPRS03。从质粒pPRS03中制备单链DNA。用此单链DNA为模板，SEQ ID No.12的合成DNA为引物，经定点诱变除去了内含子序列(pPRS04)。将β-呋喃果糖苷酶基因翻译区以约1.8kbp的BamHI片段从质粒pPRS04中制备，并将其插入质粒pY2831的BamHI位点，制备质粒pYPEN02。因而，设计出质粒pYPEN02，以产生包含SEQ IDNo.1氨基酸序列的酶蛋白，此序列是跟随分泌信号序列的β-呋喃果糖苷酶。
将质粒pYPEN01和pYPEN02通过乙酸锂方式(Ito，H.等人，细菌学杂志(J.Bacteriol)，153，163-168，1983)引入酿酒酵母MS-161(Suc-，ura3，trp1)得到转化体。此转化体在30℃下，在SD-Ura培养基(0.67％酵母氮基(Difrco)，2％葡萄糖和50μg/ml尿嘧啶)中培养过夜。培养物以1％的最终浓度接种在生产培养基(0.67％酵母氮基(Difco)，2％葡萄糖，2％酪蛋白氨基酸和50μg/ml尿嘧啶)，在30℃下培养两天。分析培养物上清液的β-呋喃果糖苷酶的活性60分钟，以在10wt％蔗糖溶液中，在pH5.5，温度40℃条件下1分钟内释放的游离葡萄糖的数量(μmol)为单位计算。结果，具有质粒pYREN01的转化体显示出4×10-4单位/毫升或更少的活性，而具有质粒pYREN02的转化体显示出0.38单位/毫升的活性。实施例3来自短柄帚霉IFO4843的β-呋喃果糖苷酶翻译区的确定由短柄帚霉IFO4843制备染色体DNA。用EcoRI完全消化大约20μg染色体DNA样本，并通过琼脂糖凝胶电泳回收约10kbp的DNA片段。
使回收的约10kbp(约0.5μg)的DNA片段与1μg用HindIII和EcoRI消化的λDASH II载体连接，并用体外包装试剂盒GIGAPACK IIGold(Stratagene L.L.C)包装，然后将其引入大肠杆菌XL1-Blue MRA(P2)，制备文库。
用实施例1中所用的约2kbpDNA片段作探针，用ECL直接DNA/RNA标记和检测系统(Amersham International)进行斑点杂交，结果在约15000个斑点中有3个克隆呈现阳性。这些阳性克隆经第二次筛选得到纯化，以制备噬菌体DNA，然后用限制酶分析。结果表明所有的克隆都有大约10kbp的相同EcoRI片段。
用限制酶将这些约10kbp的EcoRI片段再分解得到小片段，以便选择期望的DNA区域，然后将其亚克隆至质粒载体pUC118或pUC119。根据标准方法从此亚克隆得到质粒DNA，并用ALFred DNA测序仪(Pharmacia)测序如SEQ ID No.13中所示。
包含此序列从1722到1776的55个碱基的序列经鉴定为内含子，因为它显示出丝状真菌的典型内含子结构。结果，将内含子从SEQ ID No.13中删除获得作为编码蛋白质序列的SEQ ID No.4的序列。此编码氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。实施例4酿酒酵母中来自短柄帚霉的β-呋喃果糖苷酶基因的表达为了表达来自短母柄帚霉的β-呋喃果糖苷酶基因，按如下步骤(图2A和B)制备质粒pYSCOP01和pYSCOP02。
用在实施例3中制备的包含β-呋喃果糖苷酶基因的约10kbp的EcoRIDNA片段作为模板，SEQ ID Nos.14和15的合成DNA作引物，通过聚合酶链反应，将β-呋喃果糖苷酶基因的翻译区之一部分以约18kbp的BamHI片段制备，并将其插入质粒pY2831的BamHI位点，以制备pYSCOP01。因而，质粒pYPEN01经设计以产生一种酶蛋白，其包含SEQID No.3氨基酸序列中从1到574的氨基酸序列，它是跟随分泌信号序列的成熟β-呋喃果糖苷酶。
下一步用包含β-呋喃果糖苷酶基因的约10kbp的EcoRI片段作模板，SEQ ID Nos.14和16的合成DNA作引物，通过聚合酶链反应，将包含β-呋喃果糖苷酶基因翻译区的DNA片段以约1.9kbp的BamHI片段制备，并将其插入质粒pUC118的BamHI位点，以制备质粒pSCB01。从质粒pSCB01制备出单链DNA。用它作模板，以SEQ ID No.17的合成DNA作引物，经定点诱变除去内含子序列(pSCB02)。从质粒pSCB02将β-呋喃果糖苷酶基因的翻译区以约1.9kbp的BamHI片段制备出来，并将其插入质粒pY2831的BamHI位点，制备成质粒pYSCOP02。因而，设计质粒pYSCOP02以产生包含SEQ ID No.3氨基酸序列的酶蛋白，它是跟随分泌信号序列的成熟β-呋喃果糖苷酶。
将质粒pYSCOP01和pYSCOP02通过乙酸锂方法引入短柄帚霉MS-161(Suc-、Ura3、trp1)得到转化体。在30℃条件下，在SD-Ura培养基中培养转化体过夜。培养物以1％的最终浓度接种在生成培养基上，并在30℃下培养两天。以实施例2所描述的相同方式分析培养物上清液的β-呋喃果糖苷酶活性。结果，具有质粒pYSCOP01的转化体显示出4×10-4单位/毫升或更小的活性，而具有质粒pYSCOP02的转化体显示出6.5×10-3单位/毫升的活性。
序列表<110>MEIJI SEIKA KAISHA，LTD.<120>β-呋喃果糖苷酶及其基因<130>116875-475<140><141>1998-9-10<150>JP/245154/1997<151>1997-9-10<160>17<170>Patentln Ver.2.0<210>1<211>603<212>PRT<213>娄地青霉IAM7254<220><221>成熟肽<222>(1)...(603)<400>Val Asp Phe His Thr Pro Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Pro Pro Asn Leu1 5 10 15Ser Thr Leu Ala Asn Ala Ser Leu Phe Lys Thr Trp Arg Pro Arg Ala20 25 30His Leu Leu Pro Pro Ser Gly Asn Ile Gly Asp Pro Cys Gly His Tyr35 40 45Thr Asp Pro Lys Thr Gly Leu Phe His Val Gly Trp Leu Tyr Ser Gly50 55 60Ile Ser Gly Ala Thr Thr Asp Asp Leu Val Thr Tyr Lys Asp Leu Asn65 70 75 80Pro Asp Gly Ala Pro Ser Ile Val Ala Gly Gly Lys Asn Asp Pro Leu85 90 95Ser Val Phe Asp Gly Ser Val Ile Pro Ser Gly Ile Asp Gly Met Pro100 105 110Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Tyr Leu Pro Ile His Trp Ser Ile115 120 125Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gln Ser Leu Ala Val Ser Tyr Asp130 135 140Gly Gly His Asn Phe Thr Lys Leu Asn Gln Gly Pro Val Ile Pro Thr145 150 155 160Pro Pro Phe Ala Leu Asn Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Tyr Val Phe165 170 175Gln Ser Pro Ile Leu Asp Lys Ser Val Asn Ser Thr Gln Gly Thr Trp180 185 190Tyr Val Ala Ile Ser Gly Gly Val His Gly Val Gly Pro Cys Gln Phe195 200 205Leu Tyr Arg Gln Asn Asp Ala Asp Phe Gln Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly210 215 220Gln Trp Trp Lys Glu Pro Leu Asn Thr Thr Trp Gly Lys Gly Asp Trp225 230 235 240Ala Gly Gly Trp Gly Phe Asn Phe Glu Val Gly Asn Val Phe Ser Leu
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权利要求
1.一种包含SEQ ID No.1氨基酸序列或其同系物的多肽。
2.一种编码根据权利要求1所述的多肽的DNA。
3.根据权利要求2所述的DNA，其包含SEQ ID No.2的核苷酸序列。
4.一种包含SEQ ID No.3氨基酸序列或其同系物的多肽。
5.一种编码根据权利要求4所述的多肽的DNA。
6.根据权利要求5所述的DNA，其包含SEQ ID No.4的核苷酸序列。
7.一种包含根据权利要求2、3、5或6所述的DNA的载体。
8.一种用根据权利要求7所述的载体转化的宿主细胞。
9.一种生产β-呋喃果糖苷酶的方法，其包括以下步骤培养根据权利要求8所述的宿主细胞，并从宿主和/或其培养物中收集β-呋喃果糖苷酶。
10.一种制备低聚果糖的方法，其包括将蔗糖与根据权利要求8所述的宿主细胞，或根据权利要求9所述的方法获得的β-呋喃果糖苷酶相接触的步骤。
全文摘要
公开了一种新的β－呋喃果糖苷酶及其基因。包含序列表中SEQ ID No.1或3所示的氨基酸序列的多肽是具有β－呋喃果糖苷酶活性且具有高度转移酶活性的一种酶,其能高效地产生低聚果糖。
文档编号C12N15/54GK1276008SQ98810189
公开日2000年12月6日 申请日期1998年9月10日 优先权日1997年9月10日
发明者矢内耕二, 中根公隆, 河野敏明 申请人:明治制果株式会社