专利名称：编码tage分子的分离的核酸分子及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码肿瘤排斥抗原前体的核酸分子家族。肿瘤排斥抗原前体或“TRAP”可被加工成人白细胞抗原分子呈递的肽。所述基因似乎与其它已知的肿瘤排斥抗原前体编码序列不相关。
T细胞识别细胞异常的机理也涉及到癌症。例如，PCT申请PCT/US92/04354(1992年5月22日提交，1992年11月26日公开，引入本文作为参考)中公开了被加工成肽，该肽又在细胞表面表达的基因家族，所述肽通过特异性的溶细胞T淋巴细胞(下文称之为“CTL”)可导致肿瘤细胞裂解。据称该基因编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，由其衍生的肽被称为“肿瘤排斥抗原”或“TRA”。有关该基因家族的详细资料可参见Traversari等，免疫遗传学，35145(1992)；van der Bruggen等，科学2541643(1991)。也可参见美国专利申请流水号807，043(1991年12月12日，现为美国专利5，342，774，其全文引入本文作为参考)。此专利中公开了肿瘤排斥抗原前体的“MAGE”家族。
美国专利5，405，940(引入本文作为参考)中解释了MAGE-1基因编码肿瘤排斥抗原前体，所述前体被加工成由HLA-A1分子呈递的九肽。既然基元已达到要求，与HLA-A1结合的九肽即遵循结合“规则”。有关内容可参见如PCT/US93/07421；Falk等，自然351290-296(1991)；Engelhard，Ann Rev.Immunol.12181-207(1994)；Ruppert等，细胞74929-937(1993)；Rotzschke等，自然348252-254(1990)；Bjorkman等，自然329512-518(1987)；Traversari等，实验医学杂志1761453-1457(1992)。参考文献教导我们假定已知特定的肽对特定的HLA分子具有特异性，人们预期一种特定的肽与一种HLA分子结合，而不与其它HLA分子结合。这一点至关重要，因为不同的个体具有不同的HLA表型。结果，尽管将特定肽鉴定为具体HLA分子的配对物有利于诊断和治疗，但这仅与具有该特定HLA表型的个体相关。在此领域还需要进一步的工作，因为细胞异常并不局限于一种特定的HLA表型，靶向治疗需要一些处于争论中的异常细胞表型的知识。
美国专利申请流水号008，446(1993年1月22日提交，引入本文作为参考)公开了MAGE-1表达产物被加工成第二种TRA这一事实。该第二种TRA由HLA-Cw*1601分子呈递。该专利表明给定TRAP可产生多种TRA，每种TRA都满足与MHC分子结合的基元规则。
美国专利申请流水号994，928(1992年12月22日提交，引入本文作为参考)阐明由一些正常细胞(如黑素细胞)产生的分子，即酪氨酸酶在肿瘤细胞中被加工，产生由HLA-A2分子呈递的肽。
在美国专利5，683，886(全文列入本文作为参考)中，非衍生自酪氨酸酶的第二种TRA由HLA-A2分子呈递。这种TRA衍生自TRAP，但由非-MAGE基因编码。该专利表明特定的HLA分子可呈递衍生自不同来源的TRA。
美国专利5，571，711(1993年6月17日提交，引入本文作为参考)描述了不相关的肿瘤排斥抗原前体，即所谓的“BAGE”前体。BAGE前体与MAGE家族不相关。
美国专利申请流水号08/096，039和流水号08/250，162(皆引入本文作为参考)中也公开了不相关的TRAP前体GAGE。
由上文所述的论文，专利和专利申请描述的工作在很大程度上与MAGE基因家族和不相关的BAGE和GAGE基因有关。然而，目前已发现其它的肿瘤排斥抗原前体由细胞表达。这些肿瘤排斥抗原前体被称为“TAGE”肿瘤排斥抗原前体，它们与MAGE基因家族，BAGE基因家族或GAGE基因家族没有同源性。因此，本发明涉及编码这种TAGE TRAP的基因，被编码的肿瘤排斥抗原前体，由其衍生的肿瘤排斥抗原，基因的片断，以及它们的用途。
下文将进一步阐明本发明。
实施例1本实施例描述了本发明核酸分子的分离。
根据标准方法学由睾丸组织制备cDNA文库。具体地说，使用商购的寡-dT mRNA提取试剂盒分离poly A RNA。一旦分离出RNA，即使用寡-dT引物和标准方法将其转变为cDNA。
然后将cDNA与NotI/BstX衔接子连接，插入已知的表达载体pcDNAI／Amp，将所得重组质粒电穿孔至大肠杆菌DH5αF’IQ中。根据Sambrook等，分子克隆实验室手册(冷泉港实验室出版社，1989)，p1.94(引入本文作为参考)所述的方法，用氨苄青霉素(50微克/毫升)选择经转染的细菌，铺于尼龙膜上进行复制。简单地说，将细菌铺于膜上，然后将膜置于固体基质上，当可以看见菌落时，在第一张膜上放上第二张膜。一些细菌粘附到第二张膜上，如此产生复制品。
预处理之后，将膜用于杂交实验。具体地说，于65℃，在10％葡聚糖硫酸酯，1％SDS和1M NaCl的溶液中使这些膜与32P标记的寡核苷酸探针接触。探针由美国专利5，571，711(引入本文作为参考)中的SEQ ID NO1的核苷酸100-385组成，接着进行2次5分钟的室温洗涤(2×SSC)，再于60℃进行2次30分钟的洗涤(2×SSC，1％SDS)。
对一个阳性克隆进行部分测序。482个碱基对的部分序列示于SEQ IDNO1中。它与已知序列没有同源性，与衍生得到杂交探针的cDNA序列也没有同源性。杂交条件的低严紧性促成了杂交。
实施例2然后进行实验以确定分离的核酸分子(下文称之为“TAGE”)是否属于基因家族。为此，用EeoRI消化黑素瘤细胞系MZ2-MEL(描述于美国专利5，342，774中，列入本文作为参考)的基因组DNA。根据SEQ ID NO1制备核苷酸探针，该探针由SEQ ID NO1的核苷酸166-446组成，将其用于基因组消化物的Southem印迹。使用了严紧条件(0.2×SSC，1％SDS，20分钟，60℃)，观察到两条分别为3.5和6.5kb的带。使用Hind Ⅲ消化物重复实验，观察到4条带。其中两条带大于12kb，其余两条带为5和7千碱基长。这一结果表明可能存在TAGE基因家族。
实施例3然后进行研究以确定TAGE基因是否在正常或癌细胞和组织中表达。为此，使用标准的异硫氰酸胍法从样品中提取总RNA。使用寡dT引物对2ug RNA进行逆转录以获得cDNA。94℃ 5分钟和73℃ 15分钟处理之后，经由30轮PCR循环来扩增对应于100ng总RNA(104个细胞)的cDNA量。一轮PCR循环为94℃ 1分钟，59℃ 2分钟和73℃ 2分钟。引物分别由SEQ ID NO1的核苷酸166-187和核苷酸425-446的互补物组成。预期的PCR产物长度为281个碱基对。
扩增之后，在1.5％琼脂糖凝胶上按大小分级分离产物。将人β肌动蛋白的PCR扩增产物用作对照。
在受试的20个正常成人组织类型中，仅有精子和睾丸为阳性。6个受试的胎儿组织无一为阳性。在受试的22个肿瘤类型中，在精原细胞瘤(100％受试样品)中发现了强表达，在黑素瘤，肉瘤，头颈鳞状细胞癌和成神经细胞瘤中也发现了表达。检测了15种肿瘤细胞系，其中肉瘤，成神经细胞瘤，胸膜间皮瘤和甲状腺瘤细胞系为阳性。
上述实施例显示出编码肿瘤排斥抗原前体的核酸分子的分离。然而，该“TRAP”编码分子与上文参考文献中所述的先前已公开的MAGE，BAGE或GAGE编码序列或任何其它已知的基因不具有同源性。因此，本发明的一方面是具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的分离的核酸分子和编码TRA的SEQ ID NO1片断或部分(有时称之为“小基因”)，以及这些核酸分子中编码TAGE蛋白之免疫活性部分的片断或部分。此序列不是MAGE，BAGE或GAGE编码序列，通过将该序列与上述文献中所述的这些基因序列中任一相比较可以看出这一点。本发明的另一方面是编码肿瘤排斥抗原前体的核酸序列，该序列在严紧条件下可与具有SEQ ID NO1之核苷酸序列的核酸分子杂交。本文所用术语“严紧条件”指的是本领域技术人员熟悉的参数。更具体地说，本文所用的严紧条件指的是在3.5×SSC，1×Denhardt(0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％BDA)，25mMNaH2PO4，pH7.0，0.5％SDS，2mM EDTA中杂交，接着于65℃用2×SSC，0.5％SDS进行2次15分钟的洗涤，接着于65℃用0.2×SSC，0.1％SDS进行1次15分钟的洗涤。也可使用其它条件，试剂等而能达到相同的或更高程度的严紧性。本领域技术人员对这种条件是熟悉的，因此，本文中不再给出这些条件。
从实施例中可以看出本发明包括在表达载体中使用序列，所述载体可用于转化或转染宿主细胞和细胞系，所述细胞可以是原核的(如大肠杆菌)或真核的(如CHO或COS细胞)。表达载体需要相关序列(即上文所述序列)与启动子可操作相连。由于已发现人白细胞抗原呈递衍生自肿瘤排斥抗原前体的肿瘤排斥抗原，表达载体也可包括编码HLA分子的核酸序列。在载体含有这两种编码序列的情况下，可以用此载体转化或转染一般不表达这两种编码序列之任一种的细胞。当如宿主细胞已表达HLA分子时，也可单独使用肿瘤排斥抗原前体编码序列。当然，对所用的特定宿主细胞没有限制。由于载体含有两个编码序列，可将它们用于不表达HLA的宿主细胞。
本发明也包括所谓的表达试剂盒，本领域技术人员使用该试剂盒可制备所需的表达载体。这种表达试剂盒至少包括上述各编码序列的独立部分。必要时也可加入其它成分，只要包括上述必需序列即可。
为了将本发明的核酸分子和TRAP与以前描述的MAGE，BAGE和GAGE物质区分开，本发明应被称作TAGE基因家族和TRAP。因此，本文所用的“TAGE”指的是由本文所述序列编码的肿瘤排斥抗原前体。采用“TAGE编码分子”和类似术语来描述核酸分子本身。
本文所述的发明具有多种用途，本文描述了其中一些用途。首先，本发明使本领域技术人员可以诊断特征在于TRAP表达的疾病。所述方法包括测定TRAP基因的表达和/或由其衍生的TRA，如由HLA呈递的TRA。在前一种情况下，可经由任何标准的核酸测定法进行测定，所述测定法包括聚合酶链反应或用标记的杂交探针进行检测。在后一种情况下，特别优选用TRA和HLA复合体的结合配对物如抗体进行检测。另一种检测方法是上文所述类型的TNT或51Cr释放检测法。
TRAP基因的分离使得TRAP分子自身，尤其是含有由SEQ ID NO1编码的氨基酸序列的TRAP分子也可被分离。当这些分离的分子作为TRA或TRA与HLA的复合体形式存在时，它们可与诸如佐剂的物质联合以产生疫苗，所述疫苗可用于治疗特征在于TRAP分子表达的疾病。另外，在其表面呈递TRA/HLA复合体的细胞，如非增殖性癌细胞，非增殖性转染子等也可制备疫苗。在细胞用作疫苗的情况下，所述细胞是被提供CTL反应所必需的一种或两种成分的编码序列转染的细胞，或者是不经转染即可表达这两种分子的细胞。另外，使用本领域众所周知的标准技术，TRAP分子，其相关的TRA以及TRA和HLA的复合体可用于产生抗体或CTL。所述疫苗包括一种或多种细胞因子，如GM-CSF。
本文所用术语“疾病”指的是表达和加工肿瘤排斥抗原前体的任何病理学状态。所述疾病的例子是癌症，尤其是黑素瘤。众所周知，黑素瘤是产生色素之细胞的癌症。
根据本发明的治疗方法的前题是导致TRA呈递细胞裂解的受试者免疫系统反应。这类方法之一是给具有表型有问题的异常细胞的受试者施用特异于所述复合体的CTL。本领域技术人员熟知在体外制备这种CTL。具体地说，将细胞样品(如血细胞)与呈递复合体并能促进特异性CTL增殖的细胞接触。靶细胞可以是转染子，如上述类型的COS细胞。这些转染子将所需复合体呈递至其表面，当与所需的CTL混合时，会刺激其增殖。本文所用的COS细胞来源很广，正如其它适宜的宿主细胞那样。
为了详细描述治疗方法学，称为过继转移(Greenberg，J.免疫学杂志，136(5)1917(1986)；Riddel等，科学257238(7-10-92)；Lynch等，欧洲免疫学杂志，211403-1410(1991)；Kast等，细胞59603-614(11-17-89))，将呈递所需复合体的细胞与CTL混合，导致特异于该细胞的CTL增殖。然后将增殖的CTL施用于细胞异常的受试者，所述细胞异常的特征在于某些呈递特定复合体的异常细胞，其中复合体含有相关的HLA分子。CTL可裂解异常细胞，从而达到所需的治疗目的。
上述疗法假定至少一些受试者的异常细胞呈递相关的HLA/TRA复合体。这一点很容易被确定，因为本领域技术人员很熟悉呈递特定HLA分子的细胞的鉴定方法，以及如何鉴定表达相关序列(此时为TAGE序列)的DNA的细胞。一旦经由上述筛选方法学鉴定出呈递相关复合体的细胞，可将它们与患者的样品混合，其中所述样品含有CTL。如果复合体呈递细胞被混合的CTL样品裂解，则可以假定TAGE衍生的肿瘤排斥抗原被呈递，该受试者是上文所述治疗方法的适当候选者。
过继转移不是本发明可以提供的唯一治疗形式。也可使用多种方法在体内刺激CTL产生。上文已阐明了一种方法，即使用非增殖性的细胞表达复合体。此方法中所用的细胞是那些正常表达复合体的细胞，如经照射的黑素瘤细胞或被用于呈递复合体所需的一种或两种基因转染的细胞。Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88110-114(1991年1月)描述了此方法，并在治疗方案中使用了表达HPV E7肽的转染细胞。可使用多种细胞类型。类似地，可使用携有一种或两种所需基因的载体。尤其优选病毒或细菌载体。在这些系统中，所需基因按Layton等，免疫学87(2)171-178(1996)，Gibert等，Nat Biotechnol.15(12)1280-1284(1997)(引入本文作为参考)所述，由例如痘苗病毒和腺病毒，逆转录病毒，Yersinia病毒或Ty病毒样颗粒或细菌BCG携有，所述物质实际上“感染”宿主细胞。也可使用其它类型的载体，如脂质体或阳离子脂质。所得细胞呈递所需复合体，并被自身的CTL识别，然后该CTL增殖。通过将肿瘤排斥抗原或前体本身与佐剂混合也可获得类似的效果，即便于掺入HLA呈递细胞，然后所述细胞呈递所需的HLA/肽复合体。TRAP被加工形成HLA分子的肽配对物，而TRA无需进一步的加工即可被呈递。
无需赘言，本发明的其它方面对本领域技术人员而言是显而易见的。
本文所用术语和表述方式旨在描述而不是限制本发明，所述术语和表述方式的使用也包括所示或所述特征或其部分的任何等同物，应认识到在本发明的范围之内进行各种修饰也是可能的。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人Van der Bruggen，Pierre；Boon-Falleur，Thierry(ⅱ)发明名称编码TAGE分子的分离的核酸分子及其用途(ⅲ)序列数目1(ⅳ)联系地址(A)联系人Fulbright&Jaworski L.L.P.
(B)街道666 5th Avenue(C)城市纽约(D)州纽约(E)国家美国(F)邮政编码10103-3198(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型软盘，3.5英寸，1.44KB内存(B)计算机IBM PS/2(C)操作系统PC(D)软件Wordperfect(ⅳ)目前的申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类号(ⅷ)律师/代理人资料(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)登记号30，946(C)参考/案号LUD 5376 PCT(ⅸ)通讯信息(A)电话(212)318-3168(B)电传(212)752-5958(2)SEQID NO1的资料
(ⅰ)序列特征(A)长度482个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO1GACAGAGTGT GCAGCACGAC CAGAGTGGCT TTTCTGGCTT TGCCGCCCAG CTGCTCCATG 60CCAGGAGGAG GAGGAGACAC CTAGAGCCTG CGACACCATG GCTCGCCTCG CTGCAGTGTA120GGTTCTACCC ATGTAACAGA TGAGGAAACC AAGGAGCACA GTTATTTACT AACTCGCACA180AGGTTCGAGG CCGAGCTCAG ACCTGTGGAG CAGAAGCTGA GTGCGCTGCA GTCCCCGCTG240GCCCAGAGGC CCTTCTTCGA GGTGCCCTCA CCCCTGGGCG CCGTGGACCT GTACGAGTAT300GCATGCGGGG ATGAGGACCT GGAGCCACTG TGACGCCACC CATGAGAACG CCGCTGCGGG360GCCGCTCCAC ACGTGCCACG GCCACCACTG GGACACCGCC GCTTGTGTAA AAACTGTTGT420CTTTTGTGGA AAATGAGTGT GTTTGCATGG AATGATAAAT TTTATTTATT CACAAAAAAA480AA 48权利要求
1．分离的核酸分子，其基本上由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列组成。
2．分离的核酸分子，其互补序列在严紧条件下与SEQ ID NO1所示的核酸分子杂交，并且编码肿瘤排斥抗原前体。
3．分离的核酸分子，其编码具有由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列编码之蛋白质的氨基酸序列的蛋白质。
4．分离的核酸分子，其与权利要求1的核酸分子完全互补。
5．被权利要求1的核酸分子转染或转化的宿主细胞。
6．被权利要求2的核酸分子转染或转化的宿主细胞。
7．被权利要求3的核酸分子转染或转化的宿主细胞。
8．表达载体，其含有与启动子可操作相连的权利要求1的分离的核酸分子。
9．表达载体，其含有与启动子可操作相连的权利要求2的分离的核酸分子。
10．表达载体，其含有与启动子可操作相连的权利要求3的分离的核酸分子。
11．权利要求5的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
12．权利要求6的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
13．权利要求7的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
14．权利要求8的表达载体，进一步包括编码人白细胞抗原的核酸分子。
15．权利要求9的表达载体，进一步包括编码人白细胞抗原的核酸分子。
16．权利要求10的表达载体，进一步包括编码人白细胞抗原的核酸分子。
17．表达试剂盒，其含有下列物质的独立部分(ⅰ)权利要求1的分离的核酸分子，和(ⅱ)编码人白细胞抗原的核酸分子。
18．表达试剂盒，其含有下列物质的独立部分(ⅰ)权利要求2的分离的核酸分子，和(ⅱ)编码人白细胞抗原的核酸分子。
19．表达试剂盒，其含有下列物质的独立部分(ⅰ)权利要求3的分离的核酸分子，和(ⅱ)编码人白细胞抗原的核酸分子。
20．由权利要求1，2或3的核酸分子编码的分离的肿瘤排斥抗原前体。
全文摘要
本发明公开了新的肿瘤排斥抗原前体家族和编码它们的核酸分子。这些肿瘤排斥抗原前体被称为TAGE肿瘤排斥抗原前体,编码它们的核酸分子被称为TAGE编码分子。本发明还描述了编码序列和肿瘤排斥抗原及其前体分子的多种诊断和治疗用途。
文档编号C12P21/02GK1284962SQ98813782
公开日2001年2月21日 申请日期1998年12月2日 优先权日1998年3月6日
发明者皮埃尔·范德布鲁根, 蒂里·布恩－法勒尔 申请人:路德维格癌症研究院