专利名称：天冬甜素与天冬甜素衍生物的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及甜味物质天冬甜素 (APM)和N-[N-(3，3-二甲基丁基)-L-α-天冬氨酰基]-L-苯基丙氨酸甲酯(以下称为N-(3，3-二甲基丁基)-APM或APM衍生物)的分离纯化方法。
背景技术：
近年来，随着饮食生活水平的提高，特别是糖分的过多摄取，已出现了肥胖以及由此带来的各种疾病的问题，因此期望开发出替代砂糖的低热量的甜味剂。在安全性和甜味的质量方面都优异的APM已作为甜味剂而得到广泛的使用，但其稳定性还稍有问题。所以，作为稳定性有若干改善并提高甜度的试验之一，已探讨了在构成APM的天冬氨酸的氨基上引入烷基的化合物，其中N-(3，3-二甲基丁基)-APM的甜度明显提高，这在法国专利2697844的说明书中已有记述。N-(3，3-二甲基丁基)-APM的制法已知的有，在甲醇中与3，3-二甲基丁醛的共存下用氰基硼氢钠还原使APM烷基化的方法(参见上述法国专利2697844)和在pH4.5～5的水-甲醇混合溶剂中与3，3-二甲基丁醛的共存下用铂碳为催化剂还原来使APM烷基化的方法(参见WO95/30689)。按照上述专利说明书所述方法进行反应的场合，反应混合液中或产物粗结晶中都还混有不少量的未反应的3，3-二甲基丁醛和APM或作为副产物的引入了2个烷基的N，N-二(3，3-二甲基丁基)-APM。
在这些当中，由于3，3-二甲基丁醛的沸点低，或因它可溶于N-(3，3-二甲基丁基)-APM的不良溶剂己烷等中，用减压干燥和洗涤比较容易除去，但APM与N，N-二(3，3-二甲基丁基)-APM仅靠如前述专利说明书中所述那样，则难以从已除去了催化剂的残渣中晶析操作来除去，为得到可满足纯度要求的N-(3，3-二甲基丁基)-APM则伴随着得率的大幅度下降。还有，N，N-二(3，3-二甲基丁基)-APM不能作为原料回收利用，因此希望要极力抑制其生成；还由于3，3-二甲基丁醛存在有气味臭的问题，因此希望在反应中尽可能消耗掉。作为解决此问题的方法之一，已经考虑采用相对于所使用的3，3-二甲基丁醛量取过量的APM来反应的方法，不过在此场合，由于APM残存于反应液中，因此确立容易以良好效率且高纯度分离纯化APM与N-(3，3-二甲基丁基)-APM的方法已是本领域的重要课题。
发明的目的本发明的目的在于，提供从含有APM与N-(3，3-二甲基丁基)-APM的水性溶液中容易以良好效率把APM与N-(3，3-二甲基丁基)-APM相互分离而以高纯度分离纯化各化合物的方法。
发明的公开本发明人等为解决上述课题、达到本发明的目的作了锐意的探讨，结果发现，把含有APM与N-(3，3-二甲基丁基)-APM的水性溶液等通过非极性高多孔性聚合物类树脂，利用它们对非极性高多孔性聚合物类树脂的亲和性的差异，就可以很容易的以良好的效率且高纯度的分离纯化出APM与N-(3，3-二甲基丁基)-APM，从而完成了本发明。
即，本发明是把含有APM和N-[N-(3，3-二甲基丁基)-L-α-天冬氨酰基]-L-苯基丙氨酸甲酯的水性溶液等经非极性高多孔性聚合物类树脂的柱色谱，把APM与N-(3，3-二甲基丁基)-APM分离开，和将各个化合物分离纯化的方法。进行柱色谱的场合，例如把含上述2种化合物的水性溶液通过填充了上述树脂的柱子，利用上述2化合物对此树脂的亲和力的差异，具体说APM的亲和力相对弱一些，利用这一点，可以按通常方法将两者分离精制。
而且，除了在柱中使用上述树脂的柱色谱使两混合物分离的效果奏效之外，当然本发明的方法中也包含了使用与其他载体混合或合并使用的形态。
本发明中还包含了下述内容。
1．非极性高多孔性聚合物类树脂是含芳香族聚合物类树脂或芳香族聚合物类树脂的上述方法。
此场合下，作为非极性高多孔性聚合物类树脂，可以是把上述芳香族聚合物类树脂作为所使用的非极性高多孔性聚合物类树脂的全部或一部分来使用，上述情况的任何一种都包含在本发明中。
2．芳香族聚合物类树脂含迪阿翁离子交换树脂SP树脂和迪阿翁离子交换树脂HP树脂中的至少1种的上述方法。
3．迪阿翁离子交换树脂SP树脂含迪阿翁离子交换树脂SP850和SP207中的至少1种的上述方法。
4．迪阿翁离子交换树脂HP树脂含迪阿翁离子交换树脂HP20的上述方法。
还有，关于上述发明中作为载体使用的迪阿翁离子交换树脂都是三菱化学社制的商品名，与其构成或作为组合物在实质上是同一的，而且，本发明使用的含上述商品名的载体中包含了即使不是上述商品名但在实质上有同一作用的载体。
5．用APM为原料制备N-(3，3-二甲基丁基)-APM时，把由上述本发明方法分离纯化的APM或含有APM的级份部分作为该原料的APM或其一部分来使用以制备此APM衍生物，即N-(3，3-二甲基丁基)-APM的方法。
此场合的制备方法本身并没有特别的限制，列举的此制备方法有由APM与3，3-二甲基丁醛的还原烷基化反应的方法。
6．由上述本发明的分离纯化方法或使用该方法分离纯化所制备的APM或N-(3，3-二甲基丁基)-APM。
7．含有上述APM衍生物和视必要含它和甜味剂用载体的甜味剂或把此甜味剂用来赋予要求甜味的食品等具有甜味的方法。
实施方案本发明是从含有APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM的水性溶液等，特别是水性溶液中，分离纯化APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM时，利用它们对非极性高多孔性聚合物类树脂的亲和性的差异来进行分离纯化以得到高纯度APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM的方法。
本发明使用的原料水性溶液等是指水性溶液和适用于本发明使用的柱色谱方面与其实质上同等的溶液都行。
作为上述水性溶液，可以列举的有水溶液；用甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃等的水溶性或水可溶性溶剂(包含多种的混合溶剂的水溶性或水可溶性混合溶剂)的溶液；以及用水与所述水溶性或水可溶性溶剂的混合溶剂的溶液。
本发明的分离纯化方法优选按通常的方法来实施柱色谱，例如把非极性高多孔性聚合物类树脂填充于柱内，接着，优选的是把含有APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM的水性溶液通过并在得到一部分作为贯通渗滤液的APM后，再将合适的溶出溶剂流过，依次溶出APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM，就可以很好的实施。
作为含有APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM的水性溶液可以列举的有，例如，由APM或APM的衍生物(APM的天冬氨酰基[Asp基]的β位羧基被苄酯保护的化合物等)还原烷基化制备N-(3，3-二甲基丁基)-APM时的反应混合液用水取代的水溶液、溶解由此反应混合液得到的生成物粗结晶的水溶液或其母液等，而且除此之外凡是含有APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM的任何一种水性溶液都可以使用本发明方法。
对水性溶液中的APM或/和N-(3，3-二甲基丁基)-APM的浓度没有特别的限制，以0.1～1.5g/dl左右的水性溶液更适合于分离纯化。还有，本发明所使用的非极性高多孔性聚合物类树脂，无论是已知的非极性高多孔性聚合物类树脂、还有实质上有同样结构或同样功能的树脂都行，其中以芳香族聚合物类树脂为优选，可以利用由苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物形成的芳香族聚合物类树脂，例如，迪阿翁离子交换树脂HP20、HP21、SP206、SP207、SP825、SP850(商品名，三菱化学社制)等。
使用的树脂量，例如在迪阿翁离子交换树脂SP207、SP850的场合，作为N-(3，3-二甲基丁基)-APM的浓度为1g/dl左右的水性溶液量的约0.1倍量左右就是足够的了。作为溶出溶剂可以示例的有水、醇类(甲醇、乙醇、异丙醇等)、或将水与醇类以任意的比例混合的溶剂等。例如，在含有APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM的水性溶液的吸附时作为贯通渗滤液得到一部分APM后，用水为溶出剂的话，溶出了APM，接着用醇类或水与醇类混合的溶剂的话，就能溶出N-(3，3-二甲基丁基)-APM，因此通过适当地将溶出液分级就可以使APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM分离纯化。
含有APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液可以以各溶液的原来样子直接回收利用，也可以根据需要，利用已知的手段，如浓缩、晶析等来得到高纯度的结晶。
再有，非极性高多孔性聚合物类树脂在进行了约30次分离操作后其吸附力下降，因此必须要再生。在再生时，用例如50体积％的含水醇1体积与1mol/l氢氧化钠水溶液1体积的等量混合液冼净树脂就行了。这样做后，树脂就可以重复再使用了。
在把用本发明方法分离纯化或制备的N-(3，3-二甲基丁基)-APM作为甜味剂制造和使用时没有特别的困难，作为甜味剂的制备或使用方法可以用众所周知的方法来进行。
优选实施方案下面用实施例和比较例来更详细说明本发明，不过，在不超越本发明宗旨的限度内，本发明并不限于这些例子。
(实施例1)把1.57g APM(天冬甜素)和1.58 g N-(3，3-二甲基丁基)-APM溶在水中成为200ml的溶液，流过在填充有迪阿翁离子交换树脂SP207(三菱化学社制)在水中体积为20ml的(直径1.6cm、高20cm)柱以吸附APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM。此时，一部分APM作为贯流渗滤液溶出。接着，用140ml水为溶出溶剂使APM溶出。进而，用30体积％的甲醇水300ml以及继续用甲醇100ml把N-(3，3-二甲基丁基)-APM溶出。其中，吸附时和溶出时的空间速度为SV=2。经这一连串的操作，收集贯流渗滤液量的100～200ml的级份部分以及水溶出液的全部作为APM溶出液。而且，收集30体积％的甲醇水溶出液量100～300ml的级份部分以及甲醇溶出液的全部作为N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液。由高速液相色谱对各溶出液的分析结果表明，APM溶出液中含有1.43g APM(收率91％)，其中已不含N-(3，3-二甲基丁基)-APM；而，N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液中含有1.35g N-(3，3-二甲基丁基)-APM(收率86％)，而且也已不含APM。
(实施例2)除了收集30体积％甲醇水溶液和甲醇溶液的全部作为N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液之外，其余与实施例1完全一样操作，得到N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液。由高速液相色谱的分析结果表明，此溶出液含有1.58g N-(3，3-二甲基丁基)-APM(收率100％)以及微量APM(相对于N-(3，3-二甲基丁基)-APM重量的9.3重量％)。
把所得到的N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液在减压下浓缩至干。把此残渣溶解于加有微量甲醇的15ml水中，接着把此溶液在5℃下晶析一夜，然后过滤结晶，减压干燥，得到1.24g干燥结晶。由高速液相色谱的分析结果表明，此结晶含有1.22g N-(3，3-二甲基丁基)-APM(收率77％)，纯度为99.0％。还有，卡尔-费歇尔法分析的结果表明，此结晶的含水量为1.6重量％。
(比较例1)
把1.51g APM(天冬甜素)和1.54g N-(3，3-二甲基丁基)-APM溶在50ml水中，接着把此溶液在5℃下晶析一夜，然后过滤结晶，用50ml水冼净，减压干燥，得到1.83g干燥结晶。由高速液相色谱的分析结果表明，此结晶含有0.78g APM和0.98g N-(3，3-二甲基丁基)-APM。还有，卡尔-费歇尔法分析的结果表明，此结晶的含水量为3.9重量％。
(实施例3)把3.45g APM和1.70g N-(3，3-二甲基丁基)-APM溶在水中制成400ml的溶液，流过填充有在水中体积为20ml的迪阿翁离子交换树脂SP207(三菱化学社制)的柱子(与实施例1相同)以吸附APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM。此时，一部分APM作为贯流渗滤液溶出。接着，用160ml水为溶出溶剂使APM溶出。进而，用60体积％的甲醇水400ml把N-(3，3-二甲基丁基)-APM溶出。其中，吸附时和溶出时的空间速度为SV=1.5。经这一连串的操作，收集贯流渗滤液量的130～400ml的级份部分以及水溶出液的全部作为APM溶出液。而且，收集60体积％的甲醇水溶出液的全部作为N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液。由高速液相色谱对各溶出液的分析结果表明，APM溶出液中含有3.38gAPM(收率98％)，而且已不合N-(3，3-二甲基丁基)-APM。而且，N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液中含有1.70g N-(3，3-二甲基丁基)-APM(收率100％)以及微量APM(相对于N-(3，3-二甲基丁基)-APM重量的4.1重量％)。
(实施例4)把1.01g APM和1.93g N-(3，3-二甲基丁基)-APM溶在水中成为230ml的溶液，流过填充有在水中体积为20ml的迪阿翁离子交换树脂SP850(三菱化学社制)(与实施例1相同)的柱以吸附APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM。此时，一部分APM作为贯流渗滤液溶出。接着，用160ml水作为溶出溶剂使APM溶出。进而，用30体积％的异丙醇水300ml把N-(3，3-二甲基丁基)-APM溶出。其中，吸附时和溶出时的空间速度为SV=2。经这一连串的操作，收集贯流渗滤液量的130～230ml的级份部分以及水溶出液的全部作为APM溶出液。而且，收集30体积％的异丙醇水溶出液的全部为N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液。由高速液相色谱对各溶出液的分析结果表明，APM溶出液中含有0.873gAPM(收率86％)，而且已不含N-(3，3-二甲基丁基)-APM。另外，N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液中含有1.93g N-(3，3-二甲基丁基)-APM(收率100％)以及微量APM(相对于N-(3，3-二甲基丁基)-APM重量的7.1重量％)。
(实施例5)把2.06g APM和1.99g N-(3，3-二甲基丁基)-APM溶在水中成为230ml的溶液，流过填充有在水中体积为20ml的迪阿翁离子交换树脂SP850(三菱化学社制)(与实施例1相同)柱以吸附APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM。此时，一部分APM作为贯流渗滤液溶出。接着，用200ml水作为溶出溶剂使APM溶出。进而，用20体积％的甲醇水200ml和继续用甲醇100ml把N-(3，3-二甲基丁基)-APM溶出。其中，吸附时和溶出时的空间速度为SV=2。经这一连串的操作，收集渗滤液量的120～230ml的级份部分以及水溶出液的全部作为APM溶出液。而且，收集20体积％的甲醇水溶出液的60～200ml的级份部分以及甲醇溶出液的全部作为N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液。由高速液相色谱对各溶出液的分析结果表明，APM溶出液中含有2.02g APM(收率98％)，已不含N-(3，3-二甲基丁基)-APM。而，N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液中含有1.83g N-(3，3-二甲基丁基)-APM(收率92％)，也已不含有APM。
(实施例6)除了收集20体积％甲醇水溶出液和甲醇溶出液的全部作为N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液之外，其余与实施例5(原稿为实施例6，请确认。)完全一样操作，得到N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液。由高速液相色谱的分析结果表明，此溶出液含有1.99g N-(3，3-二甲基丁基)-APM(收率100％)以及微量APM(相对于N-(3，3-二甲基丁基)-APM重量的2.3重量％)。
(实施例7)把67.4g(0.220mol)含水分3.9％的APM、25ml(0.199mol)3，3-二甲基丁醛和20g 5％铂碳在300ml甲醇/400ml 0.1M乙酸水溶液的混合溶剂中于氢气流下室温反应4h。用薄层色谱分析反应液，没有检出N，N-二(3，3-二甲基丁基)-APM。接着，把反应液加温使未溶解的结晶溶解后，过滤除去催化剂，得到922ml反应液。由高速液相色谱的分析结果表明，含有30.6g APM和35.4g N-(3，3-二甲基丁基)-APM。
把所得的520ml反应液减压浓缩，除去甲醇后，溶解在水中制成2000ml的溶液，流过在填充有在水中体积为200ml的迪阿翁离子交换树脂SP850(三菱化学社制)的(直径5.0cm、高30cm)的柱以吸附APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM。此时，一部分APM作为渗滤液溶出。接着，用2000ml水作为溶出溶剂使APM溶出。进而，用20体积％的甲醇水700ml和继续用甲醇1000ml把N-(3，3-二甲基丁基)-APM溶出。其中，吸附时和溶出时的空间速度为SV=2。经这一连串的操作，收集贯流渗滤液量的1200～2000ml的级份部分以及水溶出液的全部作为APM溶出液。而且，收集甲醇溶出液的全部作为N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液。由高速液相色谱对各溶出液的分析结果表明，APM溶出液中含有16.9g APM(收率98％)，已不含N-(3，3-二甲基丁基)-APM。而，N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液中含有18.8g N-(3，3-二甲基丁基)-APM(收率94％)，已不含有APM。
(实施例8)把实施例7得到的N-(3，3-二甲基丁基)-APM的溶出液减压浓缩至干。把此残渣溶在加有少量甲醇的180ml水中，接着把此溶液在5℃下晶析一夜，然后过滤结晶，减压干燥，得到14.3g干燥结晶。由高速液相色谱的分析结果表明，此结晶含有14.1g N-(3，3-二甲基丁基)-APM(收率75％)，纯度为99.5％。还有，卡尔-费歇尔法分析的结果表明，此结晶的含水量为1.1重量％。
(实施例9)把实施例7得到的APM溶出液减压浓缩到液量为470ml后，加温使部分析出的结晶溶解，接着把溶液在5℃下静置晶析一夜，然后过滤结晶，减压干燥，得到14.3g干燥结晶。由高速液相色谱的分析结果表明，此结晶含有13.9gAPM(收率82％)，纯度为99.8％。还有，卡尔-费歇尔法分析的结果表明，此结晶的含水量为3.0重量％。
发明的效果由本发明的方法，把含有APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM的水性溶液通过前述非极性高多孔聚合物类树脂的柱色谱，就可以很容易的以良好的效率且高的纯度把APM和N-(3，3-二甲基丁基)-APM各自分离纯化。
权利要求
1．APM和APM衍生物分离纯化的方法，其特征在于，把含有APM和N-[N-(3，3-二甲基丁基)-L-α-天冬氨酰基]-L-苯基丙氨酸甲酯的水性溶液等通过非极性高多孔性聚合物类树脂的柱色谱，使APM与此APM衍生物分离。
2．权利要求1所述的方法，其中，所述的非极性高多孔性聚合物类树脂是芳香族聚合物类树脂。
3．权利要求2所述的方法，其中，所述的芳香族聚合物类树脂含有迪阿翁离子交换树脂SP树脂和迪阿翁离子交换树脂HP树脂中的至少1种。
4．权利要求3所述的方法，其中，所述的迪阿翁离子交换树脂SP树脂含有迪阿翁离子交换树脂SP850和SP207中的至少1种。
5．权利要求3所述的方法，其中，所述的迪阿翁离子交换树脂HP树脂含有迪阿翁离子交换树脂HP20。
6．APM衍生物的制备方法，其特征在于，在以APM作为原料制备N-[N-(3，3-二甲基丁基)-L-α-天冬氨酰基]-L-苯基丙氨酸甲酯时，把用权利要求1所述的方法分离纯化的APM或含APM级份部分作为所述的原料或其一部分来使用。
7．APM或APM衍生物，其特征在于它们是用权利要求1所述的方法制备的。
8．甜味剂，其特征在于，它含有权利要求7所述APM衍生物和甜味剂用载体。
全文摘要
含有天冬甜素(APM)和N－[N－(3,3－二甲基丁基)－L－α－天冬氨酰基]－L－苯基丙氨酸甲酯的水性溶液等经使用非极性高多孔聚合物类树脂的柱色谱就可以很容易的以良好效率把APM与上述APM衍生物,即N－(3,3－二甲基丁基)－APM,相互分离,结果是可以分别以高纯度分离纯化APM和N－(3,3－二甲基丁基)－APM。
文档编号A23L1/236GK1284964SQ98813582
公开日2001年2月21日 申请日期1998年12月7日 优先权日1997年12月11日
发明者长嶋一孝, 岸下明弘 申请人:味之素株式会社