专利名称：碱性β－甘露聚糖酶的生产方法
技术领域：
本发明为微生物发酵生产新型β-甘露聚糖酶的生产方法，涉及一种新的酶制剂。
β-甘露聚糖酶(1.4-β-D-mannan mannohydrolase，β-mannanaseEC 3.2.1.78)是一种半纤维素酶，可将葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等一些植物多糖降解为甘露寡糖，与纤维素酶及木聚糖酶一起成为生物转化中最重要的酶系。β-甘露聚糖酶广泛存在于动物、植物及微生物中，自六十年代初，已有许多关于微生物产生β-甘露聚糖酶的报道，已知产生β-甘露聚糖酶的微生物包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、嗜水气单孢菌(Aeromonas hydrophile)、野油菜黄单孢杆菌(Xanthomonas campestris)、乳酸细菌(Enterococcus sp.)、陆生梭孢菌(Thielavia terrestris)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、木霉(Trichoderma sp.)和链霉菌(Streptomyces sp.)等，近年来国内外竞相研究开发这类酶制剂，并已有一些专利报道及许多研究报告。其中，涉及到不同性质酶的生产方法、纯化与特性、基因分析等，包括低温酶、高温酶等，(JP-；JP05176767，03.06.1993，SU-；SU1514776，26.10.1987；AU-；WO9324622，18.05.1993；EP529712，1991；Ratto，M，et al.Biotechnol.lett.，10661-664，1988；Araujo，A.et al.J.Ind.Microbiol.6269-274，1990；World-J.Microbiol.Biotechnol.；11310-374，1995；J.Biotechnol.45165-172，1996；Appl.Environ.Microbiol.63169-177，1997；Appl.Biochem.Biotechnol.70-72939-953，1998；J.Biotechnol.644428-4432，1998；J.Biotechnol.，63199-210，1998；FEBS Lett.443149-153，1999；J.Bacteriol.1811643-1651，1999)。
在碱性条件下，植物多糖大分子易于溶涨，而且许多生物处理过程需要碱性条件，因此，碱性β-甘露聚糖酶具有特殊的应用价值，而涉及碱性甘露聚糖酶的专利仅有三个专利，并且都是小试条件。第一个碱性β-甘露聚糖酶的报道是日本Horikoshi等1986年的专利，产酶菌种是一株嗜碱芽胞杆菌AM-001，产酶培养基组成是蛋白胨、槐豆胶、K2HPO4，MgSO4，Na2CO3等，最大产酶量为36u/ml，(JP-；J03047076，12.07.1986)。第二个专利是上述酶的纯化及特性(JP-；J63036775，10.11.1986)，第三个专利是热稳定性的碱性酶，其产酶菌株也是一株嗜碱细菌，PH8-10为最适PH，其新颖性在于具有较好的热稳定性，最适反应温度为65℃(JP-；JP08051975；27.02.1996)。但所有这些菌都来自土壤，不是专性嗜碱菌，所产的酶量也不大，未见发酵工艺的报道。本发明所涉及的菌种是专性嗜碱芽胞杆菌，PH8以下不生长，具有更好的热稳定性，最适70℃，酶活力高达500单位/毫升发酵液以上，该水平迄今未见报道。
本发明的目的在于提供一种新的β-甘露聚糖酶的生产菌株及碱性β-甘露聚糖酶大量生产的新方法。
本发明所采用的菌株为分离自中国内蒙碱湖的嗜碱芽孢杆菌N16-15(alkaliphilic Bacillus sp.N16-15)，该菌株在中国科学院微生物所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏(保藏号为CGMCC No.)。菌株N16-15在以甘露聚糖为碳源的培养条件下可产生芽胞，生长的PH范围为PH8-11.5，在5-8％的NaCl中生长良好。
本发明所采用的液体种子培养基含有(克/升)淀粉5，蛋白胨10，酵母粉5，K2HPO41，MgSO47H2O 0.15，NaCl 80，Na2CO310。固体斜面种子培养基为上述培养基中添加2％的琼脂粉。发酵培养基(克/升)魔芋粉10-18，旦白胨5-9，酵母粉5-7，K2HPO41-3，MgSO47H2O 0.1-0.3，NaCl70-120，Na2CO38-15，豆油2-5ml。
取固体斜面培养基上生长良好的培养物少许，接种于装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，置37℃，220转/分的旋转摇床上培养24小时作为一级种子液。以4％的接种量将一级种子转接于装有1000ml种子培养基的3000ml三角瓶中，上述条件培养24小时，作为二级种子液，再以3-5％的接种量，将二级种子液转接于种子罐或发酵罐中。种子罐为50升罐，装料体积20-30升，发酵温度32-37℃，通气量1∶0.5-1∶1.0，转速400-450转/分，时间20-28小时。发酵罐为250升-1吨罐，装料量120-600升。发酵温度32-37℃，通气量1∶0.5-1∶1.0，转速200-450转/分。发酵时间36-48小时。
按上述方法得到的发酵液，β-甘露聚糖酶的酶活力在500u/ml以上，酶活力测定方法参照AKino，T.et al.Appl.Miarobiol.Biotechnol.26323-327，1987的方法测定以0.9ml，0.5％(W/V)槐豆胶(Locust beangam)作底粉，用pH10，0.05MOL/L甘氨酸-NaOH缓冲液加入0.1ml稀释酶液，70℃保温10分钟，用二硝基水杨酸试剂测产生的还原糖，1个酶活力单位定义为上述反应条件下，一分钟释放1mMOL相当于D-甘露糖的还原糖的酶量。发酵液经板框过滤、中空纤维柱超滤浓缩即可获得纯净的浓缩酶液，浓缩倍数10倍，酶收率85％以上。
本发明提供了专性嗜碱的β-甘露聚糖酶产生菌，为实现碱性β-甘露聚糖酶大量生产提供了可行的工艺，其酶活力属世界先进水平，酶的热稳定性较好。该酶可有效地降解植物甘露聚糖生成甘露寡糖，为有效植物自然资源在碱性条件下的转化利用创造了条件。
实施例1.
将嗜碱芽孢杆菌菌株N16-15从斜面上接种于装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，37℃，220转/分摇床上振荡培养24小时，然后转接于4个装有1000ml种子培养基的3000mL三角瓶中，上述条件培养24小时，再接种于装有120升发酵培养基的250升发酵罐中进行发酵。发酵培养基的组成为(克/升)魔芋粉12，大豆粉4.5，味精4.5，酵母粉7，K2HPO41.5，MgSO47H2O 0.3，NaCl 80，Na2CO310，豆油4ml，发酵温度35℃±1℃，通气量1∶0.75，搅拌速度400转/分。发酵过程中，菌体生长延迟期约为8小时，进入对数期后，菌体迅速生长，酶量随之增长，稳定期时(32-48小时)酶活力最高。发酵40小时可放罐，发酵液酶活力500u/ml以上。
发酵液以加滤纸板的板框进行过滤，过滤压力0-2Kg/cm2，滤液由中空纤维超滤柱进行浓缩，(柱的截留分子量为6000)，基本无需压力，浓缩10倍左右后，以10nM Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH10)洗涤浓缩酶液，并洗涤超滤柱。最终酶的总收率85％。实施例2.
将菌株N16-15从斜面上接种于装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，37℃摇床培养24小时作为一级种子液。以3％的接种量将一级种子液接入一个装有1000ml种子培养基的3000ml三角瓶中，37℃摇床培养24小时作为二级种子液。将二级种子液接入装有25升种子培养基的50升种子发酵罐中，发酵温度35℃±1℃，通气量1∶1.0，搅拌速度450转/分，发酵24小时后，将其转接入装有600升发酵培养基的1吨罐中。发酵培养基的组成为(克/升)魔芋粉12，酵母粉7，大豆粉4.5，味精4.5，K2HPO41.5，MgSO47H2O 0.1，NaCl 120，Na2CO312，豆油4ml/升，发酵温度35℃，通气量1∶0.75，搅拌速度240转/分，发酵40小时，终止发酵，发酵液酶活力500u/ml以上。发酵液以加滤纸板的板框进行过滤，并加适当硅藻土作为助滤剂。滤液如例1所述进行超滤浓缩，浓缩10倍左右，总收率85％以上。实施例3.
将嗜碱芽孢杆菌菌株N16-15从斜面上接种于装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，37℃，220转/分摇床上振荡培养24小时，然后转接于4个装有1000ml种子培养基的3000mL三角瓶中，上述条件培养24小时，再接种于装有120升发酵培养基的250升发酵罐中进行发酵。发酵培养基的组成为(克/升)槐豆胶12，蛋白胨9，酵母粉6，K2HPO41.5，MgSO47H2O 0.3，NaCl 80，Na2CO310，豆油4ml，发酵温度35℃±1℃，通气量1∶0.75，搅拌速度400转/分。发酵40小时放罐，发酵液酶活力500u/ml以上。
发酵液以加滤纸板的板框进行过滤，过滤压力0-2Kg/cm2，滤液由中空纤维超滤柱进行浓缩，(柱的截留分子量为6000)，基本无需压力，浓缩10倍左右后，以10mM Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH10)洗涤浓缩酶液，并洗涤超滤柱。最终酶的总收率85％。
权利要求
1，一种微生物发酵法生产β-甘露聚糖酶的新方法，其特征在于生产碱性β-甘露聚糖酶所采用的微生物是专性嗜碱芽胞杆菌，通过种子培养基和发酵培养基，发酵液通过板框过滤和中空纤维超滤进行过滤浓缩，制备碱性β-甘露聚糖酶。
2，根据权利要求1所述方法，其特征在于生产碱性β-甘露聚糖酶的微生物是专性嗜碱芽胞杆菌N16-15(alkaliphilic Bacillussp.)，在以甘露聚糖为碳源的培养基条件下，可产生芽胞。
3，根据权利要求1所述的方法，其特征在于种子培养基是指每升培养基中含有淀粉5克，蛋白胨10克，酵母粉5克，K2HPO41克，MgSO4-7H2O 0.15克，NaCl 80克，Na2CO310克。发酵培养基是每升培养液中含有魔芋粉10-18克，旦白胨5-9克，酵母粉5-7克，K2HPO41-3克，MgSO47H2O 0.1-0.3克，NaCl 70-120克，Na2CO38-15克，豆油2-5ml。
4，根据权利要求2所述的方法，其特征在于专性嗜碱芽胞杆菌N16-15置于种子培养基的温度为37℃，摇床转速为220转/分，振荡培养24小时，置于发酵培养基中培养的温度为35℃±1℃，通气量为1∶0.75，罐发酵搅拌速度为400转/分，发酵时间为32-48小时。
5，根据权利要求1所述的方法，其特征在于发酵液的过滤采用通用的板框过滤，滤液可加适量的硅藻土作为助滤剂，过滤压力可以在0-2Kg/cm2之间。
6，根据权利要求1所述的方法，其特征在于板框过滤液可以采用中空纤维过滤装置浓缩，中空纤维过滤截留分子量为6000最宜。超滤缓冲液为pH10的10mM Na2CO3-NaHCO3。
7，根据权利要求1所述的方法，其特征在于本方法所制备的β-甘露聚糖酶可应用于甘露聚糖的水解。
全文摘要
一种新碱性β－甘露聚糖酶的生产方法。嗜碱芽孢杆菌N16—5以魔芋粉、大豆粉等为原料,发酵生产β－甘露聚糖酶,生产条件简单,发酵液的酶活力500u/ml以上,后提取收率80%以上。该酶的最适反应pH为10.0,最适反应温度为70℃,在甘露寡糖生产具有重要的应用价值。该发明提供了一种新型β－甘露聚糖酶的微生物发酵生产方法。
文档编号C12N9/42GK1266096SQ9910283
公开日2000年9月13日 申请日期1999年3月5日 优先权日1999年3月5日
发明者马延和, 周培瑾, 刘洪灿 申请人:中国科学院微生物研究所