专利名称：抑制腐乳生成“白斑”的方法
技术领域：
本发明涉及一种抑制腐乳生成“白斑”的方法，确切地说，它是食用豆腐乳良好品质的保存方法。
腐乳是我国传统的发酵食品之一，它是豆腐坯经毛霉菌通过前发酵、腌制和后发酵而成。目前，我国腐乳生产企业多存在以下问题①腐乳坯装瓶后3个月内产生较多“白斑”，严重影响了腐乳1年货架销售期的感官质量，有些企业甚至只生产“红方”腐乳，用红曲添加的办法掩盖腐乳生成“白斑”的不良感官现象；(②菌株耐热性差，夏天不能正常生产；③菌株蛋白酶活性较弱，有些工厂腐乳后发酵时间长达2-3个月，腐乳组织不够细腻。因此，优化腐乳毛霉菌株进行腐乳发酵，并在腐乳后酵过程抑制与控制腐乳生成“白斑”，将对企业的腐乳生产，促进销售，提高经济效益具有积极的意义。
腐乳的“白斑”为腐乳毛霉蛋白酶分解大豆蛋白过程所形成的酪氨酸结晶。酪氨酸是一种溶解度极低的氨基酸(25度下100克水只能溶解0.045克)，在腐乳后酵过程中，随着时间延长酶解的继续，酪氨酸逐渐增多，最后趋向过饱和结晶析出。
广西轻工研究所的雷时奋先生认为腐乳长“白斑”，是腐乳生产中存在的“老、大、难”问题，它不仅影响外观，还使人怀疑腐乳是否长霉。
经检索可知发表在《中国酿造》1993(4)第18-24页，名称为“腐乳毛霉菌种的选育”一文中介绍由于技术条件的限制，对现有菌种的分离，复壮，筛选及选育工作有一定难度，造成菌种退化、抵抗力差，酶系少，酶活低，腐乳成熟后质量不理想，特别是白方腐乳存在“小白点”及色泽“褐变”现象更为明显。
虽然，有些技术力量较强的企业采用了菌种选育方法，筛选蛋白酶活力强，但酪氨酸生成量限制的菌株，但从应用上看，菌种使用一段后又有退化现象，且大豆原料也有不稳定因素，因而很难根除。而对大部分中小型生产企业来说，腐乳长“白斑“是腐乳生产的头号难题。
本发明目的在菌种上进行优化筛选，提高菌种蛋白酶活力和菌种的耐热性能，从而缩短腐乳后酵时间和扩大腐乳生产季节。并同时在工艺上进行改进，当腐乳发酵成熟后用热钝化腐乳毛霉的蛋白酶活性，从而根本上解决了腐乳的长“白斑”问题。
本发明是由下述技术方案来实现的，本发明的工艺流程为先进行优化腐乳毛霉菌株，然后进行后发酵工艺改进。其优化腐乳毛霉菌株过程为腐乳毛霉菌株→制备孢子悬浮液→孢子热处理→单菌株分离→酪蛋白平板初筛→单菌株蛋白酶活力测定→腐乳毛霉优化菌株。
后发酵工艺腐乳毛霉试管斜面→麸曲三角瓶扩培→制备孢子悬浮液→接种豆腐坯上前发酵→腌坯→装瓶(加料液)后发酵→发酵成熟→水浴或电热等方法钝化酶活性→进仓库或销售。
腐乳毛霉斜面培养基采用马铃薯琼脂培养基，单菌株分离培养基是在马玲薯培养基中加入0.4％酪蛋白及0.1％去氧胆酸钠。平板初筛培养基酪蛋白0.4％，琼脂1.5-2％，用PH7.4硼酸缓冲液配制。麸曲培养基25克麸皮，加水130-140％，拌匀分装三角瓶。培养基灭菌除麸曲培养基采用1kg/cm2灭菌30分钟外，其他三种培养基均采用1kg/cm2灭菌20分钟。
其基本过程为(1)制备孢子悬浮液及孢子热处理将腐乳毛霉菌株移接于马铃薯斜而培养基上，30度培养3-4天，加10ml无菌生理盐水，刮下孢子，倒入装有20ml无菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶中，振荡使孢子分散后纱布过滤，采用血球计数器计数孢子浓度，并控制孢子浓度为106个/ml以上。吸取孢子悬浮液5ml置于试管中，在45度水浴中处理10分钟后冷却。该处理可以筛选获得活力较强的孢子，这对选育腐乳毛霉耐高温菌株有很大的帮助，若需要，还可以反复操作2-3次。
(2)菌株分离和初筛将热处理的孢子液稀释至10-3-10-4，取0.1ml涂布于分离培养基琼脂平板上，30度培养1-2天，挑取透明圈直径大的菌株孢子斜面培养，要获得耐高温菌株可逐级提高温度培养驯化，如30度培养后转接在32度培养，32度培养后转接于34度培养等。通过该操作可选出耐高温的腐乳毛霉菌株。将生长快，温度适应力强的腐乳毛霉分离株接种于三角瓶麸皮培养基中，30度培养4天，提取酶液，用直径10mm灭菌滤纸，放入毛霉麸曲浸提液(酶液)浸泡1小时，取出凉干后贴在酪蛋白琼脂平板上，每个菌株液处理4-6个滤纸片，贴在一个平板上，置于40度下保温6小时测定透明圈直径，选取透明圈直径大的菌株进行复筛。分离平板和初筛平板都添加0.1％去氧胆酸钠，因其可抑制菌丝过分蔓延生长，使单菌株分离成为可能，在平板上挑取透明圈大的菌株斜面培养。
(3)复筛复筛是测定蛋白酶活力，采用福林法。在PH7.0，温度40度下，以每分钟酶促反应分解酪蛋白产生1微克酪氨酸为一个蛋白酶活力单位(μg/min)选择蛋白酶活力高的菌株进行生产。但由于蛋白酶活力测定方法中所需试剂，设备以及测定较为复杂，一般企业未必都具备条件。因而生产单位也可直接对腐乳毛霉孢子进行热处理，分离纯化，提高温度驯化培养，反复用酪蛋白平板初筛，选择较耐高温，生长速度快，菌丝白而致密，透明圈较大的菌株进行生产，该操作简易，易于掌握，生产单位只要定期对腐乳毛霉生产菌进行分离复选，一定能提高腐乳生产的质量和缩短发酵周期。
后发酵工艺改进为腐乳毛霉试管菌株→麸曲三角瓶扩培→制备孢子悬浮液→接种豆腐坯上前发酵→腌坯→装瓶(加料液)后发酵→发酵成熟→水浴或电热等钝化酶活性→进仓库或销售。
本发明选育耐高温和蛋白酶活力强的腐乳毛霉菌株进行腐乳发酵，按常规菌种扩培制备孢子悬浮液，接种豆腐坯前发酵，盐腌，装瓶添加料液后发酵，在腐乳后发酵成熟后(腐乳组织块柔软风味鲜美)，采用蒸汽热，电热或水浴热等方法来钝化腐乳毛霉蛋白酶活性，使腐乳由常规下腐乳坯装瓶后3个月产生“白斑”延迟到一年甚至更长时间都不长“白斑”，并且色、香、味等感官良好，从而在根本上解决了腐乳长“白斑”的“老、大、难”问题。
至于热对腐乳毛霉蛋白酶活力影响测定，可以帮助选择加热处理的条件，本发明采用优化腐乳毛霉菌株，通过麸曲培养浸提酶液后，对酶液分别用50度，55度，60度，70度温度下处理不同时间，测定其中性蛋白酶活力，结果如表1所示。
从上表看出，温度对蛋白酶活力有重要的影响。有了这些实验数据，可以根据实际情况，选择合适的温度与加热时间对腐乳发酵成熟的产品进行热处理，以钝化一部分或相当一部分酶的活力，使腐乳在较长的销售与贮藏过程中减少酪氨酸的生成量，从而有效控制了腐乳产品的酪氨酸结晶问题。同时，可以发现，腐乳发酵初步成熟或完全成熟后的短期时间里是没有“白斑”的，只有当放置2-3个月后才产生白斑。因此，选择发酵成熟后进行热处理，并控制酶失活率在60％-80％范围，使得余酶继续保持腐乳的后继发酵。该考虑是有益于腐乳产品的口感与质量的。腐乳装瓶后包装入箱发酵，当成熟后再延至一些时间，可在室内(密封)安装电热管升温加热，该办法实施较为简便，对每瓶腐乳成品来说，成本提高甚微，(也可以用蒸汽热等其他方法)虽然加热工艺也给生产带来多一道工序，但从产品质量和工厂效益看，增加该工序是很有必要的。
以下通过具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
孢子热处理时悬浮液中孢子含量106个/ml以上，将孢子菌悬液置于45度水浴中处理10分钟，可以筛选活力较强的孢子，这对选育腐乳毛霉耐高温菌株有很大的帮助，若需要，该操作还可以反复操作2-3次，具体做法是一次热处理后平板培养，制备孢子悬浮液二次热处理。筛选耐高温菌株还可以在培养过程逐步提高温度驯化培养。
筛选腐乳毛霉蛋白酶活力强且生长速度快的菌株，在分离腐乳毛霉单菌落和初筛时，都在培养基中添加0.4％酪蛋白和0.1％去氧胆酸钠制成平板，并在菌落形成，菌丝过分蔓延生长时，挑取透明圈大的单菌落斜面培养，分离平板添加去氧胆酸钠对毛霉菌丝的过分蔓延生长有抑制作用，而在平板中加入酪蛋白，可以初步检测其不同菌株的蛋白酶活力。
使用优化菌株生产腐乳，一般腌坯装瓶20～30天后发酵便成熟了。但为了使腐乳的鲜美风味更好，可将后发酵期延至一个月，而后将瓶装腐乳置于70～80度水浴处理1小时，或用60度以上热空气蒸汽热等方法处理半天至一天，该处理可使腐乳毛霉蛋白酶活力失活，其失活程度受处理温度、时间及介质传热等因素影响，一般腐乳成熟后以钝化60-80％酶活为准，腐乳后发酵成熟后，用热方法钝化腐乳毛霉蛋白酶活力，所采用的温度要使腐乳受热的温度达到50度以上，若温度在35-45度时会加速蛋白酶活性，从而生成更多的腐乳“白斑”。
实施例(1)制备孢子悬浮液将腐乳毛霉菌株移接于马玲薯斜面培养基，30度培养3天，在一支斜面中加入10ml无菌生理盐水，刮下孢子，倒入装有无菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶中振荡，后用四层灭菌纱布过滤，收集得滤液并控制孢子为5.6×106个/ml。
(2)孢子热处理和较耐高温腐乳毛霉菌株的分离吸取孢子悬浮液5ml置于15×15mm的无菌试管中，置于45度水浴中处理10分钟，即时冷却，稀释至10-3，取10-2，10-3稀释管0.1ml涂在分离平板上，30度培养1天后，挑取11株菌丝生长较快而密集的单菌落斜面培养，生长后转移斜面，逐步提高温度驯化培养筛选获得在34度下还生长良好的菌种5株，比原菌株最高生长良好的温度提高了约10％。
(3)酪蛋白平板初筛将5株单菌株连同原菌株分别接于三角瓶麸曲皮培养基中，30度培养4天，每个三角瓶加入100ml无菌水，捣碎培养物，在40度水浴中浸提1小时，后用滤纸过滤收集滤液，用10mm灭菌滤纸片浸泡麸曲浸提液1小时，取出滤片纸凉干，分别贴在酪蛋白平板上，每个样液重复4-6次，每个平板贴4-6块滤纸片，置40度下保温6小时，后测定透明圈直径，选取3株透明圈大的菌株进行蛋白酶活力测定。
(4)菌种复筛在单菌株蛋白酶活力测定中，3株透明圈大的菌株连同原菌株进行三角瓶麸皮培养，后同上法提取酶液，采用福林法测定中性蛋白酶，酸性蛋白酶和碱性蛋白酶活力，筛选得1株中性蛋白酶，酸性蛋白酶和碱性蛋白酶活力分别高于原菌株19.2％，30.8％和15％的腐乳毛酶优化菌株。
(5)腐乳发酵将优化的腐乳毛霉菌种接种于三角瓶麸皮培养基中30度培养2天，每瓶加入冷开水500ml浸泡半小时，振荡均匀后用无菌纱布过滤得到孢子接种液。大豆按常规法制备豆腐坯，并控制含水量为68-70％，切割后将孢子液喷雾于豆块上，室温下(26-30度)培养30小时，后用18波美度盐水腌坯24小时或直接用盐腌2-7天，取出后装瓶并加料液密封，室温下后发酵至一个月成熟。
(6)钝化腐乳毛霉蛋白酶活力①将发酵成熟的腐乳20瓶(每瓶400克)置于80度水浴中加热1小时，后自然冷却贮存，结果是腐乳已贮存近2年都不长“白斑”，从感官上看，组织块完整，淡黄色，口感好，风味美。
②将发酵成熟的腐乳40瓶(每瓶400克)置于培养箱中，用55-60度热空气处理1天，后自然冷却贮存，结果也同水浴法，长期保存，腐乳的品质良好。
③将发酵成熟的瓶装腐乳置于密闭贮藏间里，用电热管加热升温至55--60度处理1天，腐乳保藏1年都未长白斑。
从上述可知用热的方法在腐乳发酵成熟后将腐乳蛋白酶活性钝化或使其相当部分酶失活，是保证腐乳长期不长“白斑”，保证腐乳良好品质的有效措施。从实际结果而言，该方法遏制了腐乳“白斑”形成，又不影响腐乳的组织，颜色和风味，而成熟腐乳未采取热处理的样品在3-4个月贮藏期内生成“白斑”，至半年“白斑”已长得密密麻麻，感官极不好。该方法从生产应用看，要考虑到介质的传热，热分布均匀性等因素制定加热条件。采用热钝化发酵成熟的腐乳毛霉蛋白酶活，要使腐乳的温度达到50度以上，若温度太低，不能起到钝化酶活，抑制“白斑”生成的作用。
权利要求
1.抑制腐乳生成“白斑”的方法，包括优化腐乳毛霉菌株、后发酵工艺两步骤，其特征在于(1)优化腐乳毛霉菌株的方法腐乳毛霉菌株→制备孢子悬浮液→孢子热处理→单菌株分离→酪蛋白平板初筛→单菌株蛋白酶活力测定→腐乳毛霉优化菌株。(2)后发酵工艺腐乳毛霉试管斜面→麸曲三角瓶扩培→制备孢子悬浮液→接种豆腐坯上前发酵→腌坯→装瓶(加料液)后发酵→发酵成熟→水浴或电热钝化酶活性→进仓库或销售。
2.根据权利要求1的抑制腐乳生成“白斑”的方法，孢子热处理时悬浮液中孢子含量106个/ml以上，将孢子菌悬液置于45度水浴中处理10分钟，筛选活力较强的孢子。
3.根据权利要求1的抑制腐乳生成“白斑”的方法，筛选腐乳毛霉蛋白酶活力强且生长速度快的菌株，在分离腐乳毛霉单菌落和初筛时，都在培养基中添加0.4％酪蛋白和0.1％去氧胆酸钠制成平板，并在菌落形成，菌丝过分蔓延生长时，挑取透明圈大的单菌落斜面培养，平板添加去氧胆酸钠对毛霉菌丝的过分蔓延生长有抑制作用，而在平板中加入酪蛋白，初步检测其不同菌株的蛋白酶活力。
4.根据权利要求1的抑制腐乳生成“白斑”的方法，使用优化菌株生产腐乳，腌坯装瓶20-30天后发酵便成熟了，而后将包瓶装腐乳置于70～80度水浴处理1小时，或用60度以上热空气等方法处理半天至一天，该处理可使腐乳毛霉蛋白酶活力失活，其失活程度受处理温度、时间及介质传热等因素影响，一般腐乳成熟后以钝化60-80％酶活为准，腐乳后发酵成熟后，用热方法钝化腐乳毛霉蛋白酶活力，所采用的温度要使腐乳受热的温度达到50度以上，若温度在35-45度时会加速蛋白酶活性，从而生成更多的腐乳“白斑”。
全文摘要
本发明公开了一种抑制腐乳生成“白斑”的方法,其优化腐乳毛霉菌株为腐乳毛霉菌株→制备孢子悬浮液→孢子热处理→单菌株分离→酪蛋白平板初筛→单菌落菌株进行蛋白酶活力测定→腐乳毛霉优化菌株。后发酵工艺改进为腐乳毛霉试管菌株→麸曲三角瓶扩培→制备孢子悬浮液→接种豆腐坯上前发酵→腌坯→装瓶(加料液)后发酵→发酵成熟→水浴或电热等方法钝化酶活性→进仓库或销售。本发明使腐乳由常规下腐乳坯装瓶后3个月产生“白斑”延迟到一年甚至更长时间都不长“白斑”。
文档编号A23L1/20GK1254519SQ9911452
公开日2000年5月31日 申请日期1999年10月30日 优先权日1999年10月30日
发明者邱宏端, 郭养浩 申请人:福州大学