样品制备。
[0123] 将待测糖样品溶解于蒸馏水中（以便测量浊度，该水必须通过0.45WI1膜滤器进行 过滤）。可以使用以下浓度：
[0124] -在白糖的情况下，每50g蒸馏水使用50g样品（在室温下通过涡漩溶解该糖）；
[0125] -在较深色的糖的情况下，使用尽可能高的、与合理过滤速率和比色池深度一致的 浓度；
[0126] -在液体、浆液、以及汁液的情况下，稀释至50%固体或原始密度，除非需要稀释来 获得合理的过滤速率和比色池深度(或在优选的20 %-80 %透光度的范围）。建议将浆液稀 释至25±2°Br用于浊度测量(在澄清汁的情况下，不需要稀释）。
[0127] 对样品pH进行测量并记录至最接近的O.OlpH单位。应当考虑两个部分:一个体积 适用于测量浊度，以及另一个部分用于测量颜色。
[0128] 确定参数
[0129] 颜色测量
[0130]用0.1M盐酸或0.1M氢氧化钠(使用细滴管)将糖溶液的pH调节至7.0±0.1。将该溶 液通过膜滤器(孔径〇.45wn)进行过滤。将较慢的过滤的溶液用硅藻土（1%在糖团上)通过 滤纸进行过滤。如果使用硅藻土，那么该滤液的第一部分如果浑浊则将其废弃。在真空(在 室温下1小时）下或在超声波浴(3min)去除空气，须注意使蒸发最小化。在除气后，测量溶液 的密度和RDS。
[0131]使用过滤的蒸馏水作为零色的参考标准，在420nm下，确定溶液的吸光度(选择溶 液浓度和比色皿长度这样使得仪器读数会在〇. 2和0.8透光度之间。针对白糖的溶液，比色 皿长度应当尽可能的长）。
[0132]
[0133] IU-ICUMSA颜色。单位:IU7.o(ICUMSA颜色单位）；
[0134] A42Q-在420nm下的吸光度；
[0135] S-比色皿长度（cm);
[0136] RDS-溶液的折射干物质(° Brix)
[0137] p-溶液密度，（kg/m3);
[0138] 浊度测量。
[0139] 为了测量测试溶液的浊度（既没有过滤也没有pH调节的体积部分），必须选择 900nm的吸光度，然后使用以下表达式[3]，
[0140] 錢
[0141] 其中A9〇q =在900nm下的吸光度。
[0142] 参考文献
[0143] [1]ICUMSA书，参考文献：ICUMSA GSl/3-7(2011)，在pH 7.0下确定原糖、红糖和有 色浆液的溶液-官方。
[0144] [2]ICUMSA书，参考文献:ICUMSA GS2/3-10(2011)，确定白糖溶液颜色-官方。
[0145] [ 2 ] ICUMSA书，参考文献:ICUMSA GS7-21 (207)，确定澄清的甘蔗汁、浆液和澄清的 浆液中的浊度-已接受。
[0146] 实例1:本发明中使用的酶。
[0147] 本发明已使用代表性氧化还原酶的实例进行说明。
[0148] 以如以上所描述的G0DUF单位测量本发明的葡萄糖氧化酶(G0X)活性。
[0149] 来自黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶
[0150]葡萄糖氧化酶是由诺维信公司（Novozymes A/S)在商品名葡萄糖氧化酶单 10 ? 000BG(Gluzyme Mono 10 ? 000BG)下商业生产的（诺维信公司，鲍斯韦（Bagsvaerd)，丹 麦）。在实例1-7中使用的酶(SEQ ID N0:2)是从源自米曲霉的工业菌株的Gluzyme Mono的 纯化形式，在该米曲霉中引入了黑曲霉葡萄糖氧化酶基因（SEQ ID N0:1)。
[0151] 起始材料pH约为4.5并且电导率为20mS/cm。该起始材料还包含一些过氧化氢酶活 性。在纯化过程中，由于蛋白的视觉特性，该葡萄糖氧化酶可以容易与过氧化氢酶分离;葡 萄糖氧化酶是黄色并且过氧化氢酶是绿色。
[0152] 将冷冻的起始材料进行解冻，并且使用3M Tris-碱，在搅拌溶液的情况下，将该pH 调节至pH 5.0。为了减少溶液的导电率，将其在10kDa截留膜上进行超滤，并且用去离子水 进行洗涤，以达到〇 . 5mS/cm的导电率。将经透过洗涤的（diawashed)溶液施加至在20mM CH3C00H/Na0H(pH 5.0)中平衡的Q-sepharose FF柱（来自通用医疗集团（GE Healthcare)) 上。在将柱用平衡缓冲液洗涤之后，将柱用线性NaCl梯度(0-0.5M)洗脱超过3个柱体积。在 稀释过程中收集部分。汇集黄色部分，并且将固体(NH4) 2S〇4添加至最终的2.0M(NH4)2S〇4浓 度。将黄色汇集物施加至苯基琼脂糖FF高取代柱(来自通用医疗集团），所述柱用pH 6.0的 20mM琥珀酸/NaOH、2M(NH4)2S〇4平衡。在将柱用平衡缓冲液洗涤之后，将柱用线性(NH4) 2S〇4 梯度(2.0-0M)洗脱超过3个柱体积。在洗脱过程中收集部分，并且汇集亮黄色部分。为了减 少溶液的导电率，将其在10kDa截留膜上进行超滤，并且用去离子水进行透过洗涤，以达到 0.5mS/cm的导电率。在pH 6下，在 10kDa截留膜上，用20mM CH3C00H/Na0H、150mM NaCl彻底 洗涤葡萄糖氧化酶汇集物。产生的葡萄糖氧化酶是纯化的产品。纯化制剂的活性是 5360G0DUF/g并且过氧化氢酶活性低于检测极限(852CIU/g)。
[0153] 来自直立枝顶孢霉的碳水化合物氧化酶(COX)。
[0154] 直立帚枝霉(直立枝顶孢霉)葡萄寡糖氧化酶(AsC0x，SEQ ID N0:4)描述于"M.H. 李（Lee)，W.-L?赖（Lai)，S.-F?林（Lin)，C.-S?舒（Hsu)，S.-H?利奥（Liaw)，Y.-C?蔡（Tsai)， 应用与环境微生物（Appl.Environ.Microbiol.)，2005,71,8881-8887"（UNIPR0T:Q6PW77)。 编码AsCOX的多核苷酸在此被披露为SEQ ID N0:3。
[0155] 嗜热柱顶孢霉过氧化氢酶
[0156] 重组产生的嗜热柱顶孢霉过氧化氢酶描述于US 5,646,025中。该过氧化氢酶具有 220000CIU/g的典型活性。在pH 7.0和25°C下，1CIU将每分钟降解lwnol H2〇2,将H2〇2浓度从 10.3111]\1降至9.2111]\1。
[0157] 嗜热柱顶孢霉过氧化氢酶的商业制剂，Catazyme，获得自丹麦鲍斯韦的诺维信公 司。将50ml的制剂针对Mi 11 i-Q水进行透析，并且然后针对pH 7的10mM磷酸盐缓冲液进行透 析。将样品通过UF(10kDa截留）浓缩至10ml，通过0.45圓膜进行过滤。用pH 7的20mM磷酸盐 缓冲液，将51111的这种样品施用于11;[1^^(1(26/60)5即61(161 200柱上。汇集过氧化氢酶部分， 并且存储在冷冻机中。
[0158] 纤维二糖脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的克隆和表达
[0159] 遵循传统克隆方法，将编码所描述的脱氢酶(SEQ ID N0:6、8和10)的基因（SEQ ID 勵:5、7、和9)克隆到表达质粒?￡祖2516中（萨拉布鲁克（3&1111^〇〇1〇等人，分子克隆 ：实验室 手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港，1989)。质粒pENI2516描 述于W0 2004/069872实例2中。将质粒转化到米曲霉菌株ToC1512中用于酶表达，并且使用 标准方法进行发酵。米曲霉菌株ToC1512描述于W0 2005/070962实例11中。通过标准蛋白质 层析法纯化这些酶，这些层析法包括疏水作用层析和离子交换层析步骤。
[0160] 特异腐质霉纤维二糖脱氢酶，Hi⑶H(SEQ ID N0:6)的表达与纯化：
[0161] HiCDH的鉴定，酶的重组表达以及纯化描述于US 6,033,891和US 6,280,976中。
[0162] 嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶，Mt⑶H(SEQ ID N0:8)的表达与纯化：
[0163] MtCDH的克隆和表征描述于苏布拉马尼亚姆（Subramaniam)等人，1999中[不是完 全的参考]。表达该酶并且使用本领域已知的方法进行纯化。
[0164] 围小丛壳菌葡萄糖脱氢酶，GcGDH(SEQ ID从):10)的表达与纯化：
[0165] GcGDH的DNA序列报道于：西格蒙德（Sygmund)C.，克劳斯波格(Klausberger)M.，菲 利斯(Felice)A.K.，路德维格(Ludwig)R.;由来自围小丛壳菌的细胞外葡萄糖脱氢酶减少 醌和苯氧基自由基表明在植物致病性中的作用（Reduction of quinones and phenoxy radicals by extracellular glucose dehydrogenase from Glomerella cingulata suggests a role in plant pathogenicity.);微生物学（Microbiology)157: 3203-3212 (2011)。
[0166]用于克隆的DNA信息在EMBL数据库：（EMBL: JF731352)中是可获得的，并且蛋白质 序列在SWISSPR0T: G8E4B5下是可获得的。
[0167] 实例2:使用葡萄糖氧化酶用于处理甘蔗初级汁、混合甘蔗汁以及原糖溶液。
[0168] 化学品:助滤剂硅藻土、蒸馏水、盐酸、氢氧化钠获得自西格玛化学品。
[0169] 酶：描述于实例1中的实验葡萄糖氧化酶(G0X);来自实例1的柱顶孢霉过氧化氢 酶。
[0170] 膜滤器（PVDF，25mm直径，孔径0.45M1);玻璃纤维滤器，来自伯腾仪器有限公司 (Biotek)的酶标仪Eon。
[0171] 在以下条件下，将20G0DUF/mL添加至10ml的甘蔗初级汁、甘蔗混合汁和原糖溶液 (30°Bx)：
[0172] 将所有的管置于25RPM和40 °C下的旋转振荡器持续6小时。在沸水浴中通过热失活 持续15分钟终止酶反应，随后在冰浴中5min。
[0173] 对于倾析汁，将一半的样品（5ml)热处理以失活这些酶，而另一半不进行热处理。 然后，将这些试管在4000rpm下离心5min。测量倾析溶液的pH并且使用上清液的等分试样测 量最终颜色。将样品保持冷冻过夜直至第二天测量。
[0174] 在酶法处理的样品中确定颜色：
[0175] 该方法改编自ICUMSA方法（ICUMSA，参考文献：ICUMSA GS1/7,用于颜色测量的方 法)。
[0176]将样品稀释尽可能多的次数，以获得在20%至80%范围内的透光度。然后用稀释 的氢氧化钠和盐酸将pH调节至7.0 ± 0.1，并且然后通过0.45mi的PVDF滤膜进行过滤。
[0177] 使用300uL的溶液，在微孔板分光光度计的96孔平底板中，在420nm下，读取吸光 度。
[0178] 参考文献
[0179] ICUMSA，参考文献：ICUMSA GS1/7,用于颜色测量的方法。
[0180]赖因（REIN)，P.，鹿糖工程（Cane Sugar Engineering)，巴顿斯，第10版，柏林， 2007〇
[0181] 实例3:用黑曲霉葡萄糖氧化酶AnGOX从甘蔗汁中酶法去除颜色
[0182] 在本实例中，考虑源自压榨串联件的混合汁样品。因此，将1 %硅藻土助滤剂(CAS 68855-54-9;生产厂家：硅藻土智利S.A.-世界矿产硅藻土（CELITE CHILE S.A