30mL憐酸盐缓冲液(pH 7.0)，在20°C条件下振荡 浸提化，过滤得到粗酶液。
[0106] 步骤S、酶反应:称取lg(±lmg)粉状乌龙茶样品（过20目筛），加入30mL酶液W及 1 OmL水(对照茶样品加入30mL灭活酶液及IOmL水），振荡摇匀；70°C水浴下反应60min，反应 结束后沸水浴5min，过滤茶汤，并洗涂茶渣，定容至50mL。
[0107] 步骤四、茶样品中EGCG含量的检巧U:用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为 489.6mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
[010引对比实施例7:
[0109] 步骤一、制备23%茶叶梗培养基:每个250mL锥形瓶中加入茶叶梗(粉碎过20目筛） 3邑，盐溶液IOmL, 121°C高压蒸汽灭菌20min。盐溶液配制（％，w/w):氯化锭5.0、日-乳糖5.0、 屯水合硫酸儀0.1、憐酸二氨钟0.1、氯化钢0.1，加蒸馈水配制，调节pH 6.0。
[0110] 步骤二、发酵制备粗酶液:培养基冷却后接种2mL曲霉抱子悬液（IX IO8个/ml),在 30°C条件下培养4天，向培养基中加入30mL憐酸盐缓冲液(pH 7.0)，在20°C条件下震荡 18化pm浸提化，过滤去除菌体得到粗酶液。
[0111] 步骤S、酶反应：称取lg(±lmg)粉状乌龙茶样品（过20目筛），加入5mL酶液W及 35mL水(对照茶样品加入5mL灭活酶液及35mL水），振荡摇匀；10°C水浴下反应60min，后沸水 浴5min，然后过滤茶汤，并洗涂茶渣，定容至50mL。
[0112] 步骤四、茶样品中EGCG含量的检巧U:用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为 375.8mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
[0113] 对比实施例8:
[0114] 步骤一、制备33%茶叶梗培养基:每个250mL锥形瓶中加入茶叶梗(粉碎过20目筛） 5邑，盐溶液IOmL, 121°C高压蒸汽灭菌20min。盐溶液配制（％，w/w):氯化锭5.0、日-乳糖5.0、 屯水合硫酸儀0.1、憐酸二氨钟0.1、氯化钢0.1，加蒸馈水配制，调节pH 6.0。
[0115] 步骤二、发酵制备粗酶液:培养基冷却后接种2mL抱子悬液（IX IO8个/ml),在30°C 条件下连续培养4天，向培养基中加入30mL憐酸盐缓冲液(pH 7.0)，在20°C条件下(振荡速 度18化pm)浸提化，过滤去除菌体得到粗酶液。
[0116] 步骤S、酶反应:称取lg(±lmg)粉状乌龙茶样品（过20目筛），加入15mL酶液W及 25mL水(对照茶样品加入15mL灭活的酶液及25mL水），振荡摇匀；30°C水浴下反应60min，沸 水浴5min，然后过滤茶汤，并洗涂茶渣，定容至50mL。
[0117] 步骤四、茶样品中EGCG含量的检巧U:用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为 45.7mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
[011引对比实施例9:
[0119] 步骤一、制备41%茶叶梗培养基:每个250mL锥形瓶中加入茶叶梗(粉碎过20目筛） 7g，盐溶液IOmL，m°C高压蒸汽灭菌20min。其中，盐溶液配制（％，w/w):氯化锭5.0、日-乳糖 5.0、屯水合硫酸儀0.1、憐酸二氨钟0.1、氯化钢0.1，加蒸馈水配制，调节抑6.0。
[0120] 步骤二、发酵制备粗酶液:培养基冷却后接种2mL曲霉抱子悬液（IX IO8个/ml),在 30°C条件下培养4天，向培养基中加入30mL憐酸盐缓冲液(pH 7.0)，在20°C条件下振荡浸提 化，过滤去除菌体得到粗酶液。
[0121] 步骤S、酶反应:称取lg(±lmg)粉状乌龙茶样品（过20目筛），加入30mL酶液W及 1 OmL水(对照茶样品加入30mL灭活酶液及1 OmL水），振荡摇匀；70 °C水浴下反应60min，沸水 浴5min，然后过滤茶汤，并洗涂茶渣，定容至50mL。
[0122] 步骤四、茶样品中EGCG含量的检巧U:用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为 9.4mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
[0123] 如表1所示，为本发明实施例及对比实施例乌龙茶经不同发酵液处理后EGCG的含 量变化。
[0124] 表1乌龙茶经不同发酵液处理后EGCG的含量变化
[0126]本发明采用上述技术方案后，即用果胶、麦教和薦糖为碳源发酵制备的粗酶液处 理茶叶或者茶叶提取物，即可明显增加茶叶及其加工产品中EGCG含量，当然，本发明的果 胶、麦教、抽皮和薦糖等可W作为唯一碳源，也可W相互组合配制混合碳源。本发明不需要 复杂的设备，操作简便，工艺成本低。W上所述，仅为本发明实施例而已，故不能依此限定本 发明实施的范围，如果依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属 本发明涵盖的范围内。
【主权项】
1. 一种增加茶叶及其加工产品中EGCG含量的方法，其特征在于:包括以下步骤： 步骤一、培养基的制备:所述培养基按以下质量百分百的组分组成:0.5~70%的碳源， 0.05 %的氯化钾，0.01 %的七水合硫酸镁，0.1 %的柠檬酸三钠二水合物，0.1 %的无水柠檬 酸，0.1 %的酵母提取物，0.1 %的干酪素水解物，用1M的HC1把pH调到4.0;每个250mL锥形瓶 中加入25mL培养基，121°C高压蒸汽灭菌20min; 步骤二、发酵制备酶液:培养基冷却后接种曲霉孢子悬液，所述孢子悬液孢子含量为1 X 108个/ml，在30°C条件下培养4~6天，提取酶液;对于液态发酵，发酵液直接过滤去除菌 体即可得到粗酶液;对于固体培养基，发酵后向培养基中加入pH 7.0的磷酸盐缓冲液，在20 °C条件下，振荡速度180rpm浸提lh，过滤去除菌体得到粗酶液； 步骤三、用酶处理茶叶或者茶叶提取物：向茶叶或者茶叶提取物中加入所述酶液，在固 水比为1:5~1:30，温度10 °C~70 °C下进行酶反应； 步骤四、测定EGCG含量变化:采用液相色谱-质谱联用仪测定茶样品中EGCG的含量；其 中，色谱柱Nucleodur PFP规格为250 X 4.6mm;柱温35 °C ;流动相A: 0.1 %甲酸水溶液;流动 相B: 0.1 %甲酸乙腈溶液，洗脱梯度：0-lmin，95%A和5%的B，l-6min，85%A和15%的16_ 20min，70 % A和30 % 的B，20-25min，95 %A和5 % 的B;进样量5. OyL，色谱流速0.5ml/min;质 谱所用的离子源为Agilent Jet Stream ESI，负离子模式采集;干燥气温度300°C，干燥气 流速101/min，雾化气压力45psi，鞘气温度350°C，鞘气流速121/min，毛细管电压3000V，喷 嘴电压500V。2. 如权利要求1所述的一种增加茶叶及其加工产品中EGCG含量的方法，其特征在于:所 述碳源为果胶，所述果胶的质量百分含量为〇. 5 %~2 %。3. 如权利要求1所述的一种增加茶叶及其加工产品中EGCG含量的方法，其特征在于:所 述碳源为麦麸，所述麦麸的质量百分含量为2%~70%。4. 如权利要求1所述的一种增加茶叶及其加工产品中EGCG含量的方法，其特征在于:所 述碳源为蔗糖，所述蔗糖的质量百分含量为1 %~4%。
【专利摘要】本发明公开了一种增加茶叶及其加工产品中EGCG含量的方法，包括以下步骤：步骤一、培养基的制备；步骤二、发酵制备酶液：培养基冷却后接种曲霉孢子悬液，在30℃条件下培养4～6天，提取酶液；对于液态发酵，发酵液直接过滤去除菌体即可得到粗酶液；对于固体培养基，发酵后向培养基中加入pH7.0的磷酸盐缓冲液，在20℃条件下，振荡速度180rpm浸提1h，过滤去除菌体得到粗酶液；步骤三、用酶处理茶叶或者茶叶提取物：向茶叶或者茶叶提取物中加入所述酶液，在固水比为1:5～1:30，温度10℃～70℃下进行酶反应；步骤四、测定EGCG含量变化。采用本发明后，茶叶或茶叶提取物中的EGCG含量大幅度提高。
【IPC分类】A23F3/16, A23F3/06
【公开号】CN105660892
【申请号】CN201610027879
【发明人】倪辉, 张珍珍, 黄高凌, 李红, 陈艳红, 伍菱, 杨远帆, 胡阳, 肖安风, 李利君, 蔡慧农
【申请人】集美大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月15日